黏質(zhì)沙雷菌非特異性核酸內(nèi)切酶通用型定量檢測方法的建立及驗證

畢華，朱香，盧寧，牛林茹，楊凌，張曉峰，周勇，梁雅麗

1.中國食品藥品檢定研究院重組藥物室，北京 100050；2.山西省生物研究院有限公司，山西 太原 030000；3.山西集創(chuàng)生物科技有限公司，山西 太原 030000；4.君研生物科技（山西）有限公司，山西 太原 030000

黏質(zhì)沙雷菌（Serratia marcescens）Benzonase?核酸內(nèi)切酶（Serratia marcescensBenzonase?endonuclease，SMBE）為黏質(zhì)沙雷菌非特異性核酸內(nèi)切酶，可降解各種形式的核酸［1-3］，多用于生物制品中核酸的去除［4-5］。該酶對宿主細胞具有毒性，可導致多種臨床不良反應的發(fā)生［6-7］。在溶瘤腺病毒及腺病毒相關(guān)產(chǎn)品質(zhì)量控制中，規(guī)定殘留SMBE應不高于1 ng／支［8-9］。目前，采用qPCR法（檢測范圍≥1.5 ng／mL）或ELISA法（檢測范圍≤1 ng／mL）可定量檢測SMBE 殘留量，與qPCR 法比較，ELISA 法的靈敏度較高。目前，市場上常規(guī)ELISA 檢測試劑盒中的抗原均為含有完整氨基酸序列的SMBE，僅能用于檢測1～2 種使用SMBE 的產(chǎn)品，為非通用型檢測試劑盒，無法滿足市場需求。同時，完整氨基酸序列的SMBE 有酶活性，對免疫系統(tǒng)有毒性作用，可導致機體免疫抑制或免疫刺激、過敏反應及自身免疫反應，對機體存在潛在危害，不適合用于免疫［10-11］。

據(jù)報道，將SMBE 第110 位組氨酸突變?yōu)楸彼幔稍诓桓淖僑MBE 蛋白結(jié)構(gòu)的同時降低其酶活性［12］。本研究通過制備突變體SMBE 蛋白，并以其為抗原免疫家兔，制備包被及檢測抗體，建立SMBE通用型定量ELISA檢測方法，以期用于多種不同SMBE產(chǎn)品殘留的定量檢測，滿足市場需求。

1 材料與方法

1.1 基因、載體及菌株 根據(jù)文獻［5，12-13］方法，由武漢擎科生物科技有限公司合成SMBE第110位組氨酸突變?yōu)楸彼岬耐蛔凅wSMBE基因BEHA；載體pET-20b（+）購自武漢擎科生物科技有限公司；E.coliBL21（DE3）pLysS購自北京百奧萊博科技有限公司；感受態(tài)E.coliDH5α由山西生物研究院有限公司提供。

1.2 樣品 SMBE 分別購自杭州俊豐生物工程有限公司（JUNFENG）、自翌圣生物科技（上海）有限公司（YEASEN）及德國Merck公司（分別為樣品1、2、3）。

1.3 主要試劑及儀器 NcoⅠ、HindⅢ及T4 DNA 連接酶購自美國NEB 公司；質(zhì)粒小提試劑盒Plasmid Mini KitI（100）購自美國OMEGA公司；LB培養(yǎng)基由山西生物研究院有限公司提供；IPTG 及鮭魚精DNA 購自北京索萊寶生物科技有限公司；Ni-NTA 瓊脂糖純化樹脂和層析重力柱（柱體積2 mL）購自生工生物工程（上海）股份有限公司；抗體標記試劑盒購自同仁化學研究所；用于比較的SMBE定量檢測試劑盒為市售產(chǎn)品；SMBE 標準品和SMBE 蛋白（純度＞95%）均由山西集創(chuàng)生物科技有限公司提供，并由該公司完成蛋白濃度和酶活測定及標準品的溯源。

1.4 目的基因擴增 根據(jù)NCBI 中登錄的SMBE基因（M19495.1）序列，應用Primer-Blast 軟件設(shè)計引物，上游引物：5′-CATGCCATGGATCATCACCATCACCATCACGACACGCTCGAATCCATCGAC-3′（下劃線部分為NcoⅠ酶切位點，斜體部分為6 個組氨酸標簽序列），下游引物：5′-CCCAAGCTTTCAGTTTTTGCAGCCCATCAACT-3′（下劃線部分為HindⅢ酶切位點），擴增產(chǎn)物大小為1 019 bp。以突變體SMBEBEHA基因為模板進行PCR 擴增。PCR 反應條件為：98 ℃預變性30 s；98 ℃10 s，57 ℃30 s，72 ℃1 min，共30 個循環(huán)；72 ℃再延伸2 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.5 重組表達質(zhì)粒的構(gòu)建 將載體pET-20b（+）及PCR 產(chǎn)物均經(jīng)NcoⅠ及HindⅢ雙酶切后，回收載體及目的基因片段，以T4 DNA 連接酶于16 ℃連接過夜；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coliDH5α，涂布于含100 μg／mL 氨芐青霉素的LB 瓊脂平板，37 ℃培養(yǎng)過夜；挑取12 個單菌落（1～12 號）進行菌落PCR 檢測，將鑒定正確的單個菌落送北京擎科生物技術(shù)有限公司測序，測序正確的即為陽性克隆菌株。用Plasmid Mini KitI（100）提取陽性克隆菌株的質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coliBL21（DE3）pLysS，涂布于含50 μg／mL氨芐青霉素及34 μg／mL 氯霉素的LB 瓊脂平板，37 ℃培養(yǎng)過夜；獲得BEHA 工程菌株，加入50%甘油，于-80 ℃保存。

1.6 BEHA 的表達及純化 挑取BEHA 工程菌株單菌落，接種至20 mL 含50 μg／mL 氨芐青霉素和34 μg／mL氯霉素的LB 培養(yǎng)基，于37 ℃，210 r／min搖床培養(yǎng)過夜；按1∶100 的比例轉(zhuǎn)接至100 mL 含50 μg／mL 氨芐青霉素和34 μg／mL 氯霉素的LB 培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)3 ～4 h；待A600為1.0 ～1.2時，加入IPTG至終濃度1 mmol／L，于25 ℃誘導16 h；10 000×g離心15 min，收集上清。采用Ni-NTA 瓊脂糖純化樹脂親和層析重力柱（柱體積2 mL）進行一步純化，純化產(chǎn)物經(jīng)15%SDS-PAGE和分光光度計分析。

1.7 BEHA 酶活性的檢測 用分析液（50 mmol／L Tris-HCl，5 mmol／L MgCl2，pH 8.0）將10 mg／mL 的鮭魚精DNA 稀釋至48、24 和12 μg／mL，加入純化的BEHA（250 ng），同時設(shè)陽性對照（250 ng純度＞95%的SMBE 蛋白與48 μg／mL 鮭魚精DNA 作用）及空白對照（不加BEHA，僅加各濃度的鮭魚精DNA），于37 ℃水浴30 min，進行1%瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.8 包被抗體及檢測抗體的制備 委托南京金斯瑞生物科技有限公司制備的BEHA 為抗原，免疫家兔，制備BEHA 多克隆抗體，檢測抗體效價（高于1∶5×104），作為包被抗體。以用抗體標記試劑盒標記HRP的BEHA多克隆抗體作為檢測抗體。

1.9 SMBE 雙抗體夾心ELISA 檢測方法的建立 用包被緩沖液（0.05 mol／L 碳酸鹽緩沖液，pH 9.6）將包被抗體稀釋至終濃度為2 μg／mL，加入96 孔板，100 μL／孔，4 ℃包被過夜；用洗滌緩沖液（0.15 mol／L PBS，0.05%Tween-20，pH 7.4）洗滌3 次，加入封閉液（0.15 mol／L PBS，0.5%酪蛋白，0.05%Tween-20，pH 7.4），200 μL／孔，室溫放置1.5 h；洗滌緩沖液洗滌3 次，加入SMBE 標準品或待檢樣品，100 μL／孔，37 ℃孵育0.5 h；洗滌緩沖液洗滌3次，加入BEHA 檢測抗體（1∶40 000 稀釋），100 μL／孔，于37 ℃反應0.5 h；洗滌液洗滌3次，加入顯色液，37 ℃作用15 min；加入2 mol／L H2SO4，100 μL／孔，終止反應，用酶標儀檢測A450。

1.10 方法的驗證

1.10.1 線性范圍 用稀釋液（0.15 mol／L PBS，0.05%Tween-20，0. 5% BSA，pH 7. 4）將SMBE 標準品稀釋為20、8、3.2、1.28、0.51、0.20、0 ng／mL，按1.9 項方法檢測，每個濃度設(shè)2個復孔，以2孔的平均A450減去空白孔的A450作為矯正值。以SMBE 標準品的A450為因變量Y，標準品濃度為自變量X建立曲線四參數(shù)Logisitic數(shù)學模型擬合。至少重復測定3次。

1.10.2 準確度 用稀釋液將SMBE 標準品稀釋為16、10、0.6 ng／mL，按1.9 項方法檢測，重復測定3次，取平均值，并按下式計算測量偏差，即準確度。

測量偏差（%）=（平均值-理論值）／理論值×100%

1.10.3 精密性 用稀釋液將SMBE標準品稀釋為12和2 ng／mL，按1.9項方法重復檢測10次，計算檢測結(jié)果的平均值（M）、標準差（SD），并按下式計算變異系數(shù)（CV）。

CV（%）=SD／M×100%

1.10.4 定量限 用稀釋液將SMBE 標準品稀釋為0.2 ng／mL，按1.9 項方法重復檢測10 次，計算檢測結(jié)果的M、SD，并計算CV。

1.11 與其他檢測方法的比較 采用本研究建立的雙抗體夾心ELISA 法及市售SMBE 定量檢測試劑盒分別檢測樣品1（2 ng／mL）、樣品2（3 ng／mL）及樣品3（1.5 ng／mL），重復檢測3次。

2 結(jié) 果

2.1 目的基因擴增產(chǎn)物的鑒定BEHA基因PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，可見1 019 bp 的目的基因條帶，大小與預期一致，見圖1。

圖1 BEHA基因PCR 產(chǎn)物電泳圖Fig.1 Electrophoretic profile of PCR product of BEHA gene

2.2 重組表達質(zhì)粒的鑒定 菌落PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，1、2、4～12號單菌落可見1 019 bp的目的條帶，大小與預期一致，見圖2。測序結(jié)果表明，5號單菌落為陽性克隆菌株。將該測序結(jié)果與原始基因序列比較，除第110 位組氨酸突變?yōu)楸彼岬南鄳蛐蛄邪l(fā)生改變外，其他序列完全一致，見圖3。上述結(jié)果表明，重組表達質(zhì)粒構(gòu)建正確。

圖2 菌落PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.2 Electrophoretic profile of colony PCR products

圖3 BEHA基因序列分析Fig.3 Analysis of BEHA gene sequence

2.3 BEHA 純化產(chǎn)物的鑒定 BEHA 純化產(chǎn)物相對分子質(zhì)量約30 000，純度達95%以上，見圖4。純化產(chǎn)物表達量為3 mg／100 mL。

圖4 BEHA純化產(chǎn)物的SDS-PAGE分析Fig.4 SDS-PAGE analysis of purified BEHA

2.4 BEHA 的酶活性 與空白對照比較，SMBE 可完全消化48 μg／mL 的鮭魚精DNA，BEHA 消化48、24 和12 μg／mL 鮭魚精DNA 的效果較差，見圖5。表明與SMBE 酶活性比較，BEHA 酶活性大幅降低。

圖5 BEHA酶活性測定電泳圖Fig.5 Electrophoretic profile of BEHA enzyme activity

2.5 方法的驗證

2.5.1 線性范圍 SMBE 標準曲線見圖6。SMBE 標準品在0 ～20.00 ng／mL范圍內(nèi)與A450呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為Y=（5.392 77 - 0.035 39）／［1 +（X／28.095 32）-1.16658）］+0.035 39，R2=1.000。

圖6 SMBE的標準曲線Fig.6 Standard curve of SMBE

2.5.2 準確度 16、10、0.6 ng／mL 的SMBE 標準品重復檢測3次的偏差分別為-3.06%、-5.40%、3.33%，見表1。表明該方法具有良好的準確度。

表1 準確度驗證結(jié)果Tab.1 Verification of accuracy

2.5.3 精密性 12 和2 ng／mL 的SMBE 標準品重復10 次檢測結(jié)果的M分別為12. 49 和2. 06 ng／mL，SD分別為0. 31 和0. 06 ng／mL，CV分別為2.48%和2.91%。表明該方法具有良好的精密性。

2.5.4 定量限 0.2 ng／mL 的SMBE 標準品重復檢測10 次的M為0.21 ng／mL，SD為0.02 ng／mL，CV為9.52%，測量偏差為5.00%。確定定量限為0.2 ng／mL。

2.6 與其他檢測試劑盒的比較 本研究建立的方法檢測樣品1、2 和3 的結(jié)果分別為1.92、2.93 和1.46 ng／mL，市售試劑盒檢測樣品1、2 和3 的結(jié)果分別為0.08、0.00 和1.57 ng／mL。本研究建立方法的檢測結(jié)果更接近樣品理論值，表明該方法可定量檢測多種市售SMBE 產(chǎn)品，是一種SMBE 通用型定量檢測方法。

3 討 論

SMBE作為核酸消化劑廣泛應用于生物制品，其殘留需嚴格控制。有研究表明，以病毒為載體相關(guān)產(chǎn)品的生產(chǎn)工藝流程中加入SMBE 能有效去除宿主DNA 殘留如宮頸癌疫苗GARDASIL 的工藝流程中使用SMBE 處理病毒顆粒（4 ℃過夜），可有效控制終端產(chǎn)品中宿主DNA 殘留量［2，4，14-15］；Canji、Bioreliance、Introgen 及Puresyn 公司在腺病毒生產(chǎn)過程中也加入SMBE 用于腺病毒產(chǎn)品核酸去除［8］?！渡锛夹g(shù)藥物研究開發(fā)和質(zhì)量控制》“非復制型病毒載體類基因治療藥物”章節(jié)中提到在重組腺病毒產(chǎn)品生產(chǎn)工藝中用SMBE去除重組腺病毒產(chǎn)品中的核酸，且在重組人p53腺病毒注射液及溶瘤腺病毒產(chǎn)品（SG600-P53）質(zhì)量控制中明確規(guī)定，SMBE 殘留應不高于1 ng／支［9］。SMBE 可消化各種類型的核酸，具有一定毒性，可損害動物免疫系統(tǒng)，產(chǎn)生免疫毒性，影響抗原免疫效果，使收獲的抗體質(zhì)量差，不能作為ELISA 檢測中的包被及檢測抗體［16-18］。另有研究表明，蛋白質(zhì)變性后，構(gòu)象及其表面的抗原決定簇也會隨之改變［19-23］，免疫動物獲得的抗體也不能作為ELISA 檢測所需抗體。因此，需在確保重組蛋白在不改變SMBE 構(gòu)象的前提下降低其酶活性，才可作為抗原免疫動物，制備高質(zhì)量的抗體。

本研究構(gòu)建了BEHA 重組表達質(zhì)粒，經(jīng)菌落PCR 鑒定構(gòu)建正確，且測序結(jié)果表明，其第110 位組氨酸已成功突變?yōu)楸彼?。將BEHA 重組表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coliBL21（DE3）pLysS，IPTG誘導表達BEHA，通過一步Ni-NTA 瓊脂糖純化樹脂純化，獲得的純化產(chǎn)物純度＞95%，且酶活性大幅降低，產(chǎn)量高達3 mg／100 mL。上述結(jié)果表明，純化BEHA 可用于免疫動物制備抗體。以純化BEHA 作為抗原，委托南京金斯瑞生物科技有限公司通過免疫家兔制備包被抗體及檢測抗體，成功建立SMBE 雙抗體夾心ELISA 法。SMBE 標準品濃度在0～20 ng／mL 范圍內(nèi)與A450呈良好的線性關(guān)系，R2= 1.000；SMBE 標準品濃度為16、10、0.6 ng／mL 的測量偏差分別為-3.06%、-5.40%、3.33%；SMBE 標準品濃度為12 和2 ng／mL 的精密性CV分別為2.48%和2.91%。表明建立的方法具有良好的準確度和精密性，方法檢測下限為0.2 ng／mL。與市售同類產(chǎn)品比較，本研究建立方法的檢測結(jié)果更接近理論值，表明這是一種SMBE 通用型定量檢測方法，可用于不同產(chǎn)家相關(guān)生物制品工藝質(zhì)量的控制，滿足市場需求。