產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素β1的原核表達(dá)及其抗體間接ELISA檢測(cè)方法的建立

馬玲玲，馬紅梅，吳霜，王東，李勇，馬臣杰，曾瑾

1．寧夏大學(xué)西部特色生物資源保護(hù)與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，寧夏 銀川 750021；2．寧夏大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，寧夏 銀川 750021

產(chǎn)氣莢膜梭菌（Clostridium perfringens，C.p.）又稱魏氏梭菌，是一種革蘭陽(yáng)性厭氧芽孢形成菌，廣泛分布于自然界，特別是土壤和人類、動(dòng)物的腸道［1］，感染者血管中會(huì)出現(xiàn)氣泡，該性狀與壞疽性氣體的感染癥狀相似［2］。該菌可引起人類食物中毒及動(dòng)物的膿毒血癥、壞死性腸炎、氣性壞疽等疾?。?-4］，給人類健康和畜牧養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴(yán)重威脅。據(jù)美國(guó)疾病控制與預(yù)防中心（Centers for Disease Control and Prevention，CDC）統(tǒng)計(jì)，C.p.病是美國(guó)第二大常見食源性疾病，占總發(fā)病率的26%［5］。我國(guó)也有關(guān)于C.p.感染的報(bào)道，2016年，北京市順義區(qū)暴發(fā)1 起由C 型C.p.毒素導(dǎo)致的食物中毒事件［6］；2015年，對(duì)我國(guó)4 個(gè)省份的907 份豬糞便樣本進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)豬場(chǎng)普遍攜帶C. p.，母豬感染比例達(dá)75%，哺乳仔豬感染達(dá)80%［7］。

C.p.是一種條件致病菌，當(dāng)外界環(huán)境或寄主環(huán)境適合其大量增殖，并分泌毒素時(shí)可導(dǎo)致疾病［8］，C.p.致病因子主要是其產(chǎn)生的外毒素及胞外水解酶。目前，已知C.p.分泌23 種外毒素或酶類［9］，其中α、β、ε、ι 為主要致死毒素，根據(jù)這4 種主要毒素，可將C.p.分為A、B、C、D、E 共5 種血清型。C.p.β1毒素（Clostridium perfringensBeta1 toxin，CPB1）是B和C 型菌株產(chǎn)生的一種成孔毒素，相對(duì)分子質(zhì)量約34 000，等電點(diǎn)為5.6，以多聚體形式存在［10］，該毒素具有細(xì)胞毒性和神經(jīng)毒性，可引起人和動(dòng)物的壞死性腸炎。因此，早期檢測(cè)C.p感染對(duì)相關(guān)疾病的預(yù)防和篩查尤為重要。目前，主要檢測(cè)方法包括微生物分離培養(yǎng)鑒定法、普通PCR 法、實(shí)時(shí)熒光定量PCR法、ELISA 法和環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法等［11］。其中，普通PCR 檢測(cè)法僅能進(jìn)行定性檢測(cè)，不能檢測(cè)毒素基因的表達(dá)及分泌情況，還具有易出現(xiàn)假陽(yáng)性、工作繁瑣、周期長(zhǎng)及不適用大批量檢測(cè)等缺點(diǎn)；ELISA 法特異性及靈敏性高，易于操作，檢測(cè)速度快，適用大量樣品檢測(cè)，廣泛應(yīng)用于臨床疾病檢測(cè)及實(shí)驗(yàn)室病原研究。本研究采用原核表達(dá)系統(tǒng)重組表達(dá)CPB1，以其為包被抗原建立檢測(cè)CPB1 抗體的間接ELISA 法，并對(duì)CPB1的包被濃度、一抗稀釋度、封閉條件、二抗稀釋度等檢測(cè)條件進(jìn)行優(yōu)化，同時(shí)確定方法的臨界值，驗(yàn)證特異性、靈敏度、重復(fù)性，以期用于C.p.感染臨床血清樣品的檢測(cè)和相應(yīng)疫苗免疫效果的評(píng)價(jià)。

1 材料與方法

1.1 菌株、載體及細(xì)胞 感受態(tài)E.coliBL21（DE3）購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；載體pET32a、C.p.A型菌（ATCC 3624和57-1）、C.p.B型菌（58-2）、C.p.C型菌（59-2和59-44）的培養(yǎng)液和E.coli（C83529、C83905、C83684、C83922、C14208）、單核細(xì)胞增生李斯特菌（ATCC19115）、沙門菌（CMCC50115）、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、藤黃微球菌的培養(yǎng)物均由寧夏大學(xué)西部特色生物資源保護(hù)與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室制備；CPB1雜交瘤細(xì)胞株1K19及21株CPB2雜交瘤細(xì)胞株均由艾比瑪特醫(yī)藥科技（上海）有限公司制備。

1.2 血清 201 份牛血清樣品采自寧夏某牛場(chǎng)；感染C.p.的2 份小鼠陽(yáng)性血清及2 份免疫生理鹽水的小鼠陰性血清均由寧夏大學(xué)西部特色生物資源保護(hù)與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室制備。

1.3 主要試劑及儀器 限制性核酸內(nèi)切酶NcoⅠ、EcoRⅠ、HindⅢ及T4 DNA連接酶購(gòu)自英國(guó)New England Biolabs公司；胰蛋白胨、酵母粉及腦心浸液培養(yǎng)基購(gòu)自英國(guó)OXOID公司；彩色預(yù)染蛋白marker（26616）購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher 公司；5×SDS-Tris-甘氨酸緩沖液購(gòu)自上海百賽生物技術(shù)有限公司；瓊脂糖（AGAROSE）購(gòu)自法國(guó)BIOWEST 公司；IPTG、牛血清白蛋白及Tween20購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；膠回收試劑盒及質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自美國(guó)AxyGen 公司；GelRed購(gòu)自美國(guó)Biotium 公司；氨芐青霉素及卡那霉素購(gòu)自美國(guó)USBIOANALYZED 公司；20×PBS Buffer及瓊脂粉（Agar）購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司；脫脂奶粉購(gòu)自美國(guó)BD Difco 公司；HRP 標(biāo)記的羊抗鼠IgG北京中杉金橋生物有限公司；液體硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限公司；快速封閉液購(gòu)自新賽美生物科技有限公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自北京莊盟國(guó)際生物基因科技有限公司；兔抗牛IgG 購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；鼠單克隆抗體亞型鑒定試劑盒購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；胎牛血清及RPMI1640培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司；AKTA 純化系統(tǒng)及Protein G 均購(gòu)自思拓凡科技有限公司；其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.4 目的基因的擴(kuò)增根據(jù)GenBank 中登錄的cpb1基因序列（X83275.1），應(yīng)用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)引物，F(xiàn)orward：5′-CGCCATGGCTAATGATATAGGCAAAACTACTACTAT-3′，Reverse：5′-GAATGAATTCAATAGCTGTTACTTTATG-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為930 bp。引物由金斯瑞生物科技有限公司合成。以C 型C. p.的59-2 基因組為模板擴(kuò)增cpb1基因，PCR反應(yīng)條件為：94 ℃5 min；94 ℃30 s，56 ℃45 s，72 ℃45 s，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃5 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.5 重組質(zhì)粒的構(gòu)建 膠回收PCR產(chǎn)物，與載體pET-32a均經(jīng)NcoⅠ及EcoRⅠ雙酶切，回收目的基因和載體片段，以T4 DNA 連接酶于4 ℃連接過夜；連接產(chǎn)物涂布于含100 μg／mL 氨芐青霉素的LB 固體培養(yǎng)基，于37 ℃培養(yǎng)過夜；挑取單克隆，分別進(jìn)行單酶切（EcoRⅠ）、雙酶切（NcoⅠ和EcoRⅠ）和三酶切（NcoⅠ、HindⅢ和EcoRⅠ）鑒定，陽(yáng)性克隆送金斯瑞生物科技公司測(cè)序。將鑒定正確的質(zhì)粒命名為pET32a-cpb1。

1.6 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá) 將鑒定正確的重組質(zhì)粒pET32a-cpb1轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coliBL21（DE3），于37 ℃培養(yǎng)12 h；挑取陽(yáng)性單菌落進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，加入IPTG至終濃度0.1 mml／L，20℃誘導(dǎo)3 h；收集菌體，7 104×g離心5 min，PBS重懸沉淀，超聲破碎，分別取上清和沉淀，進(jìn)行12%SDS-PAGE 分析，同時(shí)設(shè)空載體和未誘導(dǎo)表達(dá)作為對(duì)照，BCA法測(cè)定蛋白濃度。

1.7 McAb 1K19的制備及純化 將雜交瘤細(xì)胞株1K19于37 ℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期進(jìn)行傳代，繼續(xù)培養(yǎng)至過度生長(zhǎng)以富集抗體，約5 d后，待培養(yǎng)液變酸（變黃色）后，取細(xì)胞培養(yǎng)液，1 500×g離心10 min，收集上清，按1∶100稀釋，采用鼠單克隆抗體亞型鑒定試劑盒檢測(cè)McAb 1K19 亞型。上清經(jīng)0.22 μm 濾膜過濾除菌。采用AKTA 純化系統(tǒng)經(jīng)Protein G純化McAb 1K19，用0.1 mol／L Glycine-HCl（pH 2.7）緩沖液洗脫，進(jìn)行12%SDS-PAGE分析。

1.8 方法的建立 用重組蛋白CPB1 包被96 孔板，100 μL／孔，4 ℃包被過夜；PBST洗滌液（含2‰Tween20的PBS）洗滌3次，每次5 min，用5%脫脂奶粉進(jìn)行封閉；PBST洗滌3次，每次5 min，加入待檢樣品，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照（PBS）及陰性對(duì)照（CPB2 單克隆抗體），100 μL／孔，37 ℃孵育1 h；PBST洗滌3次，每次5 min，加入HRP 標(biāo)記的羊抗鼠IgG，100 μL／孔，37 ℃孵育30 min；PBST 洗滌3次，每次5 min，加入OPD顯色液，50 μL／孔，用2 mol／L H2SO4溶液終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀測(cè)定A450。

1.9 方法的優(yōu)化

1.9.1 抗原包被濃度及抗體稀釋度的確定 將重組蛋白CPB1用包被緩沖液（NaCO31.59 g，NaHCO32.93 g，ddH2O 100 mL，pH 9.6）稀釋為2、5、8、10 μg／mL，包被96 孔板；用5%脫脂奶粉于37 ℃封閉30 min；以McAb 1K19作為一抗，用包被緩沖液分別進(jìn)行1∶256、1∶512、1∶1 024、1∶2 048、1∶4 096、1∶8 192、1∶16 384 稀釋，加入96 孔板；加入HRP 標(biāo)記的羊抗鼠IgG（1∶2 000稀釋）；其他步驟同1.8項(xiàng)。

1.9.2 二抗稀釋度的確定 用最佳抗原包被濃度的重組蛋白CPB1包被96孔板，用5%脫脂奶粉于37 ℃封閉30 min；加入最佳稀釋度的McAb 1K19；將HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG按1∶1 000、1∶2 000、1∶4 000、1∶8 000 進(jìn)行梯度稀釋，加入96 孔板；其他步驟同1.8項(xiàng)。

1.9.3 封閉時(shí)間的確定 用最佳抗原包被量包被96孔板，以5%脫脂奶粉為封閉液，分別孵育30、60、90和120 min；加入HRP 標(biāo)記的羊抗鼠IgG（1∶2 000 稀釋）；其他步驟同1.8項(xiàng)。

1.10 臨界值的確定 采用建立方法檢測(cè)21 株陰性抗體（21 株CPB2 雜交瘤細(xì)胞株），計(jì)算樣品的A450平均值（）和標(biāo)準(zhǔn)方差（SD），當(dāng)A450≥+3SD時(shí)，判定為陽(yáng)性；A450≤+ 2SD時(shí)，判定為陰性，介于二者之間時(shí)，判為疑似。

1.11 方法的驗(yàn)證

1.11.1 特異性 分別以C.p.A 型菌（ATCC 3624 和57-1）、C.p.B型菌（58-2）、C.p.C型菌（59-2和59-44）的培養(yǎng)液和E.coli（C83529、C83905、C83684、C83922、C14208）、單核細(xì)胞增生李斯特菌（ATCC19115）、沙門菌（CMCC50115）、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、藤黃微球菌的菌體培養(yǎng)物包被抗原，以McAb 1K19作為一抗，PBS為空白對(duì)照，CPB2單克隆抗體為陰性對(duì)照，對(duì)McAb 1K19進(jìn)行特異性檢測(cè)，通過臨界值判定其特異性。

1.11.2 靈敏度 將McAb 1K19 按1∶256、1∶512、1∶1 024、1∶2 048、1∶4 096、1∶8 192、1∶16 384、1∶32 768 稀釋，采用建立的方法進(jìn)行檢測(cè)，以臨界值為判定依據(jù)，A450對(duì)應(yīng)的最大稀釋倍數(shù)為該方法的靈敏度。

1.11.3 精密性 制備4 批重組蛋白CPB1，取同批重組蛋白CPB1，采用建立的方法對(duì)McAb 1K19 重復(fù)檢測(cè)4 次，計(jì)算變異系數(shù)（CV）；取4 批重組蛋白CPB1，采用建立的方法對(duì)McAb 1K19 進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算CV。

1.12 方法的應(yīng)用 采用建立的方法檢測(cè)201 份正常牛血清及陽(yáng)性小鼠血清和陰性小鼠血清樣品，計(jì)算陽(yáng)、陰性檢出符合率及總體符合率。

2 結(jié)果

2.1cpb1基因擴(kuò)增產(chǎn)物的鑒定cpb1基因PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，可見約1 000 bp 的目的基因條帶，大小與預(yù)期相符，見圖1。

圖1 cpb1基因PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.1 Electrophoretic profile of PCR products of cpb1 gene

2.2 重組質(zhì)粒的鑒定 重組質(zhì)粒pET32a-cpb1酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，EcoRⅠ單酶切產(chǎn)物可見約6 800 bp 的基因片段，NcoⅠ和EcoRⅠ雙酶切產(chǎn)物可見950和5 900 bp的基因片段，NcoⅠ、HindⅢ、EcoRⅠ三酶切產(chǎn)物可見500（該條帶為cpb1基因在442 bp 處Hind 酶切位點(diǎn)斷裂后形成的混合物）和5 900 bp 的基因條帶，大小均與理論值相符，見圖2。測(cè)序結(jié)果表明，獲得的基因序列與GenBank 中登錄的cpb1基因序列（X83275.1）的同源性為100%。上述結(jié)果表明，重組質(zhì)粒pET32a-cpb1構(gòu)建正確。

圖2 重組質(zhì)粒pET32a-cpb1的酶切鑒定Fig.2 Restriction map of recombinant plasmid pET32a-cpb1

2.3 重組蛋白的鑒定 誘導(dǎo)菌超聲破碎裂解沉淀和全菌體經(jīng)12% SDS-PAGE 分析，表達(dá)的蛋白相對(duì)分子質(zhì)量為54 000（CPB1 蛋白與硫氧化還原蛋白的融合蛋白）及34 000（CPB1 蛋白）條帶，大小與理論值相符，上清中表達(dá)較少，主要以包涵體形式表達(dá)。見圖3。

圖3 表達(dá)的重組蛋白的SDS-PAGE分析Fig.3 SDS-PAGE analysis of expression product of recombinant protein

2.4 McAb 1K19 的鑒定 McAb 1K19 純化產(chǎn)物經(jīng)12%SDS-PAGE分析，可見相對(duì)分子質(zhì)量約50 000的重鏈蛋白條帶和25 000 的輕鏈條帶，見圖4。McAb 1K19 細(xì)胞株分泌的抗體重鏈為IgG2b 型，輕鏈為κ型。

圖4 McAb 1K19純化產(chǎn)物的SDS-PAGE分析Fig.4 SDS-PAGE analysis of purified product of McAb 1K19

2.5 方法的優(yōu)化

2.5.1 最佳抗原包被濃度及抗體稀釋度 當(dāng)重組蛋白CPB1 包被濃度為10 μg／mL，McAb 1K19 稀釋度為1∶16 384 時(shí)，P／N 最大，為18.938，見圖5。因此，確定CPB1 最佳包被濃度為10 μg／mL，McAb 1K19最佳稀釋度為1∶16 384。

圖5 抗原包被濃度（A）及抗體稀釋度（B）的優(yōu)化結(jié)果Fig.5 Optimization results of coating concentration of antigen（A）and antibody dilution（B）

2.5.2 最佳二抗稀釋度 HRP 標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG 稀釋倍數(shù)為1∶1 000 時(shí)，P／N 最大，且A450接近1，見圖6。因此，確定HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG 最佳稀釋倍數(shù)為1∶1 000。

圖6 二抗稀釋度的優(yōu)化結(jié)果Fig.6 Optimization result of dilution of the secondary antibody

2.5.3 最佳封閉時(shí)間 5%脫脂奶粉封閉120 min時(shí)，A450和P／N 均最大，見圖7。因此確定最佳封閉時(shí)間為120 min。

圖7 封閉時(shí)間的優(yōu)化結(jié)果Fig.7 Optimization result of blocking time

2.6 臨界值的確定 21 份陰性對(duì)照的A450分別為0.073、0.076、0.064、0.071、0.083、0.063、0.088、0.066、0.059、0.077、0.091、0.072、0.155、0.109、0.064、0.135、0.068、0.119、0.066、0.134、0.072，x為0.086，SD為0.028。樣品A450≥0.17判為陽(yáng)性，≤0.142判為為陰性。

2.7 方法的驗(yàn)證

2.7.1 特異性 除C.p.B 型和C 型菌株外，其他菌株A450均＜0.142，見圖8。表明McAb 1K19與其他病原菌無交叉反應(yīng)。

圖8 McAb1K19與常見食源性病原菌的交叉免疫反應(yīng)Fig.8 Cross-immune reaction of McAb1K19 with common foodborne pathogenic bacteria

2.7.2 靈敏度 當(dāng)McAb 1K19 稀釋度為1∶32 768，即濃度為0.002 μg／μL時(shí)，A450為0.223 5，仍大于陽(yáng)性臨界值，且P／N 為10.2，見圖9。表明建立的方法具有較高靈敏度。

圖9 靈敏度驗(yàn)證結(jié)果Fig.9 Verification of sensitivity

2.7.3 精密性 用同批重組蛋白重復(fù)4次檢測(cè)McAb 1K19 的A450分別為1.100、1.186、1.093、1.172，x為1.138，SD為0.041，CV為3.654%。用4 批重組蛋白檢測(cè)McAb 1K19 的A450分別為1.115、1.259、1.063、1.220，x為1.164，SD為0.078，CV為6.759%。CV均＜10%，表明該方法具有良好的精密性。

2.8 方法的應(yīng)用 201份健康牛血清及2份陰性小鼠均為陰性，2份陽(yáng)性小鼠血清均為陽(yáng)性，陰性、陽(yáng)性及總符合率均為100%，表明建立的方法可用于臨床樣品檢測(cè)。

3 討 論

B 和C 型C.p.是患病家畜中常見的致病菌株，除分泌CPB1 外，還可分泌產(chǎn)生CPA、CPB2 等其他毒素和酶類［12-13］。天然CPB1 的分離純化過程復(fù)雜繁瑣，得率較低、成本高，不適合作為檢測(cè)用抗原。目前，E.coli是最常用且最成熟的異源蛋白表達(dá)系統(tǒng)之一。本課題組前期從B 型C.p.菌株NCTC8533 中擴(kuò)增獲得cpb1基因，測(cè)序并克隆至pBET7 載體上，在E.coliM109 中表達(dá)，獲得的目的蛋白相對(duì)分子質(zhì)量約34 000，可與天然CPB1 產(chǎn)生的抗體發(fā)生特異性反應(yīng)［14］。另一項(xiàng)研究將CPB1 的編碼基因亞克隆至載體pAE 中，在E.coliBL21（DE3）中也成功表達(dá)了重組CPB1 蛋白［15］。本實(shí)驗(yàn)通過低溫誘導(dǎo)方法獲得了CPB1 表達(dá)，主要以包涵體形式存在。本課題組前期構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒pTIG-Trx-cpb1，獲得目的蛋白相對(duì)分子質(zhì)量約34 000，但E.coli菌體蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量約35 000，兩者較接近，使SDS-PAGE 分析結(jié)果難以區(qū)分，因此本實(shí)驗(yàn)將cpb1基因構(gòu)建至載體pET32a，獲得了相對(duì)分子質(zhì)量為54 000 的重組蛋白CPB1 與硫氧化還原蛋白的融合蛋白，可與E.coli菌體蛋白進(jìn)行有效區(qū)分。

ELISA法可特異性檢測(cè)腸道內(nèi)容物中的外毒素ε，是診斷C.p.感染的最佳方法之一［16］，如LAVANA等［17］以15 只美利奴羔羊?yàn)檠芯繉?duì)象，在羔羊十二指腸內(nèi)接種D型C.p.上清培養(yǎng)物300 mL，發(fā)現(xiàn)外毒素ε在回腸、十二指腸和結(jié)腸的檢出率分別為92%、64%和57%，在7%的心包和房水液中也檢測(cè)到了外毒素ε，但在腹水和尿液中未檢測(cè)到該毒素；也有研究表明，在常規(guī)體液中檢測(cè)外毒素ε存在較大誤差，還應(yīng)基于臨床和病理數(shù)據(jù)診斷C.p.感染［18］。另外，KIRCANSKI等［19］通過重組CPB2 多克隆抗體建立了定量檢測(cè)新生仔豬腸道內(nèi)容物中CPB2 的抗原捕獲ELISA 法；MCCOURT 等［20］建立了用于檢測(cè)C.p.外毒素α 的夾心ELISA 方法。這兩種方法為動(dòng)物壞死性腸炎的快速篩查診斷提供了一種較理想的檢測(cè)方法。

本研究通過制備重組CPB1，以其為包被抗原建立了CPB1抗體的間接ELISA檢測(cè)方法，并采用C.p.的McAb 1K19對(duì)建立的方法進(jìn)行優(yōu)化和驗(yàn)證。優(yōu)化結(jié)果表明，重組蛋白CPB1最佳包被抗原濃度為10 μg／mL，一抗最佳稀釋度為1∶16 384，二抗最佳稀釋度為1∶1 000，最佳封閉時(shí)間為120 min。方法驗(yàn)證結(jié)果顯示，除B 和C 型C.p.外，其他常見食源性致病菌A值均低于0.3，表明McAb 1K19 具有良好的特異性；批內(nèi)及批間CV均＜10%，表明建立的間接ELISA 法具有良好的精密性；方法的靈敏性較高。采用建立的間接ELISA 法對(duì)采自寧夏地區(qū)某養(yǎng)殖場(chǎng)的201 份健康牛血清、2 份C.p.陽(yáng)性小鼠血清和小鼠陰性血清的檢測(cè)結(jié)果表明，201份牛血清樣品及小鼠陰性血清均呈陰性，陽(yáng)性小鼠血清樣品呈陽(yáng)性，陰性、陽(yáng)性及總符合率均為100%。

綜上所述，本研究建立了一種用于CPB1抗體檢測(cè)的間接ELISA 法，且具有良好的精密性和較高的靈敏性，可用于大量臨床樣本的檢測(cè)。