一種抗人T淋巴細胞免疫球蛋白淋巴細胞毒效價檢測方法的建立

杜天飛，容新宗，楊盛理，張勇俠，武志強，李春陽，劉蘭軍

成都生物制品研究所有限責任公司 四川省疫苗工程技術研究中心，四川 成都 610023

抗胸腺細胞免疫球蛋白（anti-thymocyte immunoglobulin，ATG）和抗人T 細胞兔免疫球蛋白（antihuman T lymphocyte rabbit immunoglobulin，ALG）是一種含有抗淋巴細胞活性的免疫球蛋白制劑，靶向人T 淋巴細胞的多克隆抗體類藥物，具有明確的生物活性免疫調節(jié)功能［1］。在臨床上，ATG／ALG類制品作為免疫抑制劑廣泛應用于腎移植、心臟移植、肝移植、骨髓移植及重型再生障礙性貧血（severe aplastic anemia，SAA）的治療，且療效顯著［2-5］。目前，依據《中國藥典》三部（2020版）（簡稱《中國藥典》）規(guī)定［6］，采用淋巴細胞毒試驗測定該制品的效價，該方法為傳統(tǒng)的經典方法，在結果判定時通過光學顯微鏡觀察淋巴細胞的死亡情況，計算死亡率，從而判定制品的效價，屬于半定量方法。而《歐洲藥典》（EP 9.0）對該制品的淋巴細胞毒效價測定方法為基于流式細胞儀測定殺傷率的方法，為定量方法。上述兩種藥典方法采用的靶細胞均為人外周血單核細胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC），在活性評價研究中較大的難點在于靶細胞難于獲得。基于ATG／ALG 類制品的開發(fā)與臨床應用前景，便捷準確的體外淋巴細胞毒效價評價方法的開發(fā)顯得尤為重要。

本研究旨在建立一種靶細胞更易獲得，且可準確定量測定ATG／ALG 類制品效價的淋巴細胞毒試驗方法，以期為ALG 產品的開發(fā)提供更為便利的檢測手段。

1 材料與方法

1.1 免疫球蛋白 抗人T 細胞兔免疫球蛋白（商品名：Grafalon）為德國費森尤斯公司產品，批號：M07G-2／01，有效期：2022年6月，為人白血病T 細胞株Jurkat 的T 淋巴細胞作為免疫抗原免疫SPF 級兔制備的多克隆抗體［7-8］；兔抗人胸腺細胞免疫球蛋白（商品名：即復寧）為賽諾菲（北京）制藥有限公司產品，批號：9W1011，有效期：2022年1月，為人胸腺細胞作為免疫抗原免疫SPF級兔制備的多克隆抗體。

1.2 細胞 人Jurkat 細胞株購自ATCC；人PBMC 購自妙順（上海）生物科技有限公司。

1.3 主要試劑及儀器 RPMI1640 培養(yǎng)基購自美國Gibco 公司；新生牛血清（NBS）購自杭州四季青生物工程材料有限公司；胎牛血清（FBS）購自美國Hyclone公司；PI Staining kit 購自生工生物工程（上海）股份有限公司；兔補體為3 ～4 周齡SPF 級兔采血離心分離血清得到；細胞計數儀（Countstar，IC1000）為上海睿鈺生物科技有限公司產品；流式檢測儀（2060R）為美國安捷倫公司產品；正常家兔血清（陰性對照）由本公司制備。

1.4 細胞培養(yǎng) 將Jurkat 細胞置于含10%滅活NBS的RPMI1640培養(yǎng)液中，于37 ℃，5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.5 活性檢測方法的建立 取對數生長期的Jurkat細胞，離心、計數后用PBS（pH 7.4）+20%FBS重懸，制備細胞密度為5×106個／mL的懸液備用。待檢樣品用PBS（pH 7.4）稀釋至合適的濃度梯度，取50 μL加入96 孔V 底板中，再加入50 μL 制備好的細胞，最后加入50 μL 用PBS（pH 7.4）稀釋5 倍的兔補體，混勻，置37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中孵育30 min；4 ℃，200×g離心8 min，吸棄上清，細胞沉淀中加入PI Staining染料，混勻，室溫避光放置5 ～10 min，流式細胞儀檢測細胞殺傷率。以待檢樣品濃度和殺傷率擬合4 參數方程S型量效曲線，計算待檢樣品效價（EC50）。

1.6 方法的優(yōu)化

1.6.1 反應體系的優(yōu)化 在方法建立之初，考察反應體系孵育30 min后直接加入染料上流式細胞儀檢測，以及反應體系孵育30 min后，4 ℃，200×g離心8 min，吸棄上清，細胞沉淀加入PI Staining上流式細胞儀檢測。同時設3 個反應體系，比較在不同體系下效價測定結果的差異。體系1：50 μL 待檢樣品+ 50 μL補體（1∶5稀釋）+50 μL細胞（5×106個／mL）；體系2：75 μL 待檢樣品+25 μL 補體（1∶5 稀釋）+25 μL細胞（5×106個／mL）；體系3：75 μL待檢樣品+25 μL補體（原倍）+25 μL細胞（7×106個／mL）。

1.6.2 細胞培養(yǎng)密度對效價影響的檢測 分別以2×105個／mL 的密度傳代培養(yǎng)Jurkat 細胞72 h，3 ×105個／mL的密度傳代培養(yǎng)細胞48 h，5×105個／mL的密度傳代培養(yǎng)細胞24 h，按照同法收集細胞，以最佳反應體系組成測定Grafalon效價。試驗重復2次。

1.6.3 細胞代次對效價影響的檢測 考察不同代次（P10、P12、P15、P17、P20、P25）Jurkat 細胞對Grafalon效價測定的影響。

1.6.4 數據處理方法與系統(tǒng)檢測要求 采用EXCEL 2010 軟件對試驗結果進行分析處理，使用GraphPad Prism 5 軟件進行繪圖與EC50分析。GraphPad Prism 5校正曲線的相關系數（R2）（4參數擬合）需≥0.980；體系空白對照細胞殺傷率＜10%；補體對照細胞殺傷率＜10%；陰性血清細胞殺傷率＜10%；Grafalon上平臺殺傷率≥80%，下平臺細胞殺傷率＜15%。

1.7 方法的驗證

1.7.1 重復性 考察同一樣品在96 孔V 底板不同布局效價測定結果的重復性。Grafalon 布局在96 孔板第1 ～3 列，以及第10 ～12 列，每個濃度梯度設3 個復孔，試驗重復2次，計算變異系數（CV）。

1.7.2 中間精密度 在不同日期，對同一待檢樣品進行多次效價測定，考察中間精密度。

1.8 淋巴細胞毒效價人PBMC 殺傷活性的比較 分別在人PBMC 和Jurkat細胞體系中，對兩種上市多抗進行淋巴細胞毒活性檢測。PBMC 法參照《歐洲藥典》（EP 9.0）各論中有關“人用動物源性抗T 淋巴細胞免疫球蛋白”章節(jié)（07／2013：1928）中淋巴細胞毒活性測定實驗過程［9］。將人PBMC 用PBS（pH 7.4）+20% FBS 重懸制備密度為7 × 106個／mL 的懸液備用。待檢樣品稀釋至合適的濃度梯度，取75 μL 加入96 孔V 底板中，再加入25 μL 制備好的細胞，最后加入25 μL 兔補體，混勻，置37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中孵育30 min；4 ℃，200×g離心8 min，吸棄上清，細胞沉淀中加入PI Staining 染料，吹打混勻，室溫避光放置5 ～10 min，流式細胞儀檢測細胞殺傷活性。試驗重復3次。

2 結果

2.1 Jurkat細胞測定淋巴細胞毒效價方法的建立 采用Jurkat 細胞作為靶細胞，加入Grafalon 在兔補體存在的反應體系中，37 ℃孵育30 min，加入染料PI Staining，流式細胞儀檢測可見細胞明顯殺傷，殺傷效果與Grafalon 濃度呈正相關。細胞對照的死細胞比率為6.05%，見圖1A、B；孵育完成未離心直接染色上機，Grafalon 稀釋128 倍，通過散點圖可見，P1 門細胞比例僅為12.62%，表明細胞碎片量很大，見圖1C、D，隨著檢測時間延長，會導致同一個樣品布局在96 孔板第1 孔和最后1 孔殺傷效果的差異，從而造成假陽性；體系離心后染色上機，Grafalon稀釋128倍，細胞殺傷率為55.28%，見圖1E、F，更能客觀真實反應樣品活性。后續(xù)試驗均采用孵育完成后4 ℃，200×g離心8 min后加入PI Staining染色上機。

圖1 流式細胞術分析Jurkat細胞的殺傷效果Fig.1 Analysis of killing effect of Jurkat cells by flow cytometry

2.2 反應條件的優(yōu)化

2.2.1 反應體系的優(yōu)化 3 個體系組成均能較好地擬合4參數方程S型量效曲線，根據體系檢測系統(tǒng)要求（上平臺細胞殺傷率≥80%，下平臺細胞殺傷率＜15%），且在3 個體系中，體系1 上下平臺的信倍比最大，體系1 待檢樣品濃度、細胞量以及補體量組成最佳，即最優(yōu)反應體系組成為50 μL 待檢樣品+50 μL補體（1∶5稀釋）+50 μL 細胞（5×106個／mL）。見圖2和表1。

表1 不同體系組成主要參數比較Tab.1 Comparison of main parameters of different system compositions

圖2 不同體系組成對Grafalon 淋巴細胞毒活性量效曲線的影響Fig.2 Effect of different system compositions on dose-response curve of Grafalon lymphocytotoxic activity

2.2.2 細胞培養(yǎng)密度對效價的影響 以2×105個／mL的密度傳代培養(yǎng)72 h 和3 × 105個／mL 的密度傳代培養(yǎng)48 h，細胞生長狀態(tài)較好且一致，Grafalon 測定活性更接近，且靈敏度更高，能更好地反應待檢樣品Grafalon的活性。見圖3和表2。

圖3 不同細胞培養(yǎng)密度對Grafalon 淋巴細胞毒活性量效曲線的影響Fig.3 Effect of different cell culture density on dose-response curve of Grafalon lymphocytotoxic activity

表2 不同細胞培養(yǎng)密度對Grafalon 淋巴細胞毒活性測定的影響Tab.2 Effect of different cell culture density on determination of Grafalon lymphocytotoxic activity

2.2.3 細胞代次對效價的影響 當細胞生長狀態(tài)較好且一致時，從P10到P25代次的細胞效價測定結果較一致，見圖4和表3。

圖4 不同代次細胞對Grafalon 淋巴細胞毒活性量效曲線的影響Fig.4 Effect of various cell passages on dose-response curve of Grafalon lymphocytotoxic activity

表3 不同代次細胞對Grafalon淋巴細胞毒殺傷活性的影響Tab.3 Effects of various cell passages on killing activity of Grafalon lymphocytotoxicity

綜上，生長狀態(tài)較好的細胞傳至P25 代，試驗前細胞密度按2 × 105個／mL 或3 × 105個／mL 傳代，以50 μL待檢樣品+50 μL補體（1∶5稀釋）+50 μL細胞（5×106個／mL）反應體系測定活性，均能得到符合檢測體系要求的殺傷數據，測定6 次Grafalon 效價非常接近，能很好地反應待檢樣品的活性。

2.3 方法的驗證

2.3.1 重復性 板內重復檢測結果的CV值為6.32%，表明該方法重復性良好。見圖5和表4。

圖5 Grafalon板內重復性淋巴細胞毒殺傷量效曲線Fig.5 Intraplate repetitive dose-response curve of killing activity of Grafalon lymphocytotoxicity

表4 Grafalon活性板內重復性檢測結果Tab.4 Results of intraplate repetitive determination of Grafalon activity

2.3.2 中間精密度 不同代次細胞試驗均在不同日期完成，即對同一樣品Grafalon完成多次活性測定，6次測定結果的CV值為4.15%，表明該方法中間精密度良好。

2.4 淋巴細胞毒效價人PBMC 殺傷活性的比較 基于人PBMC 的淋巴細胞毒效價，即復寧的活性高于Grafalon 約3 倍。對于Jurkat 細胞作為免疫原制備的Grafalon 類產品，依據多克隆抗體產生的機理，以Jurkat細胞作為靶細胞得到的淋巴細胞毒效價，仍能很好地反映其活性。見表5。

表5 基于PBMC細胞以及Jurkat細胞淋巴細胞毒殺傷活性比較Tab.5 Comparison of killing activity of lymphocytotoxicity based on PBMC and Jurkat cells

3 討論

市售的ATG／ALG 產品免疫原大致分為兩類：人胸腺細胞或人傳代T 淋巴細胞免疫健康的馬、兔、豬等動物得到［10］，其藥理機制主要為通過直接淋巴細胞毒性、補體介導的T 淋巴細胞溶解等途徑特異性誘導淋巴細胞凋亡，從而對T細胞、B 細胞以及NK細胞造成廣泛的免疫耗竭［11-13］?！稓W洲藥典》（EP 9.0）各論中有關“人用動物源性抗T 淋巴細胞免疫球蛋白”章節(jié)中規(guī)定可使用傳代人T淋巴細胞或胸腺細胞作為免疫原［9］。余健等［14］采用傳代人T淋巴細胞免疫豬得到符合《中國藥典》對該品種效價規(guī)定的多克隆抗體，且認為Jurkat細胞作為免疫原的優(yōu)勢在于含有多種T 細胞表面蛋白；免疫原的批間均一性更好；可規(guī)?；a，可見采用傳代人T 淋巴細胞如Jurkat細胞作為免疫原將會是一個更具潛力的研究方向。

根據藥理機制，《中國藥典》測定效價的方法為淋巴細胞毒試驗及E 玫瑰花環(huán)形成抑制試驗，這兩種方法均為半定量法。《歐洲藥典》（EP 9.0）對該制品的淋巴細胞毒效價測定方法為基于流式細胞儀測定殺傷率，該方法為定量法。從方法的靈敏性以及對樣品效價準確評價的角度來說，定量方法更優(yōu)。《中國藥典》與《歐洲藥典》對于ATG／ALG產品效價的測定，均采用人PBMC 作為靶細胞，由于健康人全血來源人PBMC的獲得較困難，且分離保存的人PBMC批間一致性差異大，針對ALG 產品開發(fā)中早期免疫策略制定、多抗血清效價篩選以及中間品控制開發(fā)，便捷準確的效價測定方法顯得十分必要。

本研究方法是以傳代人淋巴細胞Jurkat作為靶細胞的淋巴細胞毒效價測定方法，對于Jurkat細胞作為免疫原制備的Grafalon類型產品，從多克隆抗體產生的機理來看，能很好的測定其活性。本研究基于Jurkat細胞的淋巴細胞毒活性測定方法為業(yè)界提供了方便、易得且準確的定量檢測方法。對于該方法的進一步應用，企業(yè)還可深入研究各自品種基于Jurkat細胞淋巴細胞毒效價與人PBMC淋巴細胞毒效價的相關性，建立兩種方法的對標關系，本研究中基于人PBMC的淋巴細胞毒效價，即復寧的活性高于Grafalon約3倍，與前期報道結果趨勢一致［15-16］。中間品以及成品最終效價的確定采用Jurkat細胞淋巴細胞毒效價測定方法值得推廣。

綜上所述，本研究開發(fā)的基于Jurkat細胞的淋巴細胞毒效價定量測定方法，靶細胞易得，重復性好，能定量測定ALG 效價，為ALG 產品的開發(fā)提供了更為便利的檢測手段。