多肽PDSORBS2對(duì)缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞凋亡的影響

陳露露，徐勛龍，陳婉嵐，邱朝暉

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬同仁醫(yī)院心內(nèi)科，上海 200336

心血管疾?。╟ardiovascular diseases，CVD）包括缺血性心臟?。╥schemic heart disease，IHD）、心力衰竭、卒中等一些心臟和血管相關(guān)的疾病，是全球人口死亡的主要原因，也是導(dǎo)致生活質(zhì)量下降的主要因素［1］。在2017 年，CVD 導(dǎo)致全球約1 780 萬(wàn)人死亡［2］，而其中中國(guó)死亡人數(shù)為437.8 萬(wàn)人［3］，約占全世界CVD 致死人數(shù)的1/4，致使我國(guó)CVD 的防治工作仍然面臨著巨大的挑戰(zhàn)［4］。因動(dòng)脈粥樣硬化引起的冠狀動(dòng)脈狹窄導(dǎo)致心肌供血不足是IHD 的重要病因［5］，其中心肌梗死（myocardial infarction，MI）是指冠狀動(dòng)脈阻塞引起的冠狀動(dòng)脈血流中斷從而導(dǎo)致心肌缺血性壞死［6］。因此針對(duì)急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI），臨床上以盡早開(kāi)通血管、血運(yùn)重建為主要策略來(lái)挽救瀕死的心肌，其中包括經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療（percutaneous coronary intervention，PCI）和冠狀動(dòng)脈旁路移植（coronary artery bypass grafting，CABG） 已在臨床上得到了廣泛的應(yīng)用［7］。但長(zhǎng)期的臨床應(yīng)用發(fā)現(xiàn)，雖然介入手術(shù)恢復(fù)了心肌供血，顯著提升了患者的生存率［8］，但在心臟的血運(yùn)重建過(guò)程中，通常會(huì)導(dǎo)致另一種不可避免的損傷，即心肌再灌注損傷， 也稱為缺血再灌注（ischemic reperfusion，I/R）損傷［9］，誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡，并由此繼發(fā)心肌瘢痕乃至心力衰竭及惡性心律失常等［10］。

心臟I/R 損傷的發(fā)病機(jī)制包括多個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，已經(jīng)明確氧化應(yīng)激、炎癥與凋亡、線粒體功能障礙是心臟I/R損傷引發(fā)心臟功能受損的重要因素［11］。由氧自由基引起的氧化應(yīng)激導(dǎo)致心肌細(xì)胞的異常凋亡一直以來(lái)被認(rèn)為是心肌I/R 損傷的關(guān)鍵機(jī)制［12］。在心臟再灌注過(guò)程中，由于突然恢復(fù)血流，大量的氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)持續(xù)進(jìn)入細(xì)胞，導(dǎo)致心肌細(xì)胞線粒體中活性氧（reactive oxygen species，ROS）呈爆炸式的激增［13］。然而，過(guò)量的ROS 不僅會(huì)觸發(fā)氧化應(yīng)激，還會(huì)破壞蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、DNA 等生物大分子，隨后導(dǎo)致心肌細(xì)胞的異常凋亡，并由此引發(fā)心臟功能障礙［14］。由于I/R 損傷復(fù)雜的病理機(jī)制，目前針對(duì)I/R損傷的保護(hù)策略仍十分有限，需要我們?nèi)ふ腋臃e極有效的干預(yù)手段［15］。

多肽在體內(nèi)是一類(lèi)重要的生物分子，具有多樣性，并且多肽是具有選擇性的高效信號(hào)分子，能夠結(jié)合特定的細(xì)胞表面受體［16］。此外，多肽還具有相對(duì)分子質(zhì)量小、生物活性高、不良反應(yīng)少及臨床轉(zhuǎn)化率高等良好的成藥特性［17］。研究表明多肽在緩解細(xì)胞病理?yè)p傷、促進(jìn)組織修復(fù)中展現(xiàn)出良好的功能：①抗菌肽LL-37能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖，并且能夠促進(jìn)血管生成［18］。②Humanin 肽能夠保護(hù)心肌細(xì)胞免受氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的損傷［19］。此外，眾所周知，由心臟分泌的B 型鈉尿肽（B-type natriuretic peptide，BNP）和A 型鈉尿肽（A-type natriuretic peptide，ANP）都具有心臟保護(hù)特性，這些肽在心肌缺血的早期釋放，并對(duì)心肌缺血性損傷產(chǎn)生保護(hù)作用［20］。我們?cè)谇捌诘墓ぷ髦?，從缺血后的大鼠心肌?xì)胞中發(fā)現(xiàn)了37 條表達(dá)上調(diào)的肽［21］。其中有1 條肽的序列為L(zhǎng)PASLNS，這條肽上調(diào)倍數(shù)是1.41，P值為0.001，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。由于其前體蛋白名為SORBS2，我們將此肽命名為PDSORBS2。因此，我們猜測(cè)在缺血應(yīng)激下，由心肌細(xì)胞分泌的多肽PDSORBS2 可能對(duì)心臟也存在一定的保護(hù)作用，可從多肽的角度探尋I/R損傷治療的新方向。

1 材料與方法

1.1 主要儀器

無(wú)菌超凈臺(tái)、細(xì)胞培養(yǎng)箱、生物安全柜（Thermo Fisher Scientific，美國(guó)），倒置顯微鏡（Leica，德國(guó)），流式細(xì)胞儀（BD，美國(guó)），純水儀（Merk Millipore，美國(guó)），垂直電泳儀和膜轉(zhuǎn)移裝置（Bio-Rad，美國(guó)），低溫水平離心機(jī)（HITACHI，日本），全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光/熒光圖像分析系統(tǒng)（天能，中國(guó)），激光共聚焦顯微鏡（Zeiss，德國(guó)），Gemini XPS熒光型酶標(biāo)儀（Molecular Devices，美國(guó)）。

1.2 主要試劑與材料

大鼠胚胎心臟來(lái)源的H9C2細(xì)胞購(gòu)于美國(guó)模式菌種保藏中心（American Type Culture Collection，ATCC）；高糖細(xì)胞培養(yǎng)基DMEM、1%的鏈霉素/青霉素和10%胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）均購(gòu)于美國(guó)Gibco 公司；ROS 檢測(cè)試劑盒和Hoechst 33342 染色試劑（碧云天，中國(guó)）；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒8 （cell counting kit-8，CCK-8）（Dojindo，日本）；細(xì)胞凋亡與細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒（愛(ài)必信，中國(guó)）；細(xì)胞裂解液（Solarbio，中國(guó)）；聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜（Millipore，美國(guó)）； 聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）凝膠快速制備試劑盒（雅酶，中國(guó)）；β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）、磷酸化細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（phospho-extracellular regulated protein kinases，P-ERK）、磷酸化蛋白激酶B（phosphoprotein kinase B，P-AKT）及蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）等一抗均購(gòu)自美國(guó)的CST公司；所有的二抗購(gòu)自Biosharp 公司；所有的肽均由上海科肽生物技術(shù)有限公司（中國(guó)）合成，肽的純度高于95%。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞的培養(yǎng) 將大鼠心臟來(lái)源的H9C2 細(xì)胞接種在10 cm 的培養(yǎng)皿中，在含有10%FBS 和1%青霉素/鏈霉

素的完全DMEM 中孵育。并在37 ℃和5%二氧化碳的條件下培養(yǎng)，每隔1 d更換1次新鮮的培養(yǎng)基。H9C2細(xì)胞根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要被隨機(jī)分成正常對(duì)照組（NC 組）、NC+PDSORBS2 組（僅接受多肽PDSORBS2 處理）、H/R 組（僅接受H/R 處理） 和PDSORBS2+H/R 組（多肽PDSORBS2預(yù)處理后再接受H/R處理）。

1.3.2 細(xì)胞缺氧/復(fù)氧（hypoxia/reoxygenation，H/R）損傷模型的建立 正常培養(yǎng)細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)到60%～70%的密度時(shí)，更換新鮮的無(wú)糖無(wú)血清培養(yǎng)基，再將培養(yǎng)皿放入三氣培養(yǎng)箱（94%N2、5%CO2、1%O2）中，缺氧6 h后將細(xì)胞取出，更換新鮮完全培養(yǎng)基后再放入正常孵箱（95%空氣+5%CO2的混合氣體）復(fù)氧2 h。根據(jù)細(xì)胞活力值，選擇細(xì)胞活性約為50%的處理時(shí)間作為后續(xù)造模的處理時(shí)間。

1.3.3 多肽濃度的確定 在H/R 處理之前，提前30 min分別采用10、 20、 50、 100 μmol/L 濃度的多肽PDSORBS2 處理H9C2 細(xì)胞。以NC 組為對(duì)照，然后根據(jù)細(xì)胞活力值，選擇多肽PDSORBS2 作用效果最顯著的最低濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.4 H9C2 細(xì)胞活性的檢測(cè) 采用CCK-8 檢測(cè)H9C2 細(xì)胞的活性。將處于對(duì)數(shù)期且狀態(tài)良好的細(xì)胞按照每孔1 000 個(gè)細(xì)胞的密度接種于96 孔板中，孵育24 h，用多肽PDSORBS2 預(yù)處理30 min 后，再讓細(xì)胞接受H/R 處理。然后在每孔中加入10 μL CCK8試劑，避光下孵育3 h。根據(jù)酶標(biāo)儀測(cè)量出450 nm 波長(zhǎng)下的吸光度值并按如下公式計(jì)算細(xì)胞的活力： 細(xì)胞活力 = [D(450 nm)值加藥組 -D(450 nm)值空白組]/[D(450 nm)值對(duì)照組-D(450 nm)值空白組]×100%。

1.3.5 細(xì)胞內(nèi)ROS 含量的檢測(cè) 按照各組要求處理細(xì)胞后，去除細(xì)胞培養(yǎng)基，PBS洗滌2遍，加入2′，7′-二氯二氫熒光素（2′，7′-dichlorodihydrofluorescein，DCFH）染色30 min，PBS洗滌后使用熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)480 nm激發(fā)光下的熒光強(qiáng)度，并分析各組細(xì)胞內(nèi)的熒光強(qiáng)度。

1.3.6 Hoechst 33342 染色 將造模完畢的細(xì)胞，用PBS洗滌后加入Hoechst 33342 染色工作液，室溫避光孵育5 min后PBS洗滌3次，熒光顯微鏡下觀察。

1.3.7 細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的檢測(cè) 為了探究多肽PDSORBS2 對(duì)H/R 誘導(dǎo)的H9C2 細(xì)胞凋亡程度和細(xì)胞周期的影響，利用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)細(xì)胞的凋亡程度和細(xì)胞周期進(jìn)行檢測(cè)。將處于對(duì)數(shù)期且狀態(tài)良好的細(xì)胞按照以5×105個(gè)/皿的密度接種在直徑6 cm 的培養(yǎng)皿中，孵育24 h后細(xì)胞密度達(dá)到70%，按照分組的要求分別處理細(xì)胞。

將細(xì)胞收集在1.5 mL 的離心管中，用細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)，保證每管中細(xì)胞數(shù)量大于106。去除細(xì)胞上清液，加入195 μL 綠色熒光標(biāo)記的Annexin V 蛋白（Annexin V-fluorescein isothiocyanate，Annexin V-FITC）結(jié)合液輕輕重懸細(xì)胞，然后分別加入5 μL Annexin VFITC 和10 μL 碘化丙啶（propidium iodide，PI） 染色液，避光染色20 min。使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)并分析細(xì)胞的凋亡率。

將細(xì)胞收集在1.5 mL 的離心管中，用預(yù)冷的PBS 洗滌細(xì)胞，用細(xì)胞計(jì)數(shù)器對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，保證每管中細(xì)胞數(shù)量＞106個(gè)。去除細(xì)胞上清液，并用70%乙醇固定細(xì)胞2 h。用預(yù)冷的PBS 沖洗掉多余的乙醇后，用細(xì)胞周期染色工作溶液對(duì)細(xì)胞染色30 min。使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期，并分析處于各周期中細(xì)胞的數(shù)量。使用FlowJo軟件分析所有流式細(xì)胞圖。

1.3.8 細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)表達(dá)水平的檢測(cè) 為進(jìn)一步探究多肽PDSORBS2 對(duì)H/R 誘導(dǎo)的大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響，采用蛋白質(zhì)免疫印跡（Western blotting，WB）技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞中的蛋白表達(dá)水平。按照各組要求處理細(xì)胞后，用細(xì)胞刮板將細(xì)胞收集在1.5 mL 離心管中。將含有0.1%PMSF 的RIPA 添加到細(xì)胞沉淀的離心管中以提取細(xì)胞中的蛋白質(zhì)，按照4∶1 的比例加入5×SDS 上樣緩沖液后置于沸水浴中加熱10 min。

將上述提取的蛋白樣品搖勻并且上樣在10%的PAGE凝膠中進(jìn)行電泳，直至溴酚藍(lán)置底，將PVDF膜用甲醇激活1 min 后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后將PVDF 膜置于5%的脫脂牛奶中常溫下封閉1 h，一抗孵育，4 ℃過(guò)夜。次日回收一抗，TBST 洗膜3 次，每次10 min。二抗室溫下孵育1 h，TBST 洗膜3次，每次10 min。洗膜結(jié)束后用化學(xué)發(fā)光/熒光圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行蛋白條帶的曝光，并通過(guò)條帶的灰度值分析蛋白的表達(dá)水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有定量數(shù)據(jù)均使用GraphPad Prism 8.0 軟件分析，以±s表示。2組間比較使用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單向方差分析。所有的實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次以上，P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 多肽PDSORBS2 對(duì)H/R 誘導(dǎo)的H9C2 細(xì)胞活性的影響

利用CCK-8 檢測(cè)細(xì)胞的活性。結(jié)果顯示：隨著H/R處理時(shí)間的增加，H9C2細(xì)胞活性逐漸下降，H/R處理6 h的H9C2 細(xì)胞活性下降至空白對(duì)照組的50%左右（P=0.000），因此選擇H/R 處理6 h 來(lái)建立細(xì)胞損傷模型（圖1A）；H9C2細(xì)胞的活性與多肽的濃度在50 μmol/L 范圍內(nèi)呈正相關(guān)（P=0.000），且50 μmol/L 濃度與100 μmol/L 濃度的多肽PDSORBS2 干預(yù)的細(xì)胞活性的差異并不顯著（P＞0.05）（圖1B），說(shuō)明多肽的起效濃度為10 μmol/L，而效果最顯著的最低濃度為50 μmol/L。隨后驗(yàn)證，PDSORBS2+H/R 組細(xì)胞活性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于H/R 組的H9C2 細(xì)胞活性（P=0.004）（圖1C），進(jìn)一步說(shuō)明50 μmol/L 濃度的PDSORBS2能夠增加H/R誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞活性。

圖1 多肽PDSORBS2對(duì)H/R誘導(dǎo)的細(xì)胞活性的影響Fig 1 Effect of PDSORBS2 peptide on cell viability induced by H/R

2.2 多肽PDSORBS2 對(duì)H/R 誘導(dǎo)的H9C2 細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的影響

熒光顯微鏡觀察結(jié)果顯示：NC 組、NC+PDSORBS2組和H/R+PDSORBS2 組的H9C2 細(xì)胞，細(xì)胞核呈近圓形，且染色質(zhì)均勻分布，而H/R 組中H9C2 細(xì)胞核明顯縮小，染色質(zhì)凝集呈顆粒狀分布，說(shuō)明H/R 誘導(dǎo)H9C2 細(xì)胞發(fā)生凋亡（圖2A）。同時(shí)通過(guò)酶標(biāo)儀對(duì)細(xì)胞內(nèi)ROS 含量的檢測(cè)結(jié)果顯示（圖2B），多肽PDSORBS2 的干預(yù)明顯降低了H/R 誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞內(nèi)ROS 的含量（P=0.005）。這些結(jié)果說(shuō)明多肽PDSORBS2能夠減輕H/R誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷。

圖2 多肽PDSORBS2對(duì)H/R誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響Fig 2 Effect of PDSORBS2 peptide on H/R-induced oxidative stress in H9C2 cells

2.3 多肽PDSORBS2 對(duì)H/R 誘導(dǎo)的H9C2 細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期阻滯的影響

利用流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞的凋亡和細(xì)胞周期。細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果顯示：與H/R 組相比，PDSORBS2+H/R 組和NC+PDSORBS 組的細(xì)胞凋亡程度顯著降低（P=0.000）（圖3A、C）；細(xì)胞周期的分析結(jié)果顯示：H/R+PDSORBS2 組中處于G1 期的細(xì)胞數(shù)量明顯低于H/R 組中處于G1 期的細(xì)胞數(shù)量，而處于S 期的細(xì)胞數(shù)量明顯高于H/R 組（P=0.000）（圖3B、D）。這些結(jié)果提示多肽PDSORBS2 的干預(yù)可以降低H/R 誘導(dǎo)的H9C2 細(xì)胞的凋亡程度并且可以抑制H/R 誘導(dǎo)的細(xì)胞周期阻滯，促進(jìn)細(xì)胞轉(zhuǎn)入S期。

圖3 多肽PDSORBS2對(duì)H/R誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期阻滯的影響Fig 3 Effect of PDSORBS2 peptide on H/R-induced apoptosis and cell cycle arrest in H9C2 cells

2.4 多肽PDSORBS2 對(duì)H/R 誘導(dǎo)的H9C2 細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響

WB 檢測(cè)結(jié)果顯示（圖4）：在NC+PDSORBS2 組中， 細(xì)胞的促凋亡蛋白（PARP、 Bax 和cleavedcaspase3）的表達(dá)量明顯低于H/R 組，而B(niǎo)cl-2 的表達(dá)量卻明顯高于H/R 組（均P＜0.05）。該結(jié)果提示：與H/R組相比，多肽PDSORBS2 的干預(yù)能夠下調(diào)促凋亡蛋白（PARP、Bax 和cleaved-caspase3） 的表達(dá)水平，上調(diào)Bcl-2 的表達(dá)水平。

圖4 WB檢測(cè)H9C2細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)Fig 4 Detection of the expression of apoptosis-related proteins in H9C2 cells by WB

2.5 多肽PDSORBS2 對(duì)H/R 誘導(dǎo)的H9C2 細(xì)胞中ERK/AKT/CDK2/p27Kip1蛋白水平的影響

WB 結(jié)果顯示： H/R+PDSORBS2 組的P-AKT 和P-ERK 的表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于H/R 組（圖5A～C）（均P＜0.05），這說(shuō)明與H/R 組相比，多肽PDSORBS2 的干預(yù)能夠使P-AKT 和P-ERK 的表達(dá)水平增高。此外，在H/R+PDSORBS2 組，CDK2 的表達(dá)量明顯高于H/R 組，而p27Kip1的表達(dá)量卻明顯低于H/R 組（圖5D～F）（均P＜0.05）。

圖5 多肽PDSORBS2對(duì)H/R誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞中ERK/AKT/CDK2/p27Kip1蛋白水平的影響Fig 5 Effect of PDSORBS2 peptide on the protein levels of ERK/AKT/CDK2/p27Kip1 in H9C2 cells induced by H/R

3 討論

由I/R 損傷引起的心肌損傷目前仍然是醫(yī)學(xué)界尚需攻克的難題之一［22］。因此，如何有效地預(yù)防心肌I/R 損傷依然能夠令研究人員產(chǎn)生濃厚的興趣。在本研究的前期工作中，我們?cè)诠Ｋ篮蟠笫笮募〖?xì)胞中，發(fā)現(xiàn)了一條表達(dá)上調(diào)肽為PDSORBS2。并且，目前尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道關(guān)于多肽PDSORBS2 是否能夠?qū)/R 誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷產(chǎn)生保護(hù)作用。因此，我們通過(guò)H/R 誘導(dǎo)H9C2 細(xì)胞損傷建立體外H/R 損傷模型，并在體外實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行了關(guān)于多肽PDSORBS2 對(duì)于H/R 誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷的功能研究。

在本研究中，通過(guò)CCK-8、流式細(xì)胞術(shù)以及對(duì)凋亡相關(guān)蛋白的WB 分析，我們發(fā)現(xiàn)多肽PDSORBS2 不僅能夠增加H/R 誘導(dǎo)的H9C2 細(xì)胞的活性，還能夠降低H/R 誘導(dǎo)的H9C2 細(xì)胞內(nèi)ROS 的含量，并且抑制H/R 誘導(dǎo)的H9C2 細(xì)胞凋亡程度和細(xì)胞周期阻滯。此外，根據(jù)細(xì)胞活力值，我們觀察到多肽PDSORBS2 的起始有效濃度為10 μmol/L，但是在50 μmol/L時(shí)效果達(dá)到最佳。起效濃度并不是特別低，并且只采用50 μmol/L 的濃度進(jìn)行了后續(xù)的實(shí)驗(yàn)，這是本實(shí)驗(yàn)的一些不足之處。10 μmol/L 的起效濃度可能與多肽的不穩(wěn)定性有關(guān)，未來(lái)仍然需要我們探索，對(duì)多肽進(jìn)行進(jìn)一步的修飾以加強(qiáng)肽的穩(wěn)定性；并且，也需要研究不同濃度的多肽PDSORBS2 對(duì)H/R 誘導(dǎo)的不同心肌細(xì)胞的影響，以進(jìn)一步驗(yàn)證多肽PDSORBS2 的心臟保護(hù)功能。

作為MAPK 的一個(gè)亞家族成員，ERK 途徑還參與了多種細(xì)胞應(yīng)答的調(diào)節(jié)［23］。ERK 途徑的激活參與了心肌細(xì)胞的增殖和存活過(guò)程［24］，對(duì)于保護(hù)心肌細(xì)胞免受缺氧誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡至關(guān)重要［25］。AKT 信號(hào)通路是細(xì)胞存活的關(guān)鍵因素，AKT 通路的激活能夠減輕心臟局部缺血引起的心肌細(xì)胞凋亡和心臟功能障礙［26］。有研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)ERK/AKT 通路的激活可以減輕H/R 誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷，這意味著ERK/AKT 信號(hào)通路的激活可能參與心肌細(xì)胞在I/R過(guò)程中的修復(fù)過(guò)程，能夠?qū)剐募〖?xì)胞的異常凋亡［27］。因此，我們猜想由心肌細(xì)胞分泌的多肽PDSORBS2 可能會(huì)通過(guò)影響ERK/AKT 通路的激活來(lái)減少心肌細(xì)胞的凋亡。在本研究中，WB 檢測(cè)結(jié)果顯示，與NC 組相比，H/R 誘導(dǎo)的H9C2 細(xì)胞的P-ERK、P-AKT 的表達(dá)水平顯著降低，而多肽PDSORBS2 的干預(yù)使P-ERK、P-AKT 的表達(dá)水平明顯高于H/R組。這些數(shù)據(jù)表明：H/R可能會(huì)通過(guò)抑制ERK/AKT 的激活來(lái)誘導(dǎo)大鼠心肌細(xì)胞的凋亡，而多肽PDSORBS2 的干預(yù)可能會(huì)通過(guò)促進(jìn)ERK/AKT 的激活來(lái)抑制H/R誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞的凋亡。

CDK2的激活是細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期途徑中的關(guān)鍵結(jié)合點(diǎn)，它可以促進(jìn)細(xì)胞從G1 期轉(zhuǎn)入到S 期［28］，抑制CDK2 的激活可將細(xì)胞阻滯在G0/G1 期并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［29］。p27Kip1是一種細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑，抑制其活性有利于CDK2 的及時(shí)激活，能夠誘導(dǎo)細(xì)胞從G1期進(jìn)入到S期［30］。此外，ERK 途徑的激活能夠通過(guò)下調(diào)p27Kip1、上調(diào)CDK2 來(lái)促進(jìn)H9C2 細(xì)胞周期的進(jìn)程，從而抑制心肌細(xì)胞的凋亡［31］。在本研究中我們發(fā)現(xiàn)：與NC組相比，H/R組CDK2的表達(dá)量明顯下降，p27Kip1的表達(dá)量明顯上升；而多肽PDSORBS2 的干預(yù)使CDK2 的表達(dá)水平顯著增高，使p27Kip1的表達(dá)水平明顯降低。這些結(jié)果說(shuō)明多肽PDSORBS2 可能會(huì)通過(guò)調(diào)節(jié)CDK2/p27Kip1途徑來(lái)抑制H/R 誘導(dǎo)的細(xì)胞周期阻滯，加快細(xì)胞周期的進(jìn)程，進(jìn)而減輕H9C2細(xì)胞的凋亡程度。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，多肽PDSORBS2 可能是通過(guò)ERK/AKT/CDK2/p27Kip1的信號(hào)通路減少H/R 刺激下H9C2 細(xì)胞內(nèi)ROS 的產(chǎn)生，從而抑制了由H/R 引起的H9C2 細(xì)胞的異常凋亡，進(jìn)而產(chǎn)生心肌細(xì)胞保護(hù)作用。該結(jié)果為PDSORBS2成為一種心肌保護(hù)肽提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。但是本研究?jī)H在體外探究了多肽PDSORBS2 對(duì)H/R 誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷的影響，關(guān)于多肽PDSORBS2 在體內(nèi)是否能對(duì)I/R 誘導(dǎo)的心肌損傷產(chǎn)生保護(hù)作用，仍需進(jìn)一步研究。隨著研究的不斷深入，多肽PDSORBS2 或許有望為臨床上I/R損傷的治療提供新的方向。