色譜與質(zhì)譜參數(shù)的優(yōu)化對(duì)免疫抑制劑定量靈敏度的影響

孟 爽，周 立，付 勤，夏 立，孟麗媛

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)公共技術(shù)平臺(tái)，上海 200025

環(huán)孢菌素A （cyclosporine A，CsA）、他克莫司（tacrolimus，TaC）、西羅莫司（sirolimus，SiR）、依維莫司（everolimus，EvE）是4 種常用的免疫抑制劑，已被成功應(yīng)用于臨床上肝、腎、肺等多種器官的移植［1-3］。然而，作為窄治療指數(shù)（narrow therapeutic index，NTI）藥物，其治療劑量與毒性劑量間的差別很?。?-6］，因此免疫抑制劑的合理用藥需在臨床藥物監(jiān)測(cè)（therapeutic drug monitoring，TDM）的指導(dǎo)下進(jìn)行，以提高患者用藥的有效性和安全性［7-8］。此外，不同免疫抑制劑聯(lián)合使用時(shí)，會(huì)產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)，在臨床實(shí)踐中通常將它們合并使用以減少毒性和不良反應(yīng)［1，9］。除器官移植外，CsA 可負(fù)載到重組脂蛋白上用于治療顱腦損傷［10］，EvE 可裝載至H-鐵蛋白納米籠上用于治療乳腺癌［11］等。因此，開發(fā)出可應(yīng)用于臨床檢測(cè)，且能夠同時(shí)分析多種免疫抑制劑的定量檢測(cè)方法至關(guān)重要。目前，免疫抑制劑藥物的臨床監(jiān)測(cè)主要基于2 種方法——免疫熒光或比色檢測(cè)以及液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（liquid chromatography-tandem mass spectrometry， LC-MS/MS）法［12-13］。同LC-MS/MS 法相比，盡管免疫分析方法快速且價(jià)格便宜，然而卻存在高交叉反應(yīng)性的干擾，使得檢測(cè)方法的特異性低，從而可能導(dǎo)致定量結(jié)果的高估［14-15］。已有很多報(bào)道闡述了LC-MS/MS 在免疫抑制劑定量檢測(cè)分析中的突出優(yōu)勢(shì)［16-19］。如Mei 等［16］使用LCMS/MS 法同時(shí)檢測(cè)了CsA 和TaC，其最低定量限（limit of quantitation，LOQ）分別為5.0 ng/mL 和0.2 ng/mL，并評(píng)估了化學(xué)發(fā)光微粒免疫法（chemiluminescence microparticle immunoassay，CMIA） 與LC-MS/MS 法的差異；Krná? 等［17］與Gong 等［18］開發(fā)了能夠同時(shí)檢測(cè)4 種常用免疫抑制劑的LC-MS/MS 方法（CsA 的LOQ 為5.0 ng/mL，SiR、TaC 和EvE 的LOQ 為0.5 ng/mL）。盡管上述報(bào)道能夠滿足免疫抑制劑應(yīng)用于臨床器官移植TDM 的一般需求，然而仍然需要開發(fā)更高靈敏度的方法以實(shí)現(xiàn)這4 種免疫抑制劑更廣泛的臨床應(yīng)用。

在LC-MS/MS 定量分析中，為了獲得更高的檢測(cè)靈敏度及準(zhǔn)確度，通常需要對(duì)色譜條件及質(zhì)譜參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。其中，流動(dòng)相及流動(dòng)相添加劑，如常用的甲酸（formic acid，F(xiàn)A）、乙酸、甲酸銨（ammonium formate，AF）、乙酸銨（ammonium acetate，AA）、氫氧化銨等的選擇能夠影響色譜峰分離度、峰形，并通過影響離子源中離子的形成從而影響檢測(cè)靈敏度［20-22］，因此是影響定性及定量檢測(cè)的關(guān)鍵。電噴霧電離（electron spray ionization，ESI）是連接液相色譜和質(zhì)譜最廣泛使用的電離源，通過調(diào)整ESI 源參數(shù)設(shè)置，例如氣、溫度、電壓等，能夠影響化合物的電離效率及離子化碎片從而影響定性和定量結(jié)果［23-25］。盡管已有研究開始致力于更高靈敏度的方法開發(fā)（例如Bittersohl 等［26］使用LC-MS/MS 方法同時(shí)測(cè)定了腎移植患者中游離的CsA 和霉酚酸，其CsA 的檢測(cè)靈敏度明顯提升，LOQ 為0.1 ng/mL 等），至今還沒有研究通過系統(tǒng)評(píng)價(jià)并優(yōu)化色譜質(zhì)譜參數(shù)，從而開發(fā)能夠簡(jiǎn)易有效地提高檢測(cè)靈敏度的方法。

本研究考察色譜條件及質(zhì)譜參數(shù)對(duì)免疫抑制劑定量結(jié)果的影響，包括流動(dòng)相的選擇、流動(dòng)相改性劑的添加及離子源參數(shù)的設(shè)置（包括氣、電壓、溫度等）。本研究旨在通過評(píng)估色譜條件及質(zhì)譜離子源參數(shù)對(duì)LC-MS/MS分析中分析物的電離和碎片化的影響，探索一種能夠簡(jiǎn)便地提高定量靈敏度的思路，助力LC-MS/MS 方法開發(fā)和優(yōu)化的有效進(jìn)行。

1 材料與方法

1.1 試劑

本實(shí)驗(yàn)所用的試劑均為商業(yè)化產(chǎn)品而非經(jīng)自行純化。色譜純乙腈購自德國Honeywell公司，色譜純甲醇購自美國Merck 公司，超純水由RephiLe 純水儀制備。質(zhì)譜純的FA 購自美國ThermoFisher Scientific 公司，色譜純的AF購自美國ALDRICH 公司，色譜純的AA 購自美國Fluka公司。CsA、TaC 及SiR 標(biāo)準(zhǔn)品購自加拿大的TRC 公司，EvE標(biāo)準(zhǔn)品購自加拿大TLC公司。

1.2 儀器及軟件

超高效液相色譜（ultra-high performance liquid chromatography，UPLC）系統(tǒng)為島津的LC-30A 系列，配有LC-30AD二元泵，SIL-30AC自動(dòng)進(jìn)樣器以及CTO-30A柱溫箱。質(zhì)譜系統(tǒng)為SCIEX 公司的QTRAP 6500 plus 系列，配有IonDrive Turbo V 離子源以及IonDrive 高能檢測(cè)器等。所有質(zhì)譜譜圖數(shù)據(jù)的處理采用質(zhì)譜儀自帶的Analyst 軟件（V1.7.0）以及定量軟件MultiQuant（V3.0）進(jìn)行分析。

1.3 方法

1.3.1 色譜及質(zhì)譜方法的建立 采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（multiple reaction monitoring，MRM）模式定量分析免疫抑制劑。首先，通過針泵推注直接進(jìn)樣法確定4種免疫抑制劑的母離子（precursor ion，Q1）和子離子（product ion，Q3）定量離子對(duì)（Q1/Q3）。具體方法為：使用甲醇分別配制CsA、TaC、SiR 及EvE 的標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液1 mg/mL，再用甲醇分別稀釋至5 μg/mL，經(jīng)針泵推注至質(zhì)譜儀。通過采集一級(jí)、二級(jí)質(zhì)譜信息，最終確定各自的定量離子對(duì)及相應(yīng)的碰撞能量等參數(shù)。色譜柱選用Waters公司的ACQUITY UPLC?BEH C18 （2.1 mm×100.0 mm，1.7 μm）， 保護(hù)柱為 ACQUITY UPLC?BEH C18 VanGuardTMPre-Column （2.1 mm×50.0 mm，1.7 μm）。流動(dòng)相：A 為有機(jī)相，選擇甲醇或乙腈；B 為水相。為了改善色譜峰峰形、提高信號(hào)強(qiáng)度，流動(dòng)相均添加0.1%FA。洗脫梯度為：0～2 min，40% B；2～6 min，40% B→0 B；6～8 min，0 B；8～8.01 min，0 B→40% B；8.01～10 min，40% B。流速為0.5 mL/min，色譜柱溫度設(shè)置為50 ℃，自動(dòng)進(jìn)樣器溫度設(shè)置為4 ℃。

1.3.2 流動(dòng)相對(duì)其響應(yīng)的影響 為了考察流動(dòng)相對(duì)4種免疫抑制劑定量結(jié)果的影響，采用甲醇或乙腈作為有機(jī)相，并且使用含不同濃度緩沖鹽（AF 或AA，濃度為5、10或20 mmol/L）的水相體系，考察AF或AA 的添加對(duì)定量分析的影響?？疾炝鲃?dòng)相的影響時(shí)，質(zhì)譜條件選擇匹配0.5 mL/min的流速下常用的離子源參數(shù)設(shè)置：離子源電壓（ionSpray voltage，IS） 為5 500 V，離子源溫度（ion source temperature，TEM）為550 ℃，噴霧氣（ion source gas 1，Gas 1）為50 psi（1 psi=6.895 kPa），干燥氣（ion source gas 2，Gas 2） 為50 psi，氣簾氣（curtain gas，CUR）為35 psi，碰撞氣（collision gas，CAD）為低流速。

1.3.3 質(zhì)譜參數(shù)對(duì)其響應(yīng)的影響 為了考察質(zhì)譜離子源參數(shù)對(duì)4 種免疫抑制劑定量結(jié)果的影響，設(shè)置IS 分別為4 000、4 500、5 000、5 500 V；TEM 分別為150、200、250、300、350、400、450、500、550、600 ℃；CUR 分別為20、25、30、35、40、45 psi；Gas 1 分別為40、45、50、55、60、65 psi；Gas 2 分別為40、45、50、55、60、65 psi；CAD 分別為低、中、高流速。通過比較不同條件下4 種免疫抑制劑的峰形及峰面積，確定最佳的質(zhì)譜參數(shù)。

1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)品溶液及標(biāo)準(zhǔn)曲線的配制 用甲醇配制濃度為100 ng/mL 的4 種免疫抑制劑標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液，用以評(píng)估流動(dòng)相及離子源參數(shù)對(duì)于化合物色譜響應(yīng)的影響。用甲醇分別配制濃度為0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、5、10 ng/mL 的CsA、TaC、SiR 和EvE 標(biāo)準(zhǔn)品溶液，置于4 ℃冰箱中備用。

1.3.5 結(jié)果分析 使用SCIEX 公司的定量軟件MultiQuant （V3.0） 對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性及準(zhǔn)確度（accuracy）進(jìn)行分析。其中，準(zhǔn)確度表示標(biāo)準(zhǔn)曲線中各個(gè)樣品的理論濃度與實(shí)測(cè)濃度的接近程度，由MultiQuant（V3.0）軟件自動(dòng)計(jì)算（一般要求各標(biāo)準(zhǔn)品濃度點(diǎn)的準(zhǔn)確度在100%±15%范圍內(nèi)，最低濃度點(diǎn)在100%±20%范圍內(nèi)）。使用GraphPad Prism 6 軟件繪制質(zhì)譜參數(shù)對(duì)于免疫抑制劑色譜峰峰面積影響的折線圖。

2 結(jié)果

2.1 免疫抑制劑MRM定量離子對(duì)的確定

采用MRM 正離子模式，對(duì)4 種免疫抑制劑進(jìn)行定量分析。為了確定免疫抑制劑的MRM 定量離子對(duì)信息，使用針泵直接推注標(biāo)準(zhǔn)品的進(jìn)樣方式，對(duì)4 種免疫抑制劑分別進(jìn)行一級(jí)、二級(jí)質(zhì)譜信息采集，從而獲取4 種免疫抑制劑的Q1 和Q3 碎片信息，并針對(duì)每個(gè)化合物分別優(yōu)化去簇電壓（declustering potential，DP）、碰撞能量（collision energy，CE）、碰撞室出口電壓（collision cell exit potential，CXP）等參數(shù)，最終確定用于定量檢測(cè)的MRM 離子對(duì)，結(jié)果見表1。該結(jié)果將用于后續(xù)建立LC-MS/MS 定量檢測(cè)方法。

表1 4種免疫抑制劑MRM方法參數(shù)Tab 1 Parameters of MRM method of four immunosuppressant drugs

2.2 流動(dòng)相對(duì)免疫抑制劑定量分析的影響

不同有機(jī)相及緩沖鹽體系對(duì)免疫抑制劑定量檢測(cè)的影響主要通過峰寬和色譜峰響應(yīng)來評(píng)價(jià)（圖1）。結(jié)果表明，與乙腈相比，甲醇作為有機(jī)相能夠明顯減小峰寬、改善峰形。例如，有機(jī)相由乙腈更換為甲醇時(shí)，CsA 色譜峰峰寬由0.70 min 縮短至0.31 min，TaC 色譜峰峰寬由0.93 min 縮短至0.61 min，且色譜峰峰形得到一定程度的改善。為了進(jìn)一步改善峰形、提高色譜峰響應(yīng)，以甲醇（含0.1%FA）為有機(jī)相，在水相（含0.1%FA）中添加了5 mmol/L 的AF。結(jié)果發(fā)現(xiàn)AF 的添加能夠顯著提高色譜峰響應(yīng)并改善峰形。

圖1 4種免疫抑制劑在不同流動(dòng)相體系下色譜峰峰形及色譜響應(yīng)的比較Fig 1 Comparison of chromatographic peak shapes and chromatographic responses of four immunosuppressant drugs under different mobile phase systems

含不同濃度AF 及AA 的緩沖鹽體系對(duì)免疫抑制劑定量分析影響的結(jié)果見表2。同AA相比，含AF的流動(dòng)相體系下，色譜峰的響應(yīng)相對(duì)更高。此外，無論是AF 還是AA，隨著緩沖鹽濃度的增加，色譜峰信號(hào)并沒有進(jìn)一步提高。相反，高濃度緩沖鹽反而會(huì)一定程度抑制色譜峰響應(yīng)。因此，最終選擇在水相中添加5 mmol/L的AF開展后續(xù)的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。

表2 不同緩沖鹽體系對(duì)4種免疫抑制劑色譜峰的影響Tab 2 Influence of different buffer salt systems on the chromatographic peaks of four immunosuppressant drugs

2.3 質(zhì)譜參數(shù)對(duì)免疫抑制劑定量檢測(cè)的影響

優(yōu)化流動(dòng)相體系雖然能夠提高免疫抑制劑色譜峰響應(yīng)，但色譜峰峰形仍有待優(yōu)化。為了改善峰形，提高定量的準(zhǔn)確性，分別優(yōu)化了IS、TEM、CUR、Gas 1、Gas 2、CAD 等離子源參數(shù)（圖2）。結(jié)果表明，隨著IS升高，免疫抑制劑色譜峰響應(yīng)逐漸增強(qiáng)（圖2A）；TEM對(duì)免疫抑制劑色譜峰響應(yīng)影響顯著，在100～600 ℃的范圍內(nèi)，隨著溫度的增加，色譜峰響應(yīng)呈現(xiàn)先增后減的趨勢(shì)（圖2B）；隨著CUR 的增加，色譜峰響應(yīng)降低（圖2C）；Gas 1 和Gas 2 對(duì)4 種免疫抑制劑響應(yīng)的影響并不明顯，在40～65 psi 的范圍內(nèi)，色譜峰響應(yīng)幾乎不受影響（圖2D、E）；CAD 對(duì)4 種免疫抑制劑響應(yīng)的影響趨勢(shì)不同，對(duì)SiR 和EvE 的影響較大，在CAD 低流速時(shí)為最優(yōu)（圖2F）。

圖2 質(zhì)譜離子源參數(shù)對(duì)4種免疫抑制劑色譜峰響應(yīng)的影響Fig 2 Influence of mass spectrometry ion source parameters on the chromatographic peak response of four immunosuppressant drugs

在質(zhì)譜離子源參數(shù)中，TEM 對(duì)4 種免疫抑制劑的色譜峰響應(yīng)影響最為明顯（圖2）。在500～600 ℃時(shí)（0.5 mL/min 流速下通常設(shè)置的TEM 范圍），4 種免疫抑制劑的色譜峰響應(yīng)反而最低。CsA、SiR、TaC 及EvE 的最優(yōu)TEM 范圍分別為150～200 ℃、200～250 ℃、250～300 ℃、200～250 ℃。對(duì)于CsA 來說，溫度的改變能夠造成色譜峰響應(yīng)值呈2～3 個(gè)數(shù)量級(jí)的變化（圖2B）。此外，溫度的改變對(duì)免疫抑制劑峰形的影響極大，隨著溫度的降低，色譜峰峰形得到明顯改善（圖3）。其中，CsA 的峰形變化尤為顯著：TEM 為500 ℃時(shí)，色譜峰呈多分叉狀；溫度降低至300 ℃時(shí)，色譜峰峰形得到一定程度的改善；而溫度降低至100～250 ℃時(shí)，色譜峰呈平滑無分叉的對(duì)稱峰。

圖3 質(zhì)譜TEM對(duì)4種免疫抑制劑色譜峰峰形的影響Fig 3 Influence of mass spectrometry TEM on the chromatographic peak shape of four immunosuppressant drugs

為了進(jìn)一步確定TEM 對(duì)免疫抑制劑定量的影響，我們考察了不同TEM 設(shè)置（250 ℃和550 ℃）對(duì)4 種免疫抑制劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性及定量靈敏度LOQ 的影響。結(jié)果見圖4。250 ℃時(shí)，4 種免疫抑制劑的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性良好（圖4A），除EvE 外，r2均大于0.99，且定量準(zhǔn)確度高（85%～115%）。此外，4 種免疫抑制劑的LOQ 均能達(dá)到0.05 ng/mL［信噪比（signal-to-noise ratio，S/N）＞10］，遠(yuǎn)高于已有文獻(xiàn)報(bào)道［16-18，26］，表明定量靈敏度得到顯著改善；而550 ℃時(shí)，4 種免疫抑制劑的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性相對(duì)較差且標(biāo)準(zhǔn)曲線各個(gè)濃度點(diǎn)的準(zhǔn)確度不能滿足85%～115%的可容忍范圍。此時(shí)，相較于250 ℃，CsA 和SiR的濃度達(dá)到0.1 ng/mL 時(shí)，才能滿足S/N＞10，即定量靈敏度降低。因此，TEM 過高時(shí)（550 ℃）時(shí)，4 種免疫抑制劑的定量靈敏度和準(zhǔn)確度均降低；TEM 對(duì)免疫抑制劑定量結(jié)果影響顯著，在方法優(yōu)化時(shí)不容忽視。綜上，在甲醇（含0.1% FA）-水（含0.1% FA 及5 mmol/L AF）的色譜條件下，免疫抑制劑定量分析方法的最優(yōu)質(zhì)譜離子源參數(shù)設(shè)置為：IS=5 500 V，TEM=250 ℃，CUR=20 psi，Gas 1=65 psi，Gas 2=45 psi，CAD=低流速。

圖4 TEM對(duì)4種免疫抑制劑標(biāo)準(zhǔn)曲線線性的影響Fig 4 Influence of TEM on the standard curve linearity of four immunosuppressant drugs

3 討論

近幾年來，LC-MS/MS 作為定量檢測(cè)手段應(yīng)用于免疫抑制劑的分析已較為成熟。例如，Gong 等［18］開發(fā)了結(jié)合樣品前處理一步蛋白沉淀法的LC-MS/MS 分析方法，可實(shí)現(xiàn)樣品前處理的簡(jiǎn)單化、短時(shí)間梯度（7 min）以及較高靈敏度（CsA、SiR、TaC、EvE 的LOQ 分別為5.0、0.5、0.5、0.5 ng/mL）［18］；Krná?等［17］進(jìn)一步縮短了洗脫梯度（3.5 min），從而提高了檢測(cè)效率等。盡管目前已經(jīng)有非常多的報(bào)道將LC-MS/MS 應(yīng)用于免疫抑制劑定量檢測(cè)項(xiàng)目中，然而免疫抑制劑定量檢測(cè)需要開發(fā)更高靈敏度的定量分析方法，且至今尚沒有報(bào)道系統(tǒng)評(píng)價(jià)色譜質(zhì)譜參數(shù)對(duì)免疫抑制劑定量分析的影響。Krná? 等［17］僅評(píng)價(jià)了流動(dòng)相中添加不同濃度的AF 對(duì)免疫抑制劑響應(yīng)的影響。本研究針對(duì)LC-MS/MS 方法中主要的參數(shù)進(jìn)行系統(tǒng)考察，包括流動(dòng)相、流動(dòng)相添加劑、IS、TEM、Gas 1、Gas 2、CAD 等。通過改變不同的參數(shù)設(shè)置，來系統(tǒng)評(píng)估并優(yōu)化免疫抑制劑定量分析的關(guān)鍵因素。

FA、AF 和AA 是常用的流動(dòng)相添加劑，較低濃度（≤0.05%體積分?jǐn)?shù)）的FA 能夠增強(qiáng)大多數(shù)化合物在正離子模式下的質(zhì)譜響應(yīng)［16-18］。此外，在優(yōu)化色譜-質(zhì)譜方法時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)AF 或AA 的添加能夠明顯增強(qiáng)免疫抑制劑色譜峰響應(yīng)；隨著緩沖鹽濃度的增加，色譜響應(yīng)反而受到抑制，這與流動(dòng)相PH 值及化合物本身的pKa 值有關(guān)［27］。在本研究中，TEM 是影響免疫抑制劑定量分析的最主要因素。對(duì)于ESI 離子源，其TEM 的設(shè)置在一定的范圍內(nèi)與流速呈正相關(guān)。例如，在0.4～0.5 mL/min的流速下，該色譜-質(zhì)譜體系匹配的TEM 通常為500～600 ℃。然而，對(duì)于免疫抑制劑來說，較高的TEM（500～600 ℃）能夠?qū)е路逍巫儾钋乙种粕V峰響應(yīng)，隨溫度升高其抑制作用更為明顯，從而最終影響定量的準(zhǔn)確性。在200～300 ℃之間，4 種免疫抑制劑的色譜峰響應(yīng)最高（圖2），這與Gong等［18］的方法描述一致（TEM 為300 ℃）。除流速以外，ESI 的TEM 還與流動(dòng)相組成及化合物的特性相關(guān)。通常，TEM 升高能夠加快帶電液滴表面的溶劑揮發(fā)，從而能夠更快地到達(dá)Rayleigh 極限，因此在相同時(shí)間內(nèi)能夠產(chǎn)生更多的氣相離子從而增加檢測(cè)的靈敏度。然而，當(dāng)有機(jī)相比例較高時(shí)，相對(duì)較低的TEM 已經(jīng)足夠使得帶電液滴氣化［24］。由于CsA 等這4種免疫抑制劑水溶性差，其在高甲醇比例時(shí)出峰，因此可能僅需要較低的TEM 即可滿足氣化。

綜上所述，我們探究了CsA、SiR、TaC 以及EvE 4種免疫抑制劑在UPLC-MS/MS 定量分析中的主要色譜和質(zhì)譜參數(shù)對(duì)定量分析的影響，改善了免疫抑制劑定量檢測(cè)的靈敏度和準(zhǔn)確性。此外，也為其他化合物的質(zhì)譜定量方法開發(fā)和優(yōu)化提供了新的思路。