胃癌患者預(yù)后相關(guān)微RNA預(yù)測模型的構(gòu)建及其應(yīng)用價值探討

岳 犇，王高明，楊鹿笛，崔 然，郁豐榮

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院胃腸外科，上海 200127

胃癌發(fā)病率和病死率居全球第5位和第3位；盡管手術(shù)是目前主要的治療手段，但半數(shù)以上行根治性切除手術(shù)的胃癌患者出現(xiàn)局部復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，影響患者的預(yù)后［1-2］。異常表達(dá)的微RNA（microRNA，miRNA）是胃癌的特征之一［3］。miRNA是一類含有17～25個核苷酸的內(nèi)源性非編碼RNA，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達(dá)［4］。越來越多的研究［5-6］證明，miRNA參與腫瘤的增殖、凋亡、侵襲/轉(zhuǎn)移和血管生成等生物學(xué)過程，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，可作為腫瘤診斷和預(yù)后的潛在標(biāo)志物。近年來，隨著基因檢測技術(shù)的不斷發(fā)展，高通量測序技術(shù)結(jié)合生物信息學(xué)分析，已經(jīng)在臨床應(yīng)用中取得了重要的成果。本研究基于基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫（Gene Expression Omnibus，GEO）和癌癥基因圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA），回顧性分析397例胃癌患者的臨床病理資料，基于生物信息學(xué)構(gòu)建胃癌患者預(yù)后相關(guān)miRNA預(yù)測模型并探討其應(yīng)用價值，為胃癌患者個體化診療方案的制定提供參考。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

采用回顧性隊列研究方法。利用R 4.0.3 中的TCGAbiolinks包收集TCGA-STAD 中397例胃癌患者的臨床資料［7］，其中男258 例、女139 例，中位年齡67 歲（30～88 歲）。397 例患者中，356 例臨床病理資料完整。將397 例患者采用隨機(jī)抽樣法按7∶3 比例分為訓(xùn)練集（278例）和測試集（119例）；訓(xùn)練集用于構(gòu)建預(yù)測模型，測試集用于驗(yàn)證模型效能。

納入標(biāo)準(zhǔn)：①病理學(xué)確診為胃癌。②具有miRNA 的樣本測序數(shù)據(jù)。③具有預(yù)后信息及臨床資料。排除標(biāo)準(zhǔn)：①正常胃組織樣本信息。②轉(zhuǎn)移性胃癌樣本信息。③生存時間＜10 d。

1.2 研究方法

1.2.1 差異miRNA 篩選 利用美國國立生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）平臺下的GEO 數(shù)據(jù)庫檢索含有人源胃癌及癌旁組織樣本的芯片GSE93415。該芯片共包含40 例組織樣本，其中20 例為癌組織，20 例為癌旁正常組織。通過GEO Datasets 中GEO2R 在線分析癌組織和癌旁正常組織差異表達(dá)的miRNA，并篩選出候選差異表達(dá)miRNA［8］。

1.2.2 預(yù)后相關(guān)miRNA 模型的構(gòu)建 使用R 4.0.3 中的DESeq2 包對TCGA 樣本的基因表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化［9］。為了提高預(yù)測模型的準(zhǔn)確性，首先在候選差異表達(dá)miRNA 中過濾掉低表達(dá)的miRNA，過濾條件為在397 個TCGA 胃癌樣本中標(biāo)準(zhǔn)化后的miRNA 表達(dá)量之和＞100?；谟?xùn)練集患者信息，利用R 4.0.3 中的glmnet 包進(jìn)行LASSO 回歸分析，將候選差異表達(dá)miRNA 擬合成一個相對精簡的預(yù)后相關(guān)miRNA模型［10-11］。

1.2.3 預(yù)后相關(guān)miRNA 模型的驗(yàn)證 分別在訓(xùn)練集和測試集中對構(gòu)建的預(yù)后相關(guān)miRNA 模型的預(yù)測效能進(jìn)行驗(yàn)證，用生存曲線和列線圖展示［12-13］。

1.2.4 影響胃癌患者預(yù)后的相關(guān)因素分析 選取臨床病理資料完整的356例胃癌患者的臨床病理資料，分析年齡、性別、腫瘤病理分期、T分期、N分期、M分期以及預(yù)后相關(guān)miRNA模型評分與胃癌患者預(yù)后之間的相關(guān)性。

1.2.5 預(yù)后相關(guān)miRNA 模型與臨床病理因素預(yù)測效能比較 在臨床病理資料完整的數(shù)據(jù)集中比較構(gòu)建的預(yù)后相關(guān)miRNA 模型與臨床病理因素對胃癌患者5 年總體生存率的預(yù)測效能。

1.2.6 對化學(xué)治療藥物敏感度的預(yù)測 利用pRRophetic包中的算法和腫瘤樣本的基因表達(dá)數(shù)據(jù)，估算患者對于不同化學(xué)治療（化療）藥物的敏感度［14］。

1.2.7 預(yù)后相關(guān)恩諾圖的構(gòu)建和驗(yàn)證 使用多因素Cox回歸的方法，將預(yù)后相關(guān)miRNA模型評分與患者年齡、性別以及腫瘤病理分期綜合起來，構(gòu)建一個相對準(zhǔn)確的量化的恩諾圖。使用Calibration曲線驗(yàn)證恩諾圖的預(yù)測效果；其中45°虛線為參考線，表示預(yù)測的總體生存率與實(shí)際總體生存率完全一致；曲線越接近參考線，預(yù)測效果越好。

1.3 觀察指標(biāo)和評價標(biāo)準(zhǔn)

1.3.1 觀察指標(biāo) ①訓(xùn)練集和測試集患者的臨床資料和生存情況。②預(yù)后相關(guān)miRNA 模型的構(gòu)建：篩選與生存相關(guān)的miRNA，構(gòu)建預(yù)后相關(guān)miRNA 模型方程。③預(yù)后相關(guān)miRNA 模型的驗(yàn)證：在訓(xùn)練集和測試集中的預(yù)測效能。④影響胃癌患者預(yù)后的相關(guān)因素分析：年齡、性別、腫瘤病理分期、T 分期、N 分期、M 分期、預(yù)后相關(guān)miRNA 模型評分。⑤預(yù)后相關(guān)miRNA 模型與臨床病理因素預(yù)測效能的比較：在356例臨床病理資料完整的數(shù)據(jù)集中的預(yù)測效能。

1.3.2 評價標(biāo)準(zhǔn) 差異表達(dá)miRNA 篩選標(biāo)準(zhǔn)為在癌組織及癌旁組織中差異表達(dá)倍數(shù)＞2 且矯正后的P值＜0.05［15］。以Log-rank 檢驗(yàn)進(jìn)行生存分析，驗(yàn)證模型的可靠性；以受試者操作特征曲線（receiver operating characteristic，ROC）曲線下面積（area under curve，AUC）分析模型的準(zhǔn)確性，AUC值越接近1，模型的預(yù)測效能越好［13］。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用R 4.0.3 統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以xˉ±s 表示，2 組間比較采用Student-t檢驗(yàn)。偏態(tài)分布的數(shù)據(jù)以M（P25～P75） 表示，組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)。定性資料以絕對數(shù)或百分比表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線并計算生存率，采用Log-Rank 方法比較2 組患者的生存狀況。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 患者基本資料及生存情況

2組患者性別、年齡、腫瘤分期、腫瘤位置、生存狀態(tài)、生存時間、種族、是否接受化療、是否接受放射治療等一般資料比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性，見表1。

表1 訓(xùn)練集與測試集患者一般資料比較Tab 1 Baseline of patients in the training and validation cohorts

278 例訓(xùn)練集患者隨訪時間為14～3 519 d，中位隨訪時間為495 d，1、3、5 年總體生存率分別為77.5%、49.1%、40.6%。119例測試集患者隨訪時間為16～3 720 d，中位隨訪時間為398 d，1、3、5 年總體生存率分別為73.9%、43.1%、29.7%。2 組患者總體生存率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.250），見圖1。

圖1 278例訓(xùn)練集和119例測試集胃癌患者的生存曲線Fig 1 Survival curves of patients with gastric cancer in the training and validation cohorts

2.2 差異表達(dá)miRNA篩選結(jié)果

生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示：從GSE93415測序數(shù)據(jù)集中計算得到111 個候選差異表達(dá)miRNA，其中20 個在癌組織中上調(diào)，91個在癌組織中下調(diào)。對111個候選差異表達(dá)miRNA進(jìn)行過濾后，得到59個候選差異表達(dá)miRNA。

2.3 預(yù)后相關(guān)miRNA模型的構(gòu)建

對59個候選差異表達(dá)miRNA 和訓(xùn)練集樣本數(shù)據(jù)進(jìn)行LASSO 回歸分析，采用10 折交叉驗(yàn)證法進(jìn)行迭代分析。結(jié)果顯示，當(dāng)變量數(shù)為5時，模型均方根誤差最小，其對應(yīng)的λ=0.062。見圖2A、B。篩選出的5個miRNA 分別為let-7i-5p、 let-7f-5p、 miR-708-5p、 miR-135b-5p、 miR-100-5p，差異表達(dá)模式（癌組織對比癌旁組織）均為降低，差異表達(dá)倍數(shù)分別2.55、2.78、2.17、3.08、3.26 倍。COX 回歸分析結(jié)果顯示miR-708-5p 為獨(dú)立的危險因素，miR-135b-5p 為獨(dú)立的保護(hù)因素，見圖2C。通過分析這5個miRNA 的表達(dá)量和胃癌患者的生存數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)胃癌樣本中高表達(dá)let-7f-5p、hsa-let-7i-5p 和hsa-miR-135b-5p 以及低表達(dá)hsa-miR-100-5p 和hsa-miR-708-5p 的患者的總體生存率較好，見圖2D。由上述5 個miRNA 構(gòu)建的預(yù)后表達(dá)方程：風(fēng)險分?jǐn)?shù)=（-0.049×let-7i-5p 表達(dá)量-0.033 2×let-7f-5p 表達(dá)量+0.202 9×miR-708-5p 表達(dá)量-0.088 9×miR-135b-5p表達(dá)量+0.016 3×miR-100-5p表達(dá)量）。

圖2 LASSO-Cox回歸分析篩選miRNAsFig 2 miRNAs screened by Lasso-Cox regression analysis

利用該預(yù)后表達(dá)方程對訓(xùn)練集278例樣本數(shù)據(jù)計算模型評分，以風(fēng)險評分的中位數(shù)為截斷值，將患者分為高風(fēng)險組（預(yù)后相關(guān)miRNA 模型評分＞評分中位數(shù)）和低風(fēng)險組（預(yù)后相關(guān)miRNA 模型評分≤評分中位數(shù)），見圖3A、B。訓(xùn)練組患者的5 個miRNA 表達(dá)情況見圖3C。對訓(xùn)練集中的高、低風(fēng)險組患者進(jìn)行Kaplan-Meier 生存分析，高風(fēng)險組患者的總體生存率較低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.021），見圖3D。利用該預(yù)后表達(dá)方程對訓(xùn)練集278 例樣本數(shù)據(jù)進(jìn)行時間依賴ROC 分析，結(jié)果顯示，該預(yù)后相關(guān)miRNA 模型的1 年、3 年、5 年生存時間預(yù)測概率的AUC 分別為0.640、0.763、0.853，提示該模型對胃癌患者的預(yù)后具有一定的區(qū)分預(yù)測能力，見圖3E。

圖3 訓(xùn)練集預(yù)后相關(guān)miRNA模型評分、時間依賴ROC分析以及Kaplan-Meier生存分析Fig 3 Prognostic miRNA model score,time-dependent ROC analysis,and Kaplan-Meier survival analysis of the training cohort

2.4 預(yù)后相關(guān)miRNA預(yù)測效能檢驗(yàn)

為了進(jìn)一步檢驗(yàn)上述預(yù)后相關(guān)miRNA 模型的預(yù)測效能，利用測試集的119 例胃癌樣本數(shù)據(jù)進(jìn)行Kaplan-Meier生存分析，結(jié)果顯示高風(fēng)險組患者的總體生存率較低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.016）。利用測試集119例胃癌樣本數(shù)據(jù)進(jìn)行時間依賴ROC 分析，結(jié)果顯示該預(yù)后相關(guān)miRNA 模型的1年、3年、5年生存時間預(yù)測概率AUC 分別為0.631、0.735、0.750，提示該模型對胃癌患者的生存狀態(tài)和預(yù)后具有一定的區(qū)分預(yù)測能力（圖4）。

圖4 測試集預(yù)后相關(guān)miRNA模型評分、時間依賴ROC分析以及Kaplan-Meier生存分析Fig 4 Prognostic miRNA model score,time-dependent ROC analysis,and Kaplan-Meier survival analysis of the validation cohort

2.5 影響胃癌患者預(yù)后的相關(guān)因素分析

單因素COX 回歸分析結(jié)果顯示：年齡、腫瘤病理分期、T 分期、N 分期、M 分期和預(yù)后相關(guān)miRNA 模型評分是胃癌患者預(yù)后的相關(guān)因素（P＜0.05），性別不是胃癌患者預(yù)后的相關(guān)因素（P＞0.05），見圖5A。多因素分析結(jié)果顯示：年齡、M 分期和預(yù)后相關(guān)miRNA 模型評分是胃癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險因素（P＜0.05），見圖5B。在356 例臨床資料完整的胃癌患者中，預(yù)后相關(guān)miRNA 模型對胃癌患者5 年生存時間預(yù)測的AUC 值為0.818，高于年齡（AUC=0.619）、性別（AUC=0.500）、腫瘤病理分期（AUC=0.574）、T 分期（AUC=0.726）、N 分期（AUC=0.602）、M分期（AUC=0.505）的預(yù)測效能，見圖5C。

2.6 利用預(yù)后相關(guān)miRNA模型預(yù)測胃癌患者對于化療藥物的敏感度

利用pRRophetic 包和胃癌患者的基因表達(dá)數(shù)據(jù)計算胃癌患者對于一些常規(guī)化療藥物如阿霉素、絲裂霉素C、多西他賽、順鉑和紫杉醇的敏感度。結(jié)果顯示，低風(fēng)險組患者對于順鉑的敏感度明顯高于高風(fēng)險組患者（P=0.030），見圖5D。

圖5 影響胃癌患者預(yù)后的相關(guān)因素分析Fig 5 Analysis of prognostic factors in patients with gastric cancer

2.7 建立并評估與胃癌相關(guān)的預(yù)后恩諾圖

綜合預(yù)后相關(guān)miRNA 模型評分、年齡、性別和腫瘤病理分期等因素，建立預(yù)后相關(guān)恩諾圖（圖6A）。為了評估恩諾圖預(yù)測胃癌患者生存率的準(zhǔn)確性，采用calibration曲線進(jìn)行驗(yàn)證（圖6B）。圖中45°虛線為理想曲線，表明恩諾圖所預(yù)測的胃癌患者的總體生存率與患者實(shí)際的總體生存率一致。由圖可知，恩諾圖所預(yù)測的胃癌患者的1年和3 年總體生存率與實(shí)際總體生存率非常接近。此外，計算恩諾圖、患者年齡、性別和腫瘤病理分期的一致性指數(shù)（consistency index，C-index）。通過比較，發(fā)現(xiàn)恩諾圖的C-index 最高（圖6C）。經(jīng)過決策曲線分析（decision curve analysis， DCA）發(fā)現(xiàn)，與患者的年齡、性別和腫瘤病理分期相比，患者借助于恩諾圖的輔助進(jìn)行臨床決策能夠受益更多（圖6D）。

圖6 預(yù)后相關(guān)恩諾圖的建立及評估Fig 6 Construction and evaluation of the prognostic nomogram

3 討論

隨著高通量測序技術(shù)的興起，基因組、轉(zhuǎn)錄組及蛋白質(zhì)代謝組等多組學(xué)聯(lián)合分析逐漸成為時下熱門的生物研究領(lǐng)域。在轉(zhuǎn)錄組學(xué)中，miRNA 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)在疾病的發(fā)生、發(fā)展中起到重要的作用。miRNA 是一類非編碼內(nèi)源性小RNA，可在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)。miRNA表達(dá)變化或miRNA 功能障礙可能影響腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。Ke 等［16］研究表明miRNA-16 的低表達(dá)與肺癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，過表達(dá)miRNA-16可抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力。另有研究［17-20］表明，miRNA-125家族與多種腫瘤的發(fā)生有密切關(guān)系。在結(jié)直腸癌、卵巢癌、肺癌和髓母細(xì)胞瘤等腫瘤中，miR-125表達(dá)較正常組織降低；而在前列腺癌、胰腺癌等腫瘤中，也發(fā)現(xiàn)其不同程度的上調(diào)。據(jù)報道［21］，胃癌組織中miRNA 表達(dá)異常，提示miRNA 也參與了胃癌的發(fā)生。miR-21 通過作用于PTEN、PDCD4等基因，改變了細(xì)胞的增殖與侵襲能力［22］；miR-130b通過靶向BIM和RUNX3，調(diào)控細(xì)胞的凋亡，介導(dǎo)胃癌的發(fā)生［23］。這些發(fā)現(xiàn)提示，miRNA 在胃癌的臨床診斷、治療選擇、預(yù)后判斷及復(fù)發(fā)預(yù)測等方面，有望成為新的分子標(biāo)志物。

胃癌是一種上皮來源的惡性腫瘤，起源于胃壁最淺表的黏膜上皮細(xì)胞，發(fā)病率和病死率均較高。然而，胃癌的早期臨床特征不明顯，與胃潰瘍等慢性疾病的癥狀相似；因此，在疾病早期易被忽略，往往很難得到有效、及時的治療。目前，臨床上廣泛應(yīng)用的胃癌相關(guān)的分子標(biāo)志物有CEA、CA19-9、CA72-4等；然而，該腫瘤標(biāo)志物的特異度較低，且不具備判斷預(yù)后的能力。因此，臨床上迫切需要開發(fā)新的胃癌生物標(biāo)志物，有助于早期診斷和判斷預(yù)后，輔助制定個性化的治療方案。

本研究旨在通過高通量測序結(jié)合生物信息學(xué)的方法，篩選出與生存相關(guān)的miRNA，構(gòu)建胃癌患者預(yù)后相關(guān)miRNA 預(yù)測模型。在本研究中，通過下載分析GEO 數(shù)據(jù)庫的GSE93415 芯片，篩選出與預(yù)后生存顯著相關(guān)的5 個miRNA，分別為let-7i-5p、let-7f-5p、miR-708-5p、miR-135b-5p、miR-100-5p。雖然這5 個miRNA 在腫瘤組織中的表達(dá)均低于正常水平，但通過生存分析發(fā)現(xiàn)，胃癌樣本中高表達(dá)hsa-let-7f-5p、hsa-let-7i-5p、hsa-miR-135b-5p和低表達(dá)hsa-miR-100-5p、hsa-miR-708-5p 的患者總體生存狀況較好。利用TCGA 數(shù)據(jù)庫中的患者臨床及生物學(xué)信息，最終構(gòu)建并驗(yàn)證胃癌患者預(yù)后相關(guān)miRNA 預(yù)測模型。該模型的效能在測試集中得到了很好的驗(yàn)證，預(yù)后相關(guān)miRNA 模型的1 年、3 年、5 年生存時間預(yù)測概率AUC 值分別為0.631、0.735、0.750，提示該模型具較好的敏感度和特異度。為了更好地將構(gòu)建的預(yù)后相關(guān)miRNA 模型應(yīng)用于臨床，本研究綜合了預(yù)后相關(guān)miRNA模型評分以及患者年齡、性別和臨床病理分期，建立了一個相對準(zhǔn)確且量化的預(yù)后相關(guān)恩諾圖。通過calibration曲線的驗(yàn)證和C-index 的比較，發(fā)現(xiàn)預(yù)后相關(guān)恩諾圖相對于其他因素具有較高的預(yù)測準(zhǔn)確度。通過DCA，發(fā)現(xiàn)借助于預(yù)后相關(guān)恩諾圖進(jìn)行臨床決策，患者將會受益更多。因此，本研究所構(gòu)建的預(yù)后相關(guān)恩諾圖具有良好的應(yīng)用價值。綜合以上結(jié)果，提示該模型具有一定優(yōu)越性。并且，相較于TNM 分期，該模型可從上游分子生物學(xué)的角度，從多維度更精準(zhǔn)地判斷預(yù)后。

本研究構(gòu)建的胃癌預(yù)后預(yù)測模型對于胃癌患者的預(yù)后判斷有良好的預(yù)測價值，但仍存在一定的局限性。首先，該模型的訓(xùn)練集及測試集均來自TCGA 數(shù)據(jù)庫中的同一隊列。若設(shè)置獨(dú)立的外部驗(yàn)證，尤其是中國胃癌患者的驗(yàn)證，可提升該模型的可信度。其次，TCGA作為常用的公共數(shù)據(jù)庫，其患者以白種人為主，缺少亞洲人，尤其是中國人的臨床數(shù)據(jù)。有待在今后的研究中加入中國胃癌患者的生存預(yù)后數(shù)據(jù)，對該模型進(jìn)行進(jìn)一步的預(yù)測驗(yàn)證。

綜上，本研究通過篩選出的5 個胃癌相關(guān)miRNA，構(gòu)建了可用于胃癌患者生存預(yù)測的miRNA 模型。該模型具良好的敏感度和特異度，一定程度上彌補(bǔ)了形態(tài)學(xué)判斷預(yù)后的不足，有助于指導(dǎo)臨床上制定個體化治療方案。