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    地膚子總皂苷提取工藝的優(yōu)化及其對α-葡萄糖苷酶抑制活性研究

    2021-11-18 07:40:24楊務(wù)彬
    現(xiàn)代中藥研究與實踐 2021年5期
    關(guān)鍵詞:總皂苷液料糖苷酶

    楊務(wù)彬

    (十堰市太和醫(yī)院·湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院 藥學(xué)部,湖北 十堰 442000)

    地膚子源自藜科植物地膚Kochia scoparia(L.)Schrad. 的干燥成熟果實,藥用資源豐富,用于治療皮膚瘙癢、眼睛和泌尿道疾病等[1]。地膚子主要含有三萜皂苷類[2]、揮發(fā)油[3]、黃酮類[4-5]及多糖類[6]等成分。其中皂苷類具有降血糖[7]、抗癌[8]、抗過敏[9]以及抗菌[10]等多種活性。

    地膚子總皂苷是其主要活性部位,多采用大孔樹脂富集純化[11],但對地膚子總皂苷提取工藝優(yōu)化報道較少。本研究以地膚子總皂苷得率為指標,采用Box-Behnken 響應(yīng)面法優(yōu)化地膚子皂苷的超聲提取工藝,并對地膚子總皂苷的α-葡萄糖苷酶抑制活性進行研究,為地膚子總皂苷的分離純化及降糖作用研究提供依據(jù)。

    1 材料

    1.1 儀器

    UV-2550 型紫外-可見分光光度計(日本島津公司);BP211D 型電子分析天平(德國賽多利斯公司);KQ-300DE 型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

    1.2 試藥

    地膚子藥材購自十堰市太和醫(yī)院藥房,經(jīng)十堰市太和醫(yī)院葉方副教授鑒定為藜科植物地膚Kochia scoparia(L.)Schrad. 的干燥成熟果實。地膚子皂苷Ic 對照品(批號:111723-201904,純度≥98%),購自成都植標化純生物技術(shù)有限公司;香草醛(批號:20170310),購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司;阿卡波糖 (批號:C12067892)、α-葡萄糖苷酶(批號:12091896)、對硝基苯-α- D-吡喃葡萄糖苷(PNPG)(批號:C12101893),均購自上海麥克林生化科技有限公司。

    2 方法與結(jié)果

    2.1 對照品溶液的配制

    精密稱取地膚子皂苷對照品3.6 mg,用70%乙醇定容至10 mL 容量瓶中,得到濃度0.36 mg/mL 的對照品貯備液。分別移取對照品貯備液適量,制成不同濃度的對照品溶液。

    2.2 地膚子樣品溶液的制備

    取地膚子藥材粉成碎粉,過80 目篩。準確稱取粉末2 g,添加乙醇溶液適量,超聲提取,濾過,合并濾液。取一定量的濾液,用相應(yīng)體積分數(shù)的乙醇定容至25 mL,即得。

    2.3 總皂苷的測定及標準曲線的繪制

    參照文獻[12]的方法,進行總皂苷的測定及標準曲線的繪制。結(jié)果表明,回歸方程:Y= 1.31X+ 0.167(R2 = 0.999 3), 表 示 地 膚 子 皂 苷 在0.036 ~0.216 mg/mL 內(nèi)具備較好的線性關(guān)系。

    2.4 地膚子總皂苷對α-葡萄糖苷酶抑制活性的研究

    配制碳酸鈉溶液、阿卡波糖溶液、pH 6.8 的磷酸鹽緩沖液、α-葡萄糖苷酶溶液以及PNPG 溶液,將最優(yōu)條件下提取的地膚子總皂苷提取液,用磷酸鹽緩沖溶液稀釋成濃度在0 ~ 3.5 mg/mL 的樣品溶液,以阿卡波糖做對照,并將阿卡波糖稀釋成與樣品濃度一致的溶液。分別制成樣品測定組(加樣品溶液與α-葡萄糖苷酶溶液)、樣品空白組(不加α-葡萄糖苷酶溶液)、陽性對照組(加阿卡波糖與α-葡萄糖苷酶溶液)以及陽性空白組(阿卡波糖溶液),參照鄭麗婷等[13]的方法進行測定。抑制率計算公式為:

    式中:A1為陽性對照組,A2陽性空白組,A3樣品測定組,A4樣品空白組。

    2.5 統(tǒng)計學(xué)方法

    用SPSS20.0 軟件進行數(shù)據(jù)分析,計量資料用均數(shù)±標準差(±s)表示,兩組間比較采用t檢驗。以P<0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2.6 單因素試驗及結(jié)果分析

    2.6.1 乙醇體積分數(shù)對地膚子總皂苷得率的影響按“2.2”項下的方法,準確稱取地膚子藥材7份,各2 g。固定超聲提取時間:30 min,液料比:40 mL/g,選用體積分數(shù)分別是30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%的乙醇,進行地膚子樣品溶液的制備及測定,并計算總皂苷得率,見圖1。乙醇體積分數(shù)為70%時,地膚子總皂苷得率最高;超過70%時,溶劑極性降低,植物細胞結(jié)構(gòu)發(fā)生失水,通透性降低,導(dǎo)致地膚子總皂苷得率下降。因此,選擇70%乙醇作為后續(xù)條件優(yōu)化的參數(shù)。

    圖1 乙醇體積分數(shù)對地膚子總皂苷得率的影響(n = 6)Fig. 1 The extraction rate of total saponins in Kochia scoparia seeds of different ethanol concentration(n = 6)

    2.6.2 超聲時間對地膚子總皂苷得率的影響 按“2.2”項下的方法,準確稱取地膚子藥材6 份,各2 g。乙醇體積分數(shù)為70%,液料比為40 mL/g,分別超聲提取10、20、30、40、50、60 min,進行地膚子樣品溶液的制備及測定,并計算總皂苷得率,結(jié)果見圖2。提取時間增加,地膚子總皂苷的得率升高,提取時間為30 min 時,地膚子總皂苷的得率最大;超聲時間過長,可能導(dǎo)致部分皂苷成分降解;且雜質(zhì)溶出增多,黏度提高,傳質(zhì)過程減慢,降低了地膚子總皂苷的得率。因而選擇超聲提取時間30 min 作為后續(xù)條件優(yōu)化的參數(shù)。

    圖2 提取時間對地膚子總皂苷得率的影響(n = 6)Fig. 2 The extraction rate of total saponins in Kochia scoparia seeds of different extraction time(n = 6)

    2.6.3 液料比對地膚子總皂苷得率的影響 按“2.2”項下的方法,準確稱取地膚子藥材6 份,各2 g。乙醇體積分數(shù):70%,超聲提取時間:30 min,以10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1 (mL/g)的液料比,進行地膚子樣品溶液的制備及測定,并計算總皂苷得率,結(jié)果見圖3。當液料比為40 mL/g時,地膚子總皂苷得率最高。這可能是由于液料比較低時,皂苷不能完全溶解于溶劑,導(dǎo)致總皂苷得率不高;但液料比過大時,溶劑的傳質(zhì)阻力增大,導(dǎo)致總皂苷得率下降。因而選擇40 mL/g 的液料比作為后續(xù)條件優(yōu)化的參數(shù)。

    圖3 液料比對地膚子總皂苷得率的影響(n = 6)Fig. 3 The extraction rate of total saponins in Kochia scoparia seeds of different liquid-solid ratio (n = 6)

    2.7 Box-Behnken 響應(yīng)面法優(yōu)化地膚子總皂苷提取工藝及結(jié)果分析

    2.7.1 Box-Behnken 響應(yīng)面試驗 根據(jù)單因素試驗結(jié)果,以乙醇體積分數(shù)、提取時間、液料比為考察因素,地膚子總皂苷得率為指標,利用Box–Behnken設(shè)計,優(yōu)化地膚子總皂苷的提取工藝。因素及水平見表1,設(shè)計方案及結(jié)果見表2。

    表1 試驗的因素水平表Tab. 1 The factors and levels of experiment

    表2 試驗設(shè)計及結(jié)果(n = 3)Tab. 2 Design and results(n = 3)

    2.7.2 回歸模型的建立及數(shù)據(jù)分析 對試驗結(jié)果進行多元回歸分析,得到二次多項回歸方程為:Y=7.596 + 0.261 25A+ 0.253 75B+ 0.265C+ 0.197 5AB–0.31AC– 0.04BC– 0.951 75A2- 0.441 75B2- 0.269 25C2(R2= 0.981 7,R2Adj= 0.958 1),表明該模型準確性較高,可用于地膚子總皂苷提取得率的預(yù)測分析。

    方差分析見表3,回歸模型的P= 0.000 1 < 0.01,說明所建立的回歸方程模型非常顯著;失擬項P=0.642 1 >0.05,表明該試驗選擇的因素合理。乙醇體積分數(shù)(P= 0.001 2 < 0.01)、提取時間(P= 0.001 4 <0.01)以及液料比(P= 0.001 1 < 0.01)對地膚子總皂苷得率有影響。其中,AB(P= 0.026 9 < 0.05),AC(P= 0.003 2 < 0.01)、A2(P= 0.000 1 < 0.01)、B2(P= 0.000 4 < 0.01)、C2(P= 0.005 9 < 0.01)。

    表3 回歸模型的方差分析Tab. 3 Analysis of variance of regression model

    2.7.3 響應(yīng)面分析 各條件對地膚子總皂苷得率影響的相互作用,見圖4。乙醇體積分數(shù)與提取時間的交互作用曲面陡峭,說明二者的相互作用對地膚子總皂苷得率的影響顯著;乙醇體積分數(shù)與液料比的交互作用的曲面較陡峭,說明二者的交互作用對地膚子總皂苷得率的影響十分明顯;而提取時間與液料比交互作用的曲面平緩,說明二者的交互作用對地膚子總皂苷得率的影響不顯著。交互作用的分析結(jié)果與回歸分析的結(jié)果相一致,進一步表明所建立的模型較合適。

    2.7.4 提取工藝的驗證 按照已建立的回歸模型,預(yù)測地膚子總皂苷的最優(yōu)提取工藝:乙醇體積分數(shù)為71.027%,提取時間為32.916 min,液料比為44.015 mL/g, 此條件下地膚子總皂苷的預(yù)測得率為7.70%。為便于實驗操作,微調(diào)后提取工藝參數(shù)是:乙醇體積分數(shù)為71%,提取時間為33 min,液料比為44 mL/g。按照優(yōu)化后的工藝參數(shù)進行三次超聲提取,得到地膚子總皂苷的得率分別為7.51%、8.01%和7.56%,平均得率為(7.69 ± 0.28)%,與預(yù)測值較為接近。

    2.8 地膚子總皂苷對α-葡萄糖苷酶抑制活性的研究

    地膚子總皂苷提取液對α-葡萄糖苷酶活性的抑制情況見圖5。地膚子總皂苷對α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用存在濃度依賴性,當?shù)啬w子總皂苷提取液濃度在0.1 ~ 3.0 mg/mL 時,隨著濃度的增加,對α-葡萄糖苷酶的抑制率活性逐漸增強;濃度在3.0 ~3.5 mg/mL,抑制率基本不變。表明地膚子總皂苷具備α-葡萄糖苷酶抑制活性。

    圖 4 影響地膚子總皂苷得率的響應(yīng)面圖Fig. 4 Response surface to total saponins value in Kochia scoparia seeds

    圖5 地膚子總皂苷提取液對α-葡萄糖苷酶活性的影響(n = 3)Fig. 5 α-Glucosidase inhibitory activity of total saponins solvents of Kochia scoparia seeds(n = 3)

    3 討論

    預(yù)試驗考察了回流提取、索氏提取以及超聲提取對地膚子總皂苷得率的影響。試驗發(fā)現(xiàn),回流提取地膚子總皂苷得率較低,可能與回流提取溫度高,導(dǎo)致皂苷類成分的分解有關(guān)。索氏提取時,總皂苷得率稍低于超聲提取,且索氏提取不便于工業(yè)化生產(chǎn),故地膚子總皂苷的提取方法選為超聲提取。

    單因素實驗考查了乙醇體積分數(shù)(30% ~90%)、超聲時間(10 ~ 60 min)、液料比(10 ∶1 ~60 ∶1 mL/g)對地膚子總皂苷得率的影響,在考查范圍內(nèi),地膚子總皂苷得率存在先增加后減少的現(xiàn)象。優(yōu)化的地膚子總皂苷最佳提取工藝:乙醇體積分數(shù)為71 %,提取時間為33 min,液料比為44 mL/g。在此工藝下,地膚子總皂苷的得率為(7.69 ± 0.28)%,優(yōu)于夏玉鳳等[14]提取得到的地膚子總皂苷5.76%,表明超聲提取具備一定的可行性。

    4 結(jié)論

    本研究采用響應(yīng)面法與單因素相結(jié)合對地膚子總皂苷超聲提取工藝進行了優(yōu)化,所確定的工藝穩(wěn)定、節(jié)約溶劑、能耗較低,是潛在的工業(yè)化提取新方法。體外α-葡萄糖苷酶抑制活性實驗顯示,最優(yōu)條件下得到的地膚子總皂苷提取液對α-葡萄糖苷酶有一定的抑制活性。但本試驗只進行了地膚子總皂苷提取液的體外抑制α-葡萄糖苷酶實驗,后續(xù)還需要進行體內(nèi)實驗及進一步純化,并進行藥效活性成分追蹤,明確具體成分,為地膚子制劑的開發(fā)及臨床合理應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

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