骨碎補(bǔ)對(duì)東莨菪堿模型小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響

王 迪，陳 雪，蘇 婷，邢淑榮，張 寧，丁立新*，雷 霞*

(1.佳木斯大學(xué) 藥學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007；2. 黑龍江中醫(yī)藥大學(xué) 佳木斯學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007)

學(xué)習(xí)記憶功能障礙是人類衰老進(jìn)程中最普遍的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變引發(fā)的癥狀，目前許多發(fā)達(dá)國(guó)家已進(jìn)入老齡化社會(huì)[1]?，F(xiàn)代研究認(rèn)為認(rèn)知障礙和學(xué)習(xí)記憶能力損傷與海馬膽堿能神經(jīng)元退化，乙酰膽堿（Acetylcholine, ACh）合成減少，分解增加，膽堿脂酶（Acetylcholinesterase, AChE）和膽堿乙?；福–holine acetyl transferase, ChAT）活性密切相關(guān)[2-4]。經(jīng)美國(guó)FDA 批準(zhǔn)的抗阿爾茨海默癥藥物以AChE 抑制劑為主，“膽堿能假說(shuō)”仍然處于認(rèn)知障礙發(fā)生機(jī)制的主流地位。AChE 抑制劑通過(guò)減少ACh 的分解來(lái)增強(qiáng)認(rèn)知功能，但通常會(huì)產(chǎn)生諸如惡心、嘔吐和腹瀉等副作用。目前尋找毒副作用小，且能增強(qiáng)膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)功能的藥物對(duì)開(kāi)發(fā)改善學(xué)習(xí)記憶功能障礙新藥具有重要意義[5]。

研究發(fā)現(xiàn)，植物雌激素通過(guò)激動(dòng)腦源性雌激素受體ERβ 從而增強(qiáng)膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)功能，改善學(xué)習(xí)記憶功能障礙[6-7]，課題組前期從補(bǔ)腎中藥中篩選抗學(xué)習(xí)記憶障礙藥物，發(fā)現(xiàn)中藥骨碎補(bǔ)能夠增強(qiáng)小鼠學(xué)習(xí)記憶功能。中藥骨碎補(bǔ)為經(jīng)典補(bǔ)腎中藥，含有大量植物雌激素成分，具有擬雌激素樣作用。那么，骨碎補(bǔ)是否通過(guò)激活腦ERβ 改善膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)功能，從而增強(qiáng)學(xué)習(xí)記憶功能，尚未有明確的結(jié)論。本實(shí)驗(yàn)觀察骨碎補(bǔ)對(duì)小鼠海馬區(qū)雌激素受體α（ERα）、雌激素受體β（ERβ）、卵泡刺激素受體（FSHR）以及黃體生成素受體（LHR）的表達(dá)，ACh 含量、ChAT 及AChE 活性，從腦源性雌激素受體角度研究骨碎補(bǔ)對(duì)小鼠學(xué)習(xí)記憶功能障礙的影響，為骨碎補(bǔ)新藥開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF 級(jí)昆明雄性小鼠，體質(zhì)量為（25 ± 2）g，購(gòu)自長(zhǎng)生生物技術(shù)股份有限公司，合格證號(hào)：SCXK（遼）2019-0001。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物按國(guó)際實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物倫理行為準(zhǔn)則“Guide for the Care and Use of Laboratory Animals”實(shí)施操作[8]。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥品及試劑

骨碎補(bǔ)購(gòu)自北京同仁堂藥店（哈爾濱總店），經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)佳木斯學(xué)院陳效忠副教授鑒定為水龍骨科植物槲蕨Drynaria fortunei（Kunze）J.Sm的干燥根莖。ACh 試劑盒、AChE 試劑盒、ChAT 試劑盒（批號(hào)：A105-1、A024、A079-1）均購(gòu)于南京建成生物工程研究所；抗腦衰膠囊（KN15112502，石家莊四藥有限公司）；鹽酸多奈哌齊（S60449，上海源葉生物科技有限公司）；Anti-ERβ（bs-0116R，北京博奧森生物技術(shù)有限公司）；ER 阻斷劑（ICI182780，TOCRIS 公司）；兔抗ERα 多克隆抗體（8644T，Cell Signaling）。

1.3 方法

1.3.1 分組及給藥 昆明小鼠分為空白組、東莨菪堿模型組、抗腦衰膠囊組、鹽酸多奈哌齊組、骨碎補(bǔ)組、骨碎補(bǔ)+ ICI182780 組。根據(jù)2020 年版《中國(guó)藥典》 （一部）可知骨碎補(bǔ)的用法用量為每日3 ～ 9 g，通過(guò)查閱文獻(xiàn)及其它補(bǔ)腎中藥資料發(fā)現(xiàn)骨碎補(bǔ)在不同癥狀中用量不同，按人臨床藥量計(jì)算最終確定每天灌胃給藥0.975 g/kg，同時(shí)，抗腦衰膠囊組（585 mg/kg）、鹽酸多奈哌齊組（0.65 mg/kg）、骨碎補(bǔ)+ ICI182780 組腹腔注射ICI182780（0.072 mg/kg）后給予骨碎補(bǔ)?？瞻捉M給予生理鹽水，其余組每天腹腔注射3 mg/kg 東莨菪堿。

1.3.2 骨碎補(bǔ)水煎液提取 骨碎補(bǔ)藥材100 g，加水回流提取1.5 h （10 倍），過(guò)濾后再次煎煮1 h （8倍），合并濃縮至1 g/mL，即得。

1.3.3 行為學(xué)測(cè)試 Morris 水迷宮（定位航行、空間探索）分析小鼠學(xué)習(xí)記憶能力；新物體識(shí)別：對(duì)熟悉物體和新物體的探究時(shí)間分析小鼠記憶能力。

1.3.4 HE 染色觀察小鼠海馬病理學(xué)變化 行為學(xué)測(cè)試后取海馬用福爾馬林（10%）固定，石蠟包埋后切片，觀察小鼠海馬病理學(xué)變化。

1.3.5 免疫組化法檢測(cè)骨碎補(bǔ)對(duì)東莨菪堿模型小鼠的影響 取海馬放入福爾馬林（10%）中固定、石蠟包埋切片，血清封閉，滴加適當(dāng)比例的一抗、二抗孵育、沖洗。中性樹(shù)質(zhì)膠封片，顯微鏡下觀察ERβ、ERα、FSHR、LHR 在小鼠海馬中的表達(dá)情況。

1.3.6 ELISA 檢測(cè)東莨菪堿模型小鼠中樞膽堿系統(tǒng)水平 按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作（ACh 試劑盒、AChE試劑盒、ChAT 試劑盒）。

1.3.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 用SPSS 18.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用方差分析。以P< 0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 骨碎補(bǔ)對(duì)東莨菪堿模型小鼠Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)的影響

與空白組相比，模型組小鼠潛伏期延長(zhǎng)（P<0.01），穿越平臺(tái)次數(shù)和有效區(qū)停留時(shí)間減少（P<0.01）；與模型組相比，抗腦衰膠囊組、鹽酸多奈哌齊組、骨碎補(bǔ)組小鼠潛伏期縮短（P< 0.01），穿越平臺(tái)次數(shù)和有效區(qū)停留時(shí)間增加（P< 0.01）；與骨碎補(bǔ)組相比，骨碎補(bǔ)+ ICI182780 組小鼠潛伏期延長(zhǎng)（P<0.01），穿越平臺(tái)次數(shù)和有效區(qū)域停留時(shí)間減少（P<0.01），見(jiàn)圖1。

圖1 各組小鼠Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較（x ± s，n = 15）Fig. 1 Comparison of the results of the morris water maze in each group of mice（x ± s，n = 15）

2.2 骨碎補(bǔ)對(duì)東莨菪堿模型小鼠新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)的影響

與空白組相比，模型組小鼠新物體識(shí)別指數(shù)減?。≒< 0.01）；與模型組相比，抗腦衰膠囊組、鹽酸多奈哌齊組、骨碎補(bǔ)組小鼠新物體識(shí)別指數(shù)增加（P<0.01）；與骨碎補(bǔ)相比，骨碎補(bǔ)+ ICI182780 組小鼠新物體識(shí)別指數(shù)減少（P< 0.01），見(jiàn)圖2。

圖2 各組小鼠新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較（x ± s，n = 15）Fig. 2 Comparison of experimental results of new object recognition in each group of mice（x ± s，n = 15）

2.3 各組小鼠海馬區(qū)HE 染色觀察

空白組小鼠海馬區(qū)神經(jīng)元數(shù)量多、結(jié)構(gòu)清晰、分布均勻、沒(méi)有核固縮；模型組小鼠海馬區(qū)神經(jīng)元數(shù)量少、結(jié)構(gòu)缺失、有核固縮現(xiàn)象；抗腦衰膠囊組、鹽酸多奈哌齊組、骨碎補(bǔ)組小鼠海馬區(qū)神經(jīng)元數(shù)量較多、結(jié)構(gòu)較為清晰，沒(méi)有明顯核固縮；骨碎補(bǔ)+ICI182780 組小鼠海馬神經(jīng)元數(shù)量少，細(xì)胞小，有核固縮，見(jiàn)圖3。

圖3 各組小鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)（×200）Fig. 3 Morphology of hippocampal nerve cells in each group of mice（×200）

2.4 免疫組化檢測(cè)小鼠海馬中ERβ、ERα、FSHR、LHR 表達(dá)情況

與空白組相比，模型組小鼠雌激素受體表達(dá)減少（P< 0.01）；與模型組相比，抗腦衰膠囊組、鹽酸多奈哌齊組、骨碎補(bǔ)組小鼠雌激素受體表達(dá)增加（P<0.01）；與骨碎補(bǔ)組相比，骨碎補(bǔ)+ ICI182780 組小鼠雌激素受體表達(dá)減少（P< 0.01 或P< 0.05），且小鼠海馬中ERβ 的表達(dá)高于ERα，見(jiàn)表1、圖4-圖7。

圖4 各組小鼠海馬ERβ 表達(dá)（200×）Fig. 4 Expression of ERβ in the hippocampus of each group of mice（200×）

圖5 各組小鼠海馬ERα 表達(dá)（200×）Fig. 5 Expression of ERα in the hippocampus of each group of mice（200×）

圖6 各組小鼠海馬FSHR 表達(dá)（200×）Fig. 6 Expression of FSHR in the hippocampus of each group of mice （200×）

圖7 各組小鼠海馬LHR 表達(dá)（200×）Fig. 7 Expression of LHR in the hippocampus of each group of mice （200×）

表1 各組小鼠海馬區(qū)ERβ、ERα、FSHR、LHR 的表達(dá)（OD 值）Tab. 1 Expression of ERβ, ERα, FSHR, LHR in the hippocampus of each group of mice（OD Value )

2.5 海馬中ACh 含量和AChE、ChAT 活性

與空白組相比，模型組小鼠海馬ACh 含量降低（P< 0.01），AChE 活性升高（P< 0.01），ChAT 的活性降低（P< 0.01）；與模型組相比，抗腦衰膠囊組、鹽酸多奈哌齊組、骨碎補(bǔ)組小鼠海馬ACh 含量升高（P< 0.01），AChE 活 性 降 低（P< 0.01），ChAT活性升高（P< 0.01）；與骨碎補(bǔ)組相比，骨碎補(bǔ)+ICI182780 組小鼠海馬中ACh 含量降低（P< 0.05），AChE 活性升高（P< 0.01），ChAT 活性降低（P<0.05），見(jiàn)圖8。

圖8 各組小鼠海馬中ACh（A）含量及AChE（B）、ChAT（C）活性比較（x ± s，n = 15）Fig. 8 Comparison of ACh (A) content and AChE (B) and ChAT (C)activities in the hippocampus of each group of mice（x ± s，n = 15）

3 討論

東莨菪堿是膽堿的M 受體阻斷劑，拮抗M 受體與乙酰膽堿結(jié)合，阻斷乙酰膽堿對(duì)M 受體的激動(dòng)作用[9-11]。正常情況下，ACh 被膽堿能神經(jīng)元所利用，其合成途徑和代謝途徑關(guān)鍵酶ChAT 和AChE 共同維持腦內(nèi)ACh 平衡，若腦內(nèi)AChE 水平升高，ACh、ChAT 水平降低，損傷學(xué)習(xí)記憶能力[12]。本實(shí)驗(yàn)中動(dòng)物行為學(xué)測(cè)試結(jié)果顯示，東莨菪堿模型小鼠Morris 水迷宮測(cè)試中潛伏期增加、穿越平臺(tái)次數(shù)及有效區(qū)停留時(shí)間降低，新物體識(shí)別指數(shù)減小。HE 染色結(jié)果顯示模型組小鼠海馬區(qū)神經(jīng)元數(shù)量減少，細(xì)胞縮小。上述結(jié)果表明東莨菪堿可誘發(fā)小鼠明顯的學(xué)習(xí)記憶障礙。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)東莨菪堿誘導(dǎo)的小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙模型給予骨碎補(bǔ)進(jìn)行干預(yù)，發(fā)現(xiàn)骨碎補(bǔ)可提高小鼠海馬中ERβ 的表達(dá)。臨床上常用人工合成的雌激素替代治療，然而不良反應(yīng)（如：生殖系統(tǒng)腫瘤、乳腺癌）影響其長(zhǎng)期使用。植物雌激素與內(nèi)源性雌激素結(jié)構(gòu)相似，既能發(fā)揮對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的保護(hù)作用，又能避免不良反應(yīng)的發(fā)生[13]，其通過(guò)海馬ERβ 受體發(fā)揮作用，對(duì)于主要表達(dá)于下丘腦的ERα 受體影響較小。研究發(fā)現(xiàn)多數(shù)植物雌激素對(duì)ERβ 的親和力高于ERα[14]。免疫組化結(jié)果顯示給予骨碎補(bǔ)后東莨菪堿模型小鼠ERβ的表達(dá)高于ERα，而在使用ICI182780 拮抗劑后ERβ的表達(dá)少于給藥組，說(shuō)明骨碎補(bǔ)具有一定的雌激素樣作用，可特異性地激動(dòng)ERβ，對(duì)海馬神經(jīng)元具有保護(hù)作用。

植物雌激素可通過(guò)促進(jìn)神經(jīng)生長(zhǎng)因子（NGF）及其受體的表達(dá)，促進(jìn)ACh 釋放，調(diào)節(jié)膽堿能系統(tǒng)介導(dǎo)認(rèn)知障礙過(guò)程[15]。雌激素與神經(jīng)細(xì)胞核膜上ER結(jié)合通過(guò)促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄發(fā)揮作用。研究表明，ER 與NGF 的受體在膽堿能神經(jīng)元內(nèi)有共表達(dá)[16-18]。在動(dòng)物模型中，雌激素影響海馬依賴性的學(xué)習(xí)記憶能力，該作用與海馬中ACh 釋放增加有關(guān)[19]。長(zhǎng)期剝奪雌激素會(huì)降低海馬膽堿能的功能狀態(tài)，而給予植物雌激素則會(huì)增強(qiáng)海馬膽堿能的功能狀態(tài)。本研究發(fā)現(xiàn)，給予骨碎補(bǔ)能夠提高小鼠海馬中ChAT 活性、抑制AChE 活性、增加ACh 含量，而給予ICI182780 拮抗劑后可逆轉(zhuǎn)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，表明骨碎補(bǔ)通過(guò)調(diào)控ER信號(hào)通路可改善東莨菪堿模型小鼠膽堿能系統(tǒng)功能。

4 結(jié)論

骨碎補(bǔ)改善學(xué)習(xí)記憶能力機(jī)制可能是通過(guò)調(diào)控東莨菪堿模型小鼠腦源性雌激素ERβ 的表達(dá)，激活ER通路，促進(jìn)ACh、ChAT 合成和抑制AChE 分解，增強(qiáng)海馬膽堿能系統(tǒng)功能，從而提高學(xué)習(xí)記憶功能。骨碎補(bǔ)可作為臨床改善學(xué)習(xí)記憶功能障礙的備選藥物。