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    5 種烏頭屬藥用植物種子的顯微鑒別研究

    2021-11-18 07:40:28尹碧薇郭云剛池秀蓮陳靈麗李漣漪李文淵崔光紅李曉琳
    現(xiàn)代中藥研究與實踐 2021年5期
    關(guān)鍵詞:亞屬鐵棒種皮

    尹碧薇,郭云剛,池秀蓮,陳靈麗,李漣漪,程 蒙,李文淵,葛 慧,趙 鑫,崔光紅*,李曉琳*

    (1.中國中醫(yī)科學(xué)院中藥資源中心 道地藥材國家重點實驗室培育基地,北京 100700;2.廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院,廣東 廣州 510006;3.中國科學(xué)院昆明植物研究所,云南 昆明 650201;4.青海大學(xué) 醫(yī)學(xué)院中藏藥研究中心,青海 西寧 810001;5.甘肅中醫(yī)藥大學(xué) 和政藥用植物園,甘肅 臨夏 731100)

    烏頭屬Aconitum植物為一年至多年生草本植物,在全世界范圍內(nèi)約有350 種,我國有200 多種[1],分別屬于烏頭亞屬、牛扁亞屬和露蕊烏頭亞屬。其中,烏頭亞屬品種最豐富,共147 種,牛扁亞屬共19 種,露蕊烏頭亞屬僅1 種,即露蕊烏頭[2]。該屬植物在我國有兩千多年的藥用歷史,約有76 種植物可供藥用[3],如川烏和附子來源于烏頭Aconitum carmichaeliiDebx.的母根和子根[4];關(guān)白附來源于黃花烏頭Aconitumcoreanum(Levl.) Rapaics 的塊根[5];草烏、制草烏、草烏葉均來源于北烏頭Aconitum kusnezoffiiReichb.[6]。它們多具有祛風(fēng)除濕、溫經(jīng)止痛之功效,廣泛用于風(fēng)寒溫痹、關(guān)節(jié)疼痛、心腹冷痛、寒疝作痛、麻醉止痛等[7]。此外,烏頭屬植物的花大多為藍(lán)紫色,是重要的觀賞花卉[8]。

    種子是藥材生產(chǎn)的源頭,種子的真?zhèn)蝺?yōu)劣直接關(guān)系到藥材的質(zhì)量。烏頭屬植物種子外觀較為相似,易發(fā)生種質(zhì)混雜,而針對該屬植物種子外觀、顯微鑒別特征的研究也極為貧乏。如:CAPPELLETTI 等[9]對歐洲烏頭屬植物的種子進行了掃描電鏡觀察,討論了橫膜翅的產(chǎn)生對種子形態(tài)性狀演化及其生態(tài)適應(yīng)意義??缀捷x等[10]首次對我國烏頭屬57 個種及5 個變種的種子外觀形態(tài)進行了掃描電鏡觀察,探討了烏頭屬種子形態(tài)的系統(tǒng)學(xué)意義。在顯微結(jié)構(gòu)研究方面,僅有烏頭[11]、鐵棒錘和伏毛鐵棒錘[12]種子顯微鑒別特征的報道。隨著烏頭類藥材市場需求的不斷增加,人工馴化及栽培顯得日益迫切,而種子的鑒別對于從源頭保障烏頭類藥材質(zhì)量具有重要意義。為此,本研究考察了烏頭屬3 個亞屬的5 種易混淆藥用植物種子的性狀特征、微性狀特征和顯微特征,以期為烏頭屬種子的鑒別、質(zhì)量評價及烏頭屬植物的系統(tǒng)分類研究提供科學(xué)依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料與儀器

    烏頭、顯柱烏頭Aconitum stylosumStapf 種子采自云南省麗江市玉龍縣魯?shù)猷l(xiāng),烏頭種子由中國中醫(yī)科學(xué)院中藥資源中心崔光紅研究員鑒定;顯柱烏頭種子由云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院高山經(jīng)濟植物研究所楊少華研究員鑒定;鐵棒錘AconitumpendulumBusch、高烏頭AconitumsinomontanumNakai 種子采自甘肅中醫(yī)藥大學(xué)和政藥用植物園,由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)杜弢教授鑒定;露蕊烏頭AconitumgymnandrumMaxim.種子采自青海省黃南藏族自治州同仁縣,由青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院楊仕兵副教授鑒定。采集的種子去除雜質(zhì)后于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

    VHX-6000 型體視顯微鏡(日本基恩士公司);Hitachi S-3400 型掃描電鏡(日本日立公司);MICROM HM325 型轉(zhuǎn)輪式切片機(德國賽默飛世爾科技公司);YD-6L 型生物組織包埋機(浙江金華市益迪醫(yī)療設(shè)備有限公司);OLYMPUS BX53 型顯微鏡(日本奧林巴斯株式會社)等。

    乙醇、二甲苯、藏紅T 生物染色劑(批號:20170411)、固綠FCF 染色劑(批號:20181221)(國藥集團化學(xué)試劑有限公司)。

    1.2 方法

    種子大小采用游標(biāo)卡尺測量,10 個重復(fù)。外觀及解剖結(jié)構(gòu)采用體視顯微鏡觀察,對種子的外觀性狀、顏色、形態(tài)及解剖結(jié)構(gòu)等進行記錄并拍照。

    顯微結(jié)構(gòu)研究先采用掃描電鏡進行觀察:將干燥后的種子用導(dǎo)電雙面膠固定在樣品臺上,干燥、噴金處理后在放大35 倍、200 倍和1 000 倍下,對種子的整體形態(tài)、表面附屬物形態(tài)及表皮紋飾進行觀察和拍照。然后再用石蠟切片法進行制片觀察:將種子在FAA 固定液中固定15 d,依次用70%、80%、90% 、95%、100%乙醇溶液逐級脫水,每次2 h。無水乙醇-二甲苯(1 ∶1)1 h、二甲苯1 h 浸泡至種子透明。浸蠟時間24 h,切片厚度為10 μm。切好的蠟片在展片儀上展開,并于50 ℃烤干。在二甲苯中脫蠟、梯度復(fù)水,番紅染色2 h,經(jīng)系列乙醇逐級脫水后放入固綠溶液中染色,乙醇洗滌后二甲苯透明封片,在顯微鏡下觀察、拍照。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 性狀鑒別

    烏頭屬種子的共同性狀特征是倒卵狀三棱形,灰褐色至褐色,頂端較寬且平,基部具不明顯的種臍;內(nèi)外種皮膜質(zhì),胚乳豐富,乳白色,含油脂,胚細(xì)小,魚雷形,乳黃色,埋生于種仁基部,見圖1。

    烏頭種子長:3.42 ~ 4.53 mm,寬:1.65 ~ 2.61 mm,厚:1.04 ~ 1.52 mm,千粒重:2.35 g;具3 條縱棱,腹棱延伸成較寬的翼狀膜質(zhì)翅;背部具波狀橫膜翅,兩端延伸至兩側(cè)面,皺縮,翅上具縱脈紋,見圖1:A1-A4。

    顯柱烏頭種子與烏頭極為相似,但較大,長:4.20 ~5.79 mm,寬:2.35 ~ 3.34 mm,厚:1.22 ~ 2.06 mm,千粒重:3.40 g;具3 條縱棱,腹棱延伸成翼狀膜質(zhì)翅,背部橫膜翅較短,見圖1:B1-B4。

    鐵棒錘種子較烏頭和顯柱烏頭略小,長:2.89 ~3.87 mm,寬:2.03 ~ 2.63 mm,厚:1.24 ~ 1.86 mm,千粒重:1.87 g;3 條縱棱延伸成翼狀膜質(zhì)翅,無皺縮,表面光滑,無明顯的橫膜翅或橫向鱗狀翅,見圖1:C1-C4。

    高烏頭種子略小,長:2.42 ~ 3.35 mm,寬:1.91 ~2.29 mm,厚:1.53 ~ 1.89 mm,千粒重:3.29 g;具1 條縱棱,沿棱無翅,背部密生較窄的橫向鱗狀翅,見圖1:D1-D4。

    露蕊烏頭為露蕊烏頭亞屬唯一的種,種子顯著小于其它烏頭屬種子,長:1.96 ~ 2.59 mm,寬:1.20 ~1.53 mm,厚:0.70 ~ 1.32 mm,千粒重:1.06 g;表面密生橫膜翅,較窄,見圖1:E1-E4。

    圖1 5 種烏頭屬種子的形態(tài)及解剖結(jié)構(gòu)Fig. 1 Microstructures and anatomical structure of 5 Aconitum seeds

    2.2 顯微鑒別

    2.2.1 微性狀特征 在放大倍數(shù)為35 倍的掃描電鏡下觀察到烏頭種子的翼狀翅較寬,橫膜翅上具縱脈紋;顯柱烏頭種子的翼狀翅表面具不規(guī)則網(wǎng)格狀脈紋,橫膜翅較窄;鐵棒錘種子的表面較平滑,形成長梭形紋理;高烏頭種子的鱗狀翅較窄,具縱脈紋;露蕊烏頭種子的橫膜翅較窄,見圖2。

    圖2 5 種烏頭屬種子翅的掃描電鏡圖Fig. 2 Scanning electron microscope images of seed wings of 5 Aconitum seeds

    在放大倍數(shù)為1 000 倍的掃描電鏡下觀察到烏頭種子的表皮細(xì)胞呈長方形,表面具有較多瘤狀突起;顯柱烏頭種子的表皮細(xì)胞呈長方形,密生瘤狀突起;鐵棒錘種子的表皮細(xì)胞呈長梭形,表面具有較多瘤狀突起;高烏頭種子的表皮細(xì)胞呈長方形,表面幾乎無瘤狀突起;露蕊烏頭種子的表皮細(xì)胞呈梭形或橢圓形,形成網(wǎng)狀凹陷,見圖3。

    圖3 5 種烏頭屬種子表皮紋飾的掃描電鏡圖Fig. 3 Scanning electron microscope images of seed epidermal ornamentation of 5 Aconitum seeds

    2.2.2 切面顯微特征 5 種烏頭屬種子非常相似,均由外種皮、內(nèi)種皮、胚乳和胚四部分組成。外種皮細(xì)胞為一列長方形厚壁細(xì)胞,細(xì)胞壁四面增厚,外壁最厚,并部分延伸成翅狀,外壁表面有乳頭狀小突起;內(nèi)種皮為啞鈴狀支柱細(xì)胞;基部有種臍細(xì)胞;胚乳為長方形的薄壁細(xì)胞,較大,徑向排列,靠近中央細(xì)胞較小,內(nèi)含脂肪油滴和糊粉粒;胚細(xì)胞較小,多角形,排列緊密,內(nèi)含脂肪油滴,見圖4。

    烏頭屬種子在外種皮結(jié)構(gòu)、內(nèi)種皮支柱細(xì)胞間隙大小、脂肪油滴數(shù)目等略有不同,見圖4。烏頭種子腹棱處外種皮延伸成較寬的翅,背部外種皮延伸成5 ~ 8 個橫向膜質(zhì)翅,內(nèi)種皮細(xì)胞下有一層薄壁細(xì)胞;顯柱烏頭種子外種皮細(xì)胞外壁較薄,約為5 μm,有乳頭狀小突起,腹棱翅略窄,背部橫向膜質(zhì)翅較多;鐵棒錘種子3 條縱棱外種皮細(xì)胞外壁延伸成翅,其余部分無翅,有乳頭狀小突起,內(nèi)種皮的支柱細(xì)胞狹長,排列緊密,胚乳和胚細(xì)胞中脂肪油滴較多;高烏頭種子1 條縱棱無翅,但背面和側(cè)面的外種皮細(xì)胞延伸成多個小翅,內(nèi)種皮支柱細(xì)胞間隙較大;露蕊烏頭種子外種皮細(xì)胞外壁較薄,約為5 μm,密生較小的橫膜翅,內(nèi)外種皮間有1 ~ 2 層狹長的薄壁細(xì)胞,內(nèi)種皮下有一層較小薄壁細(xì)胞,頂端為多層。

    圖4 5 種烏頭屬種子的顯微結(jié)構(gòu)Fig. 4 Seed microstructures of 5 Aconitum seeds

    3 討論

    本研究建立了5 種烏頭屬植物種子的鑒別方法。由于種子形態(tài)性狀相對穩(wěn)定,常作為屬下劃分的重要依據(jù)[13-14],因此,露蕊烏頭和高烏頭種子很容易與烏頭亞屬的3 種植物種子鑒別。單種屬的露蕊烏頭種子不僅顯著小于其它烏頭屬植物種子,而且其表皮細(xì)胞性狀和內(nèi)外種皮間的狹長薄壁細(xì)胞均可作為其鑒別特征。牛扁亞屬的高烏頭種子大小和千粒重與烏頭亞屬的3 種植物種子區(qū)別不明顯,以種子密生橫向鱗狀翅,表皮細(xì)胞光滑、無瘤狀突起為其主要特征。烏頭亞屬的烏頭、顯柱烏頭和鐵棒錘種子共同的特征是均具3 條縱棱,縱棱延伸成翼狀膜質(zhì)翅[10]。但烏頭種子的翼狀膜質(zhì)翅較大,顯柱烏頭種子明顯大于烏頭種子,背部的橫向膜質(zhì)翅更多,鐵棒錘種子3 條縱棱均延伸成翼狀膜質(zhì)翅,無皺縮,表面光滑。在切面顯微結(jié)構(gòu)上,發(fā)現(xiàn)鐵棒錘內(nèi)種皮的支柱細(xì)胞狹長,排列緊密,這一結(jié)果豐富了鐵棒錘種子形態(tài)鑒別特征[12]。

    4 結(jié)論

    5 種烏頭屬種子的鑒別特征為:烏頭種子腹翅寬大,背部橫向膜質(zhì)翅有5 ~ 8 個;顯柱烏頭種子大,背翅多;鐵棒錘種子無明顯的橫膜翅或橫向鱗狀翅,內(nèi)種皮的支柱細(xì)胞狹長;高烏頭種子密生橫向鱗狀翅,表皮細(xì)胞光滑、無瘤狀突起;露蕊烏頭種子小,表面密生較窄橫膜翅,表皮細(xì)胞形成網(wǎng)狀凹陷,內(nèi)外種皮間有薄壁細(xì)胞層。上述鑒別特征可為烏頭屬種子鑒別提供快速、準(zhǔn)確的方法,從生產(chǎn)的源頭——種源上解決種質(zhì)混雜問題,有利于藥材質(zhì)量控制,為烏頭屬植物的人工馴化和繁育提供技術(shù)支撐,同時也可為烏頭屬植物的分類和系統(tǒng)學(xué)研究提供依據(jù)。

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