飛蛾藤不同藥用部位多種成分含量的比較

胡靜 楊媛媛 任慧 崔小敏 李寧 曲彤 陳志永

中圖分類號 R284 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2021）24-2970-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2021.24.05

摘 要 目的：建立同時測定飛蛾藤不同藥用部位（莖、嫩枝、葉）中東莨菪苷、東莨菪內(nèi)酯、綠原酸、隱綠原酸、新綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C等8種成分含量的方法，并進行比較。方法：采用高效液相色譜（HPLC）法。以Agilent TC-C18為色譜柱，以乙腈-0.1%磷酸溶液為流動相進行梯度洗脫，流速為1.0 mL/min，柱溫為30 ℃，檢測波長為345 nm，進樣量為10 μL。比較飛蛾藤莖、嫩枝、葉中上述成分的含量并采用Markerlynx XS軟件進行主成分分析。結(jié)果：東莨菪苷、東莨菪內(nèi)酯、綠原酸、隱綠原酸、新綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C檢測質(zhì)量濃度的線性范圍分別為0.076 4～7.64、0.062 8～6.28、0.090 8～9.08、0.080 0～8.00、0.057 6～5.76、0.094 4～9.44、0.086 0～8.60、0.078 8～7.88 mg/L（r均大于0.999）;精密度、穩(wěn)定性（24 h）、重復(fù)性試驗的RSD均小于2.0%;平均加樣回收率分別為99.71%（RSD=1.36%，n=6）、100.39%（RSD=1.76%，n=6）、99.20%（RSD=1.75%，n=6）、100.04%（RSD=2.63%，n=6）、98.57%（RSD=1.99%，n=6）、99.68%（RSD=1.84%，n=6）、99.90%（RSD=1.88%，n=6）、99.76%（RSD=1.47%，n=6）。上述8種成分在莖中的平均含量分別為9.725 3、1.286 5、7.271 3、1.347 6、0.997 7、0.710 9、0.656 3、0.364 7 mg/g，在嫩枝中分別為0.690 3、0.411 7、4.394 3、0.639 6、0.531 3、1.392 7、0.989 1、1.129 2 mg/g，在葉中分別為1.195 1、0.691 1、27.952 9、6.173 4、1.405 1、0.549 7、0.288 8、0.794 2 mg/g。主成分分析結(jié)果顯示，飛蛾藤不同部位可分為3類，其中飛蛾藤莖大部分聚集在得分圖的第1象限，嫩枝聚集在第3象限，葉聚集在第4象限。結(jié)論：所建方法簡便、重復(fù)性好，可用于飛蛾藤不同藥用部位中東莨菪苷等8種成分的含量測定。飛蛾藤葉中新綠原酸、綠原酸和隱綠原酸的平均含量相對較高，嫩枝中異綠原酸B、異綠原酸A和異綠原酸C的平均含量相對較高，莖中東莨菪苷、東莨菪內(nèi)酯的平均含量相對較高。

關(guān)鍵詞 飛蛾藤;莖;嫩枝;葉;含量測定;高效液相色譜法

Comparison of the Contents of Multiple Constituents in Different Medicinal Parts of Porana racemosa

HU Jing1，YANG Yuanyuan2，REN Hui1，CUI Xiaomin1，LI Ning1，QU Tong1，CHEN Zhiyong1（1. Shaanxi Academy of Traditional Chinese Medicine， Xi’an 710061， China; 2. Xi’an Institute for Food and Drug Control， Xi’an 710054， China）

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To establish a method for the simultaneous determination of eight constituents， such as scopolin， scopoletin， chlorogenic acid， cryptochlorogenic acid， neochlorogenic acid， isochlorogenic acid A， isochlorogenic acid B， and isochlorogenic acid C， in different medicinal parts （stems， twigs and leaves） of Porana racemosa， and to compare the contents of eight constituents. METHODS： HPLC method was adopted. The determination was performed on Agilent TC-C18 column with mobile phase consisted of acetonitrile-0.1% phosphate acid （gradient elution） at the flow rate of 1.0 mL/min. The column temperature was 30 ℃， and the detection wavelength was set at 345 nm. The sample size was 10 μL. The contents of above constituents in stems， twigs and leaves of P. racemosa were compared， and the principal component analysis was carried out by Markerlynx XS software. RESULTS： The linear range of scopolin， scopoletin， chlorogenic acid， cryptochlorogenic acid， neochlorogenic acid， isochlorogenic acid A， isochlorogenic acid B， and isochlorogenic acid C were 0.076 4- 7.64， 0.062 8-6.28， 0.090 8-9.08， 0.080 0-8.00， 0.057 6-5.76， 0.094 4-9.44， 0.086 0-8.60， 0.078 8-7.88 mg/L， respectively （all r>0.999）. RSDs of precision， stability （24 h） and reproducibility tests were all lower than 2.0%. The average recoveries were 99.71% （RSD=1.36%，n=6）， 100.39%（RSD=1.76%，n=6）， 99.20%（RSD=1.75%，n=6）， 100.04%（RSD=2.63%，n=6）， 98.57%（RSD=1.99%，n=6）， 99.68%（RSD=1.84%，n=6）， 99.90%（RSD=1.88%，n=6）， 99.76%（RSD=1.47%，n=6）， respectively. The average contents of above eight constituents were 9.725 3， 1.286 5， 7.271 3， 1.347 6， 0.997 7， 0.710 9， 0.656 3， 0.364 7 mg/g in stems; those were 0.690 3， 0.411 7， 4.394 3， 0.639 6， 0.531 3， 1.392 7， 0.989 1， 1.129 2 mg/g in twigs; those were 1.195 1， 0.691 1， 27.952 9， 6.173 4， 1.405 1， 0.549 7， 0.288 8， 0.794 2 mg/g in leaves， respectively. The results of principal component analysis showed that different parts of P. racemosa could be divided into 3 categories. Among them， most of the stems of P. racemosa gathered in the first quadrant of score plot， all the twigs gathered in the third quadrant， and all the leaves gathered in the fourth quadrant. CONCLUSIONS： Established method is simple and reproducible， and can be used for the determination of 8 constituents in different medicinal parts of P. racemosa. The average contents of neochlorogenic acid， chlorogenic acid and cryptochlorogenic acid in the leaves of P. racemosa are relatively high; the contents of isochlorogenic acid B， isochlorogenic acid A and isochlorogenic acid C in the twigs are relatively high; the average contents of scopolin and scopoletin in the stems are also relatively high.

KEYWORDS? ?Porana racemosa; Stems; Twigs; Leaves; Content determination; HPLC

基金項目：國家自然科學(xué)基金資助項目（No.81973419，No.81603264）;陜西省中醫(yī)藥管理局委托辦事經(jīng)費任務(wù)（No.2021-ZZ- JC033，No.2021-PY-003）

主管藥師，碩士。研究方向：中藥質(zhì)量控制與活性成分。電話：029-85395696。E-mail：huj668@163.com

通信作者：副研究員，博士。研究方向：中藥質(zhì)量控制與活性成分。電話：029-85395696。E-mail：chenzy0612@163.com

飛蛾藤為旋花科飛蛾藤屬植物飛蛾藤Porana racemosa Roxb.的全草或根，主產(chǎn)于我國云南并廣泛分布于長江以南各省及陜西、甘肅等地[1]。飛蛾藤藥材的藥用記載較少且多為民間用藥，僅《中藥大辭典（上冊）》記載其以全草入藥，具有暖胃、補血、祛疲勞之功，可用于治療無名腫毒、勞傷疼痛及高燒等[2]?，F(xiàn)代藥理研究表明，飛蛾藤具有抗風(fēng)濕、抗炎、抑制前列腺素和白三烯生物合成等作用，可用于治療風(fēng)濕病及神經(jīng)疼痛等癥[3]。參考少數(shù)公開發(fā)表的關(guān)于飛蛾藤化學(xué)成分的文獻以及本課題組前期化學(xué)成分鑒定的預(yù)實驗結(jié)果可知，飛蛾藤藥材主要含有香豆素類、綠原酸類、甾體類、黃酮類、酰胺類等成分[4]，其中香豆素類成分東莨菪苷和東莨菪內(nèi)酯具有消腫、抗炎、鎮(zhèn)痛等作用，是公認的抗風(fēng)濕有效成分[5];綠原酸類成分新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C具有清除自由基、抑制黃嘌呤氧化酶活性等作用，能夠協(xié)同香豆素類成分發(fā)揮抗風(fēng)濕的功效[6]。

目前，飛蛾藤藥材尚無法定的質(zhì)量評價標準，且飛蛾藤及其同屬植物藥用部位尚無定論（有研究認為飛蛾藤的藥用部位為全草[2]，也有文獻報道其藥用部位為木本藤莖和根[4];飛蛾藤同屬藥材大果飛蛾藤Porana sinensis Hemsl.的藥用部位默認為莖[7]、搭棚藤原變種Porana discifera Schneid.的藥用部位為全草[8]），同時亦無關(guān)于飛蛾藤藥材不同藥用部位物質(zhì)基礎(chǔ)和含量差異的報道。本課題組前期采用高分辨質(zhì)譜技術(shù)對飛蛾藤藥材的化學(xué)成分進行了鑒定，指認了東莨菪苷、東莨菪內(nèi)酯、新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C等8種成分，且含量較高。基于此，本研究采用高效液相色譜（HPLC）法同時測定了飛蛾藤藥材不同藥用部位（莖、嫩枝、葉，由于市售飛蛾藤藥材均為地上部位，故本研究未對其全草進行定量分析）中上述8種成分的含量，并進行比較和主成分分析，旨在從化學(xué)成分含量方面探討飛蛾藤藥材不同藥用部位的差異，為飛蛾藤藥材資源的合理開發(fā)及利用提供依據(jù)。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有1260 型HPLC儀及配備的紫外檢測器、ChemStation B.04.03色譜工作站（美國Agilent公司），BS210S型萬分之一電子分析天平、BT25S型十萬分之一電子分析天平[賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司]，KQ-100型超聲波清洗機（昆山市超聲儀器有限公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

東莨菪內(nèi)酯對照品（批號161208）、綠原酸對照品（批號1701904）、新綠原酸對照品（批號17062003）均購自上海圻明生物科技有限公司，純度均不低于98%;東莨菪苷對照品（批號wkq20021510）、隱綠原酸對照品（批號wkq20082705）、異綠原酸A對照品（批號wkq20020403）、異綠原酸B對照品（批號wkq20021003）、異綠原酸C對照品（批號wkq20031101）均購自四川維克奇生物科技有限公司，純度均不低于98%;乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

3批飛蛾藤依次來自云南省藥材市場、湖北恩施（委托當?shù)厮庌r(nóng)采收）、云南省藥材市場，分別產(chǎn)自云南昆明、湖北恩施、云南文山，批號分別為20200916、2020102、20200711（編號依次為S1～S3），經(jīng)陜西省中醫(yī)藥研究院陳志永副研究員鑒定為旋花科植物飛蛾藤P. racemosa Roxb.的干燥全草。將3批飛蛾藤藥材的莖、嫩枝、葉按部位分揀、清洗、干燥并保存，備用。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

以Agilent TC-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）為色譜柱，以乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B）為流動相進行梯度洗脫（0～15 min，5%A→15%A;15～70 min，15%A→25%A;70～80 min，25%A）;流速為1.0 mL/min;柱溫為30 ℃;檢測波長為345 nm;進樣量為10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 供試品溶液 將飛蛾藤藥材的莖、嫩枝、葉粉碎，過40目篩。精密稱取上述樣品粉末約0.5 g，置于100 mL具塞錐形瓶中，精密加入80%甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，超聲（功率250 W，頻率40 kHz）處理30 min，冷卻至室溫，再次稱定質(zhì)量，用80%甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液2 mL與等體積40%甲醇混勻，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液[8]。

2.2.2 混合對照品溶液 精密稱取東莨菪苷、東莨菪內(nèi)酯、綠原酸、隱綠原酸、新綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C對照品適量，加甲醇溶解并稀釋，制成含上述各成分質(zhì)量濃度分別為7.64、6.28、9.08、8.00、5.76、9.44、8.60、7.88 mg/L的混合對照品溶液。

2.2.3 空白溶液 除不加飛蛾藤樣品外，其余按“2.2.1”項下“精密加入80%甲醇50 mL……，取續(xù)濾液”操作，即得空白溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗

取“2.2”項下供試品溶液（編號S1樣品的莖、嫩枝、葉）、混合對照品溶液、空白溶液各適量，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，詳見圖1。由圖1可見，東莨菪苷等8種成分的分離度均大于1.5，理論板數(shù)以東莨菪內(nèi)酯計均大于3 000，空白溶液對測定無干擾。

2.4 線性關(guān)系考察

分別吸取“2.2.2”項下混合對照品溶液0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 mL，置于10 mL量瓶中，加甲醇稀釋并定容，混勻，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。以各待測成分的質(zhì)量濃度（X，mg/L）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸。結(jié)果見表1。

2.5 精密度試驗

精密吸取“2.2.2”項下混合對照品溶液，用甲醇稀釋5倍，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣測定6次，記錄峰面積。結(jié)果顯示，東莨菪苷、東莨菪內(nèi)酯、綠原酸、隱綠原酸、新綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C峰面積的RSD分別為0.98%、1.55%、1.32%、1.71%、0.99%、1.36%、1.47%、0.93%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗

精密吸取“2.2.1”項下供試品溶液（編號S1樣品的莖），分別于室溫下放置0、2、4、8、12、24 h時按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果顯示，東莨菪苷、東莨菪內(nèi)酯、綠原酸、隱綠原酸、新綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C峰面積的RSD分別為1.52%、0.91%、1.82%、1.58%、1.61%、1.32%、1.34%、1.68%（n=6），表明供試品溶液于室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 重復(fù)性試驗

精密稱取飛蛾藤（編號S1樣品的莖）粉末，約0.5 g，共6份，按“2.2.1”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并按外標法計算樣品含量。結(jié)果顯示，東莨菪苷、東莨菪內(nèi)酯、綠原酸、隱綠原酸、新綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C含量的RSD分別為1.08%、1.39%、0.71%、1.33%、1.16%、1.29%、1.85%、1.94%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗

精密稱取已知含量的飛蛾藤（編號S1樣品的莖）粉末，約0.25 g，共6份，精密加入新制的混合對照品溶液（每1 mL含東莨菪苷2.435 0 mg、東莨菪內(nèi)酯0.255 0 mg、綠原酸1.751 0 mg、隱綠原酸0.187 5 mg、新綠原酸0.145 0 mg、異綠原酸A 0.264 5 mg、異綠原酸B 0.162 0 mg、異綠原酸C 0.140 0 mg）適量，按“2.2.1”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率。結(jié)果見表2。

2.9 樣品含量測定

分別取3批飛蛾藤不同藥用部位（莖、嫩枝、葉）粉末，約0.5 g，精密稱定，按“2.2.1”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并按外標法計算樣品含量。每樣品測定3次，結(jié)果見表3（由于S3葉中綠原酸含量較高，為在圖表中更好地顯示其他化學(xué)成分的含量，故在計算飛蛾藤葉中綠原酸的平均含量時去掉該數(shù)據(jù)，下同）。

2.10 主成分分析及含量比較

本研究以3批飛蛾藤藥材不同藥用部位（莖、嫩枝、葉）中東莨菪苷、東莨菪內(nèi)酯、綠原酸、隱綠原酸、新綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C的含量為變量，采用Markerlynx XS軟件進行主成分分析，詳見圖2。

由圖2可見，飛蛾藤可據(jù)不同藥用部位分為3類，其中飛蛾藤莖大部分聚集在得分圖的第1象限，嫩枝聚集在第3象限，葉聚集在第4象限，表明飛蛾藤不同藥用部位化學(xué)成分含量存在較大差異。

為進一步分析飛蛾藤不同藥用部位（莖、嫩枝、葉）含量差異較大的化學(xué)成分，本研究采用柱狀圖表征東莨菪苷等8種成分的平均含量差異，詳見圖3。由圖3可見，飛蛾藤葉中新綠原酸、綠原酸和隱綠原酸的平均含量較其他成分更高，嫩枝中異綠原酸B、異綠原酸A和異綠原酸C的平均含量較其他成分更高，莖中東莨菪苷、東莨菪內(nèi)酯的平均含量較其他成分更高。

3 討論

本課題組前期分別考察了不同色譜柱[Agilent? ?Zorbax SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Agilent TC-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Intersil ODS-3（250 mm×4.6 mm，5 μm）]的分離效果。結(jié)果顯示，當以Agilent TC-C18為色譜柱時，各色譜峰分離良好，故選擇Agilent TC-C18為色譜柱。同時，本課題組又考察了不同柱溫（25、30、35 ℃）對分離效果的影響。結(jié)果顯示，當柱溫為30 ℃時，各色譜峰峰形對稱且分離良好，故選擇柱溫為30 ℃。

本研究以3批飛蛾藤不同藥用部位（莖、嫩枝、葉）為研究對象，測定并比較了各藥用部位中東莨菪苷、東莨菪內(nèi)酯、綠原酸、隱綠原酸、新綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C等8種成分的含量。結(jié)果顯示，飛蛾藤莖中東莨菪苷和東莨菪內(nèi)酯的平均含量相對較高，莖中東莨菪苷的平均含量為嫩枝和葉的14.1倍和8.1倍，東莨菪內(nèi)酯的平均含量為嫩枝和葉的3.1倍和1.9倍。嫩枝中雙咖啡?？崴犷惓煞郑ó惥G原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C）的平均含量相對較高，嫩枝中異綠原酸B的平均含量為莖和葉的1.5倍和3.4倍，異綠原酸A的平均含量為莖和葉的2.0倍和2.5倍，異綠原酸C的平均含量為莖和葉的3.1倍和1.4倍。葉中單咖啡?？崴犷惓煞郑ㄐ戮G原酸、綠原酸、隱綠原酸）的平均含量高于莖和嫩枝，葉中新綠原酸的平均含量為莖和嫩枝的1.4倍和2.6倍，綠原酸的平均含量為莖和嫩枝的4.0倍和6.6倍，隱綠原酸的平均含量為莖和嫩枝的4.6倍和9.7倍。主成分分析結(jié)果顯示，飛蛾藤不同藥用部位可被分為3類，其中飛蛾藤莖大部分聚集在得分圖的第1象限，嫩枝聚集在第3象限，葉聚集在第4象限，表明飛蛾藤不同藥用部位中東莨菪苷等8種成分的含量存在較大差異，與含量測定結(jié)果基本一致。有研究指出，東莨菪苷和東莨菪內(nèi)酯具有消腫、抗炎、鎮(zhèn)痛等藥理作用，是抗風(fēng)濕的有效成分[5]，故筆者推測飛蛾藤的莖在抗風(fēng)濕方面優(yōu)于嫩枝和葉。也有研究認為，飛蛾藤莖和葉中豐富的咖啡?？崴嵫苌锞哂锌寡?、抗氧化、抗病毒等活性，可協(xié)同莖中東莨菪苷和東莨菪內(nèi)酯發(fā)揮抗風(fēng)濕的作用[6，9-11]，因此，《中藥大辭典（上冊）》記載飛蛾藤全草入藥[2]具有一定的合理性。

綜上所述，本研究所建HPLC法簡便、重復(fù)性好，可用于飛蛾藤不同藥用部位中東莨菪苷等8種成分的含量測定。飛蛾藤葉中新綠原酸、綠原酸和隱綠原酸的平均含量較高，嫩枝中異綠原酸B、異綠原酸A和異綠原酸C的含量較高，莖中東莨菪苷、東莨菪內(nèi)酯的平均含量較高。

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（收稿日期：2021-07-02 修回日期：2021-11-09）