2種滅菌方式對(duì)止嗽立效丸HPLC指紋圖譜和4種成分的影響

楊瑩瑩，張 璐，張文琴，劉瑛瑛，許信學(xué)，王曉燕*

[1.山西省藥品審評(píng)中心(山西省醫(yī)藥與生命科學(xué)研究院)，山西 太原 030006；2.山西華康藥業(yè)股份有限公司，山西 運(yùn)城 044200]

止嗽立效丸由麻黃、苦杏仁、甘草、罌粟殼等7味中藥組成，具有止嗽、定喘、祛痰作用，收載于《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》中藥成方制劑第七冊(cè)，但其質(zhì)量控制方法無(wú)含量測(cè)定及特征圖譜項(xiàng)；相關(guān)文獻(xiàn)也大多以鹽酸麻黃堿、苦杏仁苷、嗎啡等[1-5]為質(zhì)控指標(biāo)，未見指紋圖譜及多成分含量測(cè)定的報(bào)道。中藥制劑組成復(fù)雜，指紋圖譜能較全面地反映出其成分的種類及數(shù)量，從整體上對(duì)其質(zhì)量進(jìn)行評(píng)價(jià)[6-7]。

中藥常用滅菌方法有濕熱滅菌和輻照滅菌[8]，其中后者較常用的是60Co射線，具有操作方便、常溫常壓、效率高、耗時(shí)短等特點(diǎn)[9-10]。但輻照可能會(huì)引起部分成分發(fā)生變化[11-12]，從而影響藥物療效，因此關(guān)于其安全性尚有爭(zhēng)議[13-14]，《中藥輻照滅菌技術(shù)指導(dǎo)原則》規(guī)定，采用輻照技術(shù)對(duì)中藥進(jìn)行滅菌時(shí)，必須說(shuō)明它對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量的影響[15]。

本實(shí)驗(yàn)建立了止嗽立效丸HPLC指紋圖譜和鹽酸麻黃堿、苦杏仁苷、鹽酸罌粟堿、甘草酸銨含量測(cè)定方法，比較60Co輻照滅菌、濕熱滅菌對(duì)指紋圖譜的影響及上述4種成分含量變化，以期客觀全面地反映不同滅菌方式對(duì)該制劑所含成分的影響，為輻照滅菌工藝在其他中藥制劑中的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

Agilent 1200高效液相色譜儀，配置Agilent二極管陣列檢測(cè)器，購(gòu)自美國(guó)Agilent公司；AB104N型電子天平，購(gòu)自梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；KQ3200DE型數(shù)控超聲波清洗器，購(gòu)自昆山市超聲儀器有限公司；UPHW-I-90T型優(yōu)普系列超純水系統(tǒng)，購(gòu)自成都超純科技有限公司。

鹽酸麻黃堿(批號(hào)171241-201508)、苦杏仁苷(批號(hào)110820-201607)、鹽酸罌粟堿(批號(hào)1214-9602)對(duì)照品，購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；甘草酸銨(批號(hào)MUST-13093010)對(duì)照品，購(gòu)自成都曼思特生物科技有限公司。乙腈、甲醇為色譜純；其他試劑均為分析純；水為自制超純水。

未滅菌、60Co輻照滅菌、濕熱滅菌止嗽立效丸各5批，由山西華康藥業(yè)股份有限公司提供，具體信息見表1。

表1 樣品信息Tab.1 Information of samples

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 安捷倫ZORBAX SB-C18色譜柱(5 μm，4.6 mm×250 mm)；流動(dòng)相乙腈-0.1%磷酸，梯度洗脫(0～30 min，8%～24%乙腈；30～40 min，24%～50%乙腈；40～60 min，50%～64%乙腈；60～70 min，64%～96%乙腈；70～77 min，96%乙腈；77～80 min，96%～8%乙腈)；體積流量1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm(0～24、42～77 min)、250 nm(24～42 min)；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量15 μL。

2.2 溶液制備

2.2.1 對(duì)照品溶液 精密稱取鹽酸麻黃堿、苦杏仁苷、鹽酸罌粟堿、甘草酸銨對(duì)照品適量，甲醇溶解，制成分別含四者934、718、544、572 μg/mL的溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液 精密稱取丸劑粉末0.50 g，置于具塞錐形瓶中，加入80%甲醇(含0.5%磷酸)10 mL，蓋塞，稱定質(zhì)量，超聲提取30 min，冷卻，80%甲醇(含0.5%磷酸)補(bǔ)足減失的質(zhì)量，濾過(guò)，0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得。

2.3 HPLC指紋圖譜建立

2.3.1 方法學(xué)考察

2.3.1.1 精密度試驗(yàn) 精密吸取同一份供試品溶液(批號(hào)Q201711131)15 μL，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定5次，測(cè)得單峰面積大于總峰面積10%的共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD均小于1.0%，相對(duì)峰面積RSD均小于1.0%，相似度均大于0.99，表明儀器精密度良好。

2.3.1.2 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批丸劑(批號(hào)Q201711131)，按“2.2.2”項(xiàng)下方法平行制備5份供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得單峰面積大于總峰面積10%的共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD均小于1.0%，相對(duì)峰面積RSD均小于3.0%，相似度均大于0.99，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.1.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份供試品溶液(批號(hào)Q201711131)，于0、4、8、12、24、48 h在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得單峰面積大于總峰面積10%的共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD均小于1.0%，相對(duì)峰面積RSD均小于3.0%，相似度均大于0.98，表明溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.2 圖譜生成 取15批丸劑，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別精密吸取15 μL，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，將檢測(cè)結(jié)果導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2012版)》軟件，以S1為參照?qǐng)D譜進(jìn)行數(shù)據(jù)匹配，采用平均數(shù)法生成對(duì)照指紋圖譜(R)，結(jié)果共標(biāo)定23個(gè)共有指紋峰(圖1)，共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD均小于1.0%，色譜圖見圖2。由此可知，與滅菌前比較，濕熱滅菌后峰21、22面積明顯減小，峰5幾乎消失，而60Co輻照滅菌后均無(wú)明顯變化。

圖1 對(duì)照指紋圖譜Fig.1 Reference fingerprint

注：S1～S3分別為滅菌前丸劑、60Co輻照滅菌后丸劑、濕熱滅菌后丸劑。圖2 滅菌前后HPLC色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms before and after sterilization

2.3.3 相似度評(píng)價(jià) 將各批樣品HPLC指紋圖譜(圖3)導(dǎo)入國(guó)家藥典委員會(huì)《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2012版)》軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)匹配，采用平均數(shù)法生成對(duì)照指紋圖譜，建立共有模式，計(jì)算相似度，結(jié)果見表2。

圖3 15批樣品HPLC指紋圖譜Fig.3 HPLC fingerprints of fifteen batches of samples

表2 15批樣品相似度Tab.2 Similarities of fifteen batches of samples

由此可知，各批樣品相似度均在0.91以上，其中滅菌前、60Co輻照滅菌后相似度較高，而且比較接近，表明60Co輻照滅菌對(duì)指紋圖譜影響較??；濕熱滅菌相似度較低，表明在該滅菌方式下指紋圖譜變化較大。

2.3.4 共有峰峰面積比值比較 參考《中藥注射劑指紋圖譜研究的技術(shù)要求(暫行)》[16]相關(guān)要求，經(jīng)指紋圖譜峰面積數(shù)據(jù)匹配后計(jì)算單峰面積占總峰面積比例。結(jié)果，單峰面積占總峰面積比例在5%～10%之間的共有峰為峰3、5、11、22，在10%～20%之間的為峰6、21。

選擇穩(wěn)定性好、分離效果理想的甘草酸銨(峰14)作為參照，計(jì)算滅菌前后共有指紋峰峰面積與參照物峰面積(A0)比值，以及滅菌前后共有峰峰面積比值的差值，公式為差值=[(Ax-A0)/A0]×100%，比較單峰面積占總峰面積比例≥5%共有峰的變化，結(jié)果見表3。

表3 滅菌前后共有峰峰面積比值比較Tab.3 Comparison of common peak area ratios before and after sterilization

由此可知，60Co輻照滅菌后，峰21、22面積明顯減??；濕熱滅菌后，除峰3、11外，其他共有峰峰面積比值的差值均大于±25%，尤其是峰5、21、22，表明濕熱滅菌對(duì)峰面積較大的共有峰(≥5%)影響更大。

2.4 成分含量測(cè)定

2.4.1 指標(biāo)成分選擇 參考2020年版《中國(guó)藥典》一部、相關(guān)文獻(xiàn)和標(biāo)準(zhǔn)，預(yù)實(shí)驗(yàn)考察了鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、苦杏仁苷、甘草苷、甘草酸銨、嗎啡、鹽酸罌粟堿等成分，與其指紋圖譜特征峰進(jìn)行保留時(shí)間和紫外掃描圖譜的比對(duì)后，篩選出適合C18色譜柱分析和紫外檢測(cè)，而且對(duì)照品易獲得、色譜峰分離效果良好的4種成分作為指標(biāo)，分別為鹽酸麻黃堿(峰3)、苦杏仁苷(峰6)、鹽酸罌粟堿(峰13)、甘草酸銨(峰14)，色譜圖見圖4。

3.鹽酸麻黃堿 6.苦杏仁苷 13.鹽酸罌粟堿 14.甘草酸銨3.ephedrine hydrochloride 6.amygdalin 13.papaverine hydrochloride 14.ammonium glycyrrhizinate圖4 各成分HPLC色譜圖Fig.4 HPLC chromatograms of various constituents

2.4.2 線性關(guān)系考察 取“2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量，80%甲醇稀釋成6個(gè)質(zhì)量濃度，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。以對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行回歸，結(jié)果見表4，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表4 各成分線性關(guān)系Tab.4 Linear relationships of various constituents

2.4.3 精密度試驗(yàn) 精密吸取同一份供試品溶液(批號(hào)Q201711131)15 μL，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定5次，測(cè)得鹽酸麻黃堿、苦杏仁苷、鹽酸罌粟堿、甘草酸銨峰面積RSD分別為2.30%、0.78%、2.04%、0.58%，表明儀器精密度良好。

2.4.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批丸劑(批號(hào)Q201711131)，按“2.2.2”項(xiàng)下方法平行制備5份供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得鹽酸麻黃堿、苦杏仁苷、鹽酸罌粟堿、甘草酸銨含量RSD分別為0.79%、2.26%、1.85%、0.90%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一份供試品溶液(批號(hào)Q201711131)，于0、2、4、8、12、24、48 h在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得鹽酸麻黃堿、苦杏仁苷、鹽酸罌粟堿、甘草酸銨峰面積RSD分別為2.43%、2.19%、2.66%、1.40%，表明溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.6 加樣回收率試驗(yàn) 稱取各成分含量已知的丸劑(批號(hào)Q201711131)6份，每份約0.25 g，置于具塞錐形瓶中，精密加入對(duì)照品溶液1 mL，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果見表5。

表5 各成分加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6)Tab.5 Results of recovery tests for various constituents (n=6)

2.4.7 樣品含量測(cè)定 取15批丸劑，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，外標(biāo)法計(jì)算含量及其相對(duì)值[17]，平行3份，取平均值，再采用SPSS 22.0軟件對(duì)其進(jìn)行單因素方差分析，結(jié)果見表6。由此可知，與滅菌前比較，濕熱滅菌后鹽酸麻黃堿、苦杏仁苷含量降低(P<0.05)，而60Co輻照滅菌后各成分含量均無(wú)明顯變化(P>0.05)。

表6 各成分含量測(cè)定結(jié)果(mg/g)Tab.6 Results of content determination of various constituents (mg/g)

2.5 化學(xué)計(jì)量學(xué)研究

2.5.1 主成分分析 將各批樣品指紋圖譜相對(duì)峰面積導(dǎo)入SPSS 22.0軟件進(jìn)行主成分分析，發(fā)現(xiàn)有2個(gè)貢獻(xiàn)較大的主成分，累積方差貢獻(xiàn)率為77.49%，即能代表原始數(shù)據(jù)77.49%的信息。以2個(gè)主成分的得分向量建立坐標(biāo)，得到主成分得分圖(圖5)，可知濕熱滅菌后樣品均分布在FAC1坐標(biāo)的負(fù)值區(qū)域，而滅菌前、60Co輻照滅菌后樣品均分布在FAC1坐標(biāo)的正值區(qū)域，表明前者與其他樣品差異較大，而后兩者之間差異較小。

圖5 主成分得分散點(diǎn)圖Fig.5 Score scatter plot of principal components

2.5.2 聚類分析 將各批樣品相對(duì)峰面積導(dǎo)入SPSS 22.0軟件進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析，采用組間均連法，以歐式平方距離為分類依據(jù)，結(jié)果見圖6。由此可知，當(dāng)閾值為25時(shí)，濕熱滅菌后樣品聚為一類，其他樣品聚為一類；當(dāng)閾值減小后，滅菌前、60Co輻照滅菌后樣品又進(jìn)一步分為2類，S4、S7、S10、S13聚為一類，S1與60Co輻照滅菌后樣品聚為一類，表明濕熱滅菌后樣品所含成分與其他樣品差異較大，而滅菌前、60Co輻照滅菌后樣品所含成分較一致，與“2.5.1”項(xiàng)下結(jié)果吻合。

圖6 聚類分析樹狀圖Fig.6 Dendrogram of clustering analysis

3 討論

3.1 色譜條件優(yōu)化 本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，以水(含0.1%磷酸)-乙腈為流動(dòng)相梯度洗脫時(shí)分離效果良好，基線平穩(wěn)。通過(guò)全波長(zhǎng)掃描和多波長(zhǎng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在210 nm處色譜峰較多，基線平穩(wěn)，信號(hào)強(qiáng)度高，故選擇其作為主要檢測(cè)波長(zhǎng)；鹽酸罌粟堿、甘草酸銨在250 nm處有最大吸收，故采用切換波長(zhǎng)模式將這兩者檢測(cè)波長(zhǎng)設(shè)為250 nm。

3.2 提取條件優(yōu)化 本實(shí)驗(yàn)比較了水、甲醇、乙醇、乙酸乙酯的提取效率，結(jié)果顯示水提取出極性成分較多，但弱極性者很少；乙醇提取20 min前色譜峰數(shù)量很少；乙酸乙酯只能提取出40 min以后的色譜峰；甲醇提取出的不同極性成分?jǐn)?shù)量最多，響應(yīng)信號(hào)高。

3.3 滅菌工藝比較 本實(shí)驗(yàn)建立了止嗽立效丸HPLC指紋圖譜，指認(rèn)了23個(gè)共有峰，同時(shí)對(duì)鹽酸麻黃堿、苦杏仁苷、鹽酸罌粟堿、甘草酸銨含量進(jìn)行了測(cè)定。與濕熱滅菌比較，輻照滅菌對(duì)各成分含量的影響較小，更有利于最大程度保留藥材原有成分，能滿足相關(guān)研究需求，為該技術(shù)在其他中藥制劑中的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。