UHPLC-Q-Exactive-Orbitrap HR-MS分析大黃素甲醚在大鼠體內(nèi)的代謝產(chǎn)物

董萍萍，王少平，王喻淇，李浩然，李啟艷，魏 霞，代 龍*，張加余*

(1.山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，山東 濟(jì)南 250300；2.濱州醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，山東 煙臺 264003；3.北京大學(xué)藥學(xué)院，北京 102488；4.山東省食品藥品檢驗研究院，山東 濟(jì)南 250300)

藥物代謝指藥物進(jìn)入體內(nèi)后，在體內(nèi)多種藥物代謝酶的作用下，化學(xué)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變的過程。藥物在體內(nèi)經(jīng)生物轉(zhuǎn)化后可以被活化，由無藥理活性轉(zhuǎn)化成為有藥理活性或毒性的代謝物[1]。因此，對代謝產(chǎn)物的研究可為藥物療效的表達(dá)提供依據(jù)。然而，由于代謝產(chǎn)物譜和藥物處理過程的復(fù)雜性，藥物代謝產(chǎn)物和代謝途徑分析一直面臨諸多挑戰(zhàn)。

近年來，高分辨率質(zhì)譜可為化合物的結(jié)構(gòu)鑒定提供豐富的信息，極大地提升了代謝產(chǎn)物鑒定效率，成為中藥化學(xué)成分及其體內(nèi)代謝過程研究的常用方法[2-3]。其中，超高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜(UHPLC-Q-Exactive Orbitrap Mass spectrometry)可進(jìn)行高分辨率(140 000 FWHM)和高質(zhì)量精度質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集，保證篩查結(jié)果的可靠和準(zhǔn)確性。同時結(jié)合質(zhì)量虧損過濾(MDF)、中性丟失過濾(NLF)、診斷碎片離子過濾(NFIF)等數(shù)據(jù)處理技術(shù)，可為中藥化學(xué)成分的體內(nèi)代謝研究提供更可靠、更有效的技術(shù)支撐[4-6]。

現(xiàn)代研究表明，蒽醌類化合物具有廣泛的藥理作用，包括瀉下作用、抗腫瘤、抗炎、抗菌、抗氧化、抗損傷和乙酰膽堿酯抑制等作用[7]。大黃素甲醚是一種蒽醌類衍生物，廣泛存在于大黃[8]、何首烏[9]以及土大黃[10]等中草藥中。作為這些中藥的主要有效成分，大黃素甲醚由于其良好的藥理作用而受到越來越多的關(guān)注。例如，它不僅通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、破壞細(xì)胞周期和抑制腫瘤轉(zhuǎn)移而發(fā)揮有效的抗腫瘤活性[11]，而且還表現(xiàn)出對各種真菌、細(xì)菌和病毒明顯的抑制作用[12]。此外，許多研究報道大黃素甲醚有抗炎、抗氧化、脂質(zhì)調(diào)節(jié)和神經(jīng)保護(hù)作用[13-14]。然而，大黃素甲醚也會引起肝毒性、腎毒性和遺傳毒性，且具有劑量依賴性[15-17]。目前，大黃素甲醚的體內(nèi)代謝過程亟需進(jìn)一步研究，以期為蒽醌類成分的新藥研發(fā)及中藥材、制劑的全面質(zhì)量控制奠定基礎(chǔ)。

1 材料

UHPLC Q Exactive-Orbitrap HR-MS(美國Thermo Fisher Scientific公司)，配置電噴霧離子源和XCalibur 2.1質(zhì)譜工作站；超聲波清洗機(jī)(上海比郎儀器制造有限公司)；C18固相萃取小柱(500 mg/3 mL，美國Sigma公司)；TTL-DCI型氮吹儀(北京同泰聯(lián)科技發(fā)展有限公司)；BT25S型電子分析天平(十萬分之一，北京賽多利斯儀器有限公司)；-80 ℃超低溫冷凍儲藏冰箱(美國Thermo Fisher Scientific公司)。

大黃素甲醚(批號MUST-19032622)、大黃酸(批號MUST-19031309)、蘆薈大黃素(批號MUST-19091912)、大黃素(批號MUST-18110810)、大黃酚(批號MUST-19040301)對照品均購自成都普曼斯特生物科技有限公司，純度均大于98%。乙腈、甲醇(質(zhì)譜純，美國Thermo Fisher公司)；甲酸(色譜純，德國Merck公司)。

雄性SD大鼠，體質(zhì)量(200±10)g，購于濟(jì)南朋悅實驗動物繁育有限公司，動物生產(chǎn)許可證號SCXK(魯)20190003，飼養(yǎng)于SPF級動物房，晝夜循環(huán)12 h，溫度22～24 ℃，相對濕度55%～65%。

2 方法

2.1 溶液制備 精密稱取大黃素甲醚、大黃素、大黃酸、大黃酚、蘆薈大黃素對照品各1 mg 至10 mL量瓶中，甲醇超聲溶解，濾過，即得對照品溶液。稱取大黃素甲醚對照品60 mg，加入6 mL生理鹽水，配成質(zhì)量濃度為10 mg/mL的混懸液。

2.2 動物實驗與樣品采集 6只大鼠隨機(jī)分為空白組和給藥組，每組3只，實驗前適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，禁食12H，不禁水，給藥組按25 mg/kg劑量灌胃給藥[18-20]，空白組灌胃給予等量生理鹽水，灌胃后分別于0.5、1、2、4、6 h眼眶取血0.5 mL，置于肝素鈉抗凝EP管中，搖勻，3 500 r/min離心15 min，合并上清液，得空白血漿和含藥血漿，置于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆茫皇占?～24H尿樣，3 500 r/min離心15 min后取上清液，于-80 ℃冰箱保存，得空白尿樣與含藥尿樣；收集0～24 h糞樣，晾干后碾碎，裝于離心管中保存[21-22]。

2.3 生物樣品前處理 取空白組和給藥組大鼠糞便各1 g，研磨，加入5 mL純水超聲提取30 min，3 500 r/min離心15 min后取上清液，即得空白糞樣與含藥糞樣[18]。取固相萃取柱，依次用3 mL甲醇、3 mL水對其進(jìn)行活化，吸取血漿、尿液、糞便各1 mL上樣，依次用3 mL水、3 mL甲醇洗脫，收集甲醇洗脫液，在室溫下用N2吹干，殘渣用100 μL初始流動相溶解，渦旋振蕩3 min，14 000 r/min離心15 min，取上清液[23-24]。

2.4 分析條件

2.4.1 色譜 WatersHSS T3 UPLC色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)；流動相0.1%甲酸(A)-乙腈(B)，梯度洗脫(0～1 min，5%B；1～3 min，5%～40%B；3～6 min，40%～50%B；6～11 min，50%～65%B；11～19 min，65%～95%B)；體積流量0.3 mL/min；柱溫35 ℃；進(jìn)樣量3 μL。

2.4.2 質(zhì)譜 正負(fù)離子檢測模式；鞘氣、輔助氣氮氣(純度≥99.99%)，體積流量30、10 L/min；毛細(xì)管溫度320 ℃；蒸發(fā)器溫度400 ℃；噴涂電壓4 500/-3 800 V；分辨率70 000；高分辨掃描范圍m/z80～1 200；碰撞能30 eV；dd-MS2分辨率17 500。

2.5 數(shù)據(jù)處理 所有蒽醌類化合物都具有共同的堿性1,8-二羥基對苯二酚的結(jié)構(gòu)，以及C-3、C-5不同取代(主要是甲基、羥基、甲氧基和羧基)，經(jīng)過一系列代謝反應(yīng)后大黃素型5種游離蒽醌會相互轉(zhuǎn)化[23]。因此，本實驗以5種大黃素型蒽醌為原型，建立其可能的代謝反應(yīng)模板，包括化合物名稱，分子式，結(jié)構(gòu)式等，進(jìn)行目標(biāo)化合物的篩選與鑒定。

采用Thermo Xcalibur 2.1工作站進(jìn)行數(shù)據(jù)采集和處理，為了獲得盡可能多地獲得大黃素甲醚代謝物的ESI-MS/MS碎片離子，選擇正離子模式強(qiáng)度不低于40 000、負(fù)離子模式強(qiáng)度不低于10 000的信號峰進(jìn)行鑒定。根據(jù)精確分子質(zhì)量，元素組成和可能發(fā)生反應(yīng)，對所有母離子和碎片離子的分子式進(jìn)行預(yù)測設(shè)置，參數(shù)設(shè)置為C[5-30]，H[5-60]，O[2-20]，S[0-2]，N[0-3]，環(huán)不飽和雙鍵數(shù)(RDB)[3-20]，質(zhì)量精度誤差在1.0×10-5以內(nèi)。

3 結(jié)果

3.1 大黃素甲醚質(zhì)譜裂解規(guī)律分析 在負(fù)離子模式下，大黃素甲醚的準(zhǔn)分子離子峰[M-H]-為m/z283.061 1(C16H11O5)，見圖1，在其二級質(zhì)譜中檢測到特征離子碎片m/z240[M-H-CO-CH3]-、m/z197[M-H-2CO-CH2O]-、m/z183[M-H-2CO-CH2-CH2O]-、m/z211[M-H-CO-CH2-CH2O]-，其可能的裂解規(guī)律見圖2。大黃素、蘆薈大黃素、大黃酚、大黃酸的二級質(zhì)譜圖以及碎片離子見圖3、表1。

圖1 大黃素甲醚對照品一級(A)、二級(B)質(zhì)譜圖(負(fù)離子模式)

圖2 大黃素甲醚質(zhì)譜裂解規(guī)律(負(fù)離子模式)

圖3 大黃素(A)、大黃酸(B)、蘆薈大黃素(C)、大黃酚(D)二級圖譜

3.2 大黃素甲醚體內(nèi)代謝產(chǎn)物分析

對大鼠給藥前后的尿液、血漿、糞便進(jìn)行分析，結(jié)合精確分子質(zhì)量、保留時間、二級碎片離子、ClogP值等參數(shù)，共初步鑒定出20種代謝物，具體質(zhì)譜信息見表1。

表1 大黃素甲醚代謝產(chǎn)物(Ⅰ)

M1在正離子模式下準(zhǔn)分子離子為m/z576.128 2，保留時間3.25 min，推測其最可能的分子式為C25H26O11N3S。根據(jù)文獻(xiàn)和篩選所用模板，推測其為ω-羥基大黃素-半胱氨酸。在其二級質(zhì)譜中，m/z397[M+H-C5H8N203S]+為谷胱甘肽第二個肽鍵斷裂，中性丟失半胱氨酸-甘氨酸二肽而形成的碎片離子。同時，m/z178為此二肽質(zhì)子化碎片。離子對m/z415和m/z162為半胱氨酸中叔碳和N原子相連的鍵經(jīng)過誘導(dǎo)碰撞斷裂而形成的互補(bǔ)離子對。m/z287為準(zhǔn)分子離子丟失C10H15N3O5S而形成，經(jīng)計算，該中性碎片為谷氨酸殘基-半胱氨酸-甘氨酸，可確定M1為ω-羥基大黃素-半胱氨酸。

M2和M3準(zhǔn)分子離子峰分別為m/z445.077 5和445.077 3，保留時間分別為4.48 min和4.54 min。經(jīng)計算，最可能的分子式為C21H17O11，其相對分子質(zhì)量比大黃素和蘆薈大黃素多176，故推測M1和M2為大黃素/蘆薈大黃素葡萄糖醛酸化產(chǎn)物。其中M2和M3的二級碎片離子m/z175[GluA-H]-為葡萄糖醛酸碎片離子，m/z269[M-H-GluA]-為準(zhǔn)分子離子峰m/z445[M-H]-脫去GluA中性碎片產(chǎn)生的離子。在M2的ESI-MS2中，碎片離子m/z225與蘆薈大黃素標(biāo)準(zhǔn)品的碎片離子一致，而M3的二級碎片中，m/z239與大黃素標(biāo)準(zhǔn)品碎片相同，故最終推測M2為蘆薈大黃素的葡萄糖醛酸結(jié)合產(chǎn)物，而M3為大黃素葡萄糖醛酸結(jié)合產(chǎn)物。

M6在正離子模式下的準(zhǔn)分子離子為m/z255.064 9，其二級碎片與大黃酚的一致。但是保留時間比大黃酚提前，極性比大黃酚大，推測其為大黃酚的同分異構(gòu)體。M4保留時間為4.66 min，[M-H]-為m/z417.118 9，其最可能分子式為C21H21O9。其二級質(zhì)譜中，m/z175和中性丟失176(m/z417→m/z241)都證明了葡萄糖醛酸的存在。脫去葡萄糖醛酸后其分子式為C15H13O3，是大黃酚氫化脫氧形成的大黃酚蒽酮的氫化產(chǎn)物。m/z135和m/z121分別為離子m/z241在中間環(huán)裂解失去C7H6O和C8H8O而形成的，最終鑒定M4是大黃酚雙氫化脫氧葡萄糖醛酸化產(chǎn)物。M8的準(zhǔn)分子離子為m/z433.113 9，比M4高16，同時二級碎片離子m/z257比M4的m/z241高16，故推測M8為M4的羥基化產(chǎn)物。M7和M9分別在4.98 min和5.28 min處被洗脫出來，準(zhǔn)分子離子分別為m/z269.045 5和m/z269.045 6，計算其最可能分子式為C15H9O5。在ESI-MS2中，碎片離子m/z225比分子離子少44，推測為中性丟失一分子CO2，證明羧基的存在。根據(jù)其分子式和不飽和度，最終M7和M9被鑒定為大黃酸蒽酮。M5的準(zhǔn)分子離子峰[M-H]-為m/z313.071 4，分子式為C17H13O6。經(jīng)碰撞誘導(dǎo)，準(zhǔn)分子離子脫去一分子CO2產(chǎn)生二級碎片m/z269，故可判定其分子結(jié)構(gòu)中存在羧基。結(jié)合其不飽和度以及分子式，其母核結(jié)構(gòu)為大黃酸蒽酮化合物，推測其為大黃酸蒽酮的雙甲基化、羥基化產(chǎn)物。其中二級碎片離子m/z119和m/z161為非羧基取代側(cè)的苯環(huán)被兩個甲基取代后，在中間環(huán)的碳基左右兩側(cè)斷裂后分別得到的碎片離子，證明雙甲基取代和羥基取代分別發(fā)生在兩側(cè)苯環(huán)上，具體結(jié)構(gòu)見圖4。最終，M5被鑒定為大黃酸蒽酮-雙甲基-羥基化產(chǎn)物。

圖4 大黃素甲醚代謝通路

M10的準(zhǔn)分子離子為m/z367.013 0(C15H11O9S)，比ω-羥基大黃素多82，結(jié)合其分子式，推測其為ω-羥基大黃素的氫化、硫酸酯化代謝產(chǎn)物。由m/z367→m/z287的中性丟失80可知硫酸根的存在。二級碎片離子m/z231為m/z287連續(xù)丟失CO和C2H2而形成的，m/z187為m/z287連續(xù)丟失4分子水和1分子CO而成。最終，M10被鑒定為ω-羥基大黃素-氫化-硫酸酯化產(chǎn)物。

M11和M12擁有共同的理論[M-H]-值m/z459.092 2，計算分子式為C22H19O11。二者的ESI-MS2基本一致，其中m/z175和m/z113為葡萄糖醛酸的特征離子碎片，m/z283為準(zhǔn)分子離子中性丟失葡萄糖醛酸碎片形成。碎片離子m/z240為大黃素甲醚特征碎片，且碎片離子m/z268為大黃素甲醚丟失CH3而形成。故推測二者為大黃素甲醚的葡萄糖醛酸結(jié)合產(chǎn)物。根據(jù)二者ClogP值，最終推測M11為大黃素甲醚-8-O-葡萄糖醛酸，M12為大黃素甲醚-1-O-葡萄糖醛酸。

M13在6.31 min時被洗脫出來，準(zhǔn)分子離子為m/z267.066 3(C16H11O4)。在其二級質(zhì)譜中，基峰離子m/z252比準(zhǔn)分子離子少15，說明其失去一個CH3，證明了M13結(jié)構(gòu)中存在一個碰撞后易失去的甲基，且最可能與氧相連。離子m/z223比準(zhǔn)分子離子[M-H]-少44，是由后者中性丟失一分子CO2形成的，說明結(jié)構(gòu)中同樣存在羧基。離子m/z117為M13連續(xù)失去CO2和CH3后又失去環(huán)C6H4O而形成的，說明甲基和羧基存在于另一側(cè)環(huán)上。故M13被鑒定為1-甲氧基-3-羧基-蒽酮。M15在保留時間為6.60 min 時被洗脫出來，其準(zhǔn)分子離子為m/z241.050 3，計算得分子式為C14H9O4。根據(jù)數(shù)據(jù)庫pubchem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)以及分子式相結(jié)合，推測其為三羥基蒽酮。在其ESI-MS2中，m/z123為苯環(huán)上取代三個羥基所形成得碎片離子，而碎片離子m/z75是由蒽酮中無取代的苯環(huán)形成的碎片離子。m/z213是由準(zhǔn)分子離子失去一分子CO形成的。結(jié)合以上條件以及保留時間，M15最終被鑒定為1,2,3-三羥基-蒽酮。

M14、M16和M18的[M-H]-為m/z253.049 5，其分子式為C15H9O4。結(jié)合保留時間和相對分子質(zhì)量，推測三者為大黃酸蒽酮的脫羥基反應(yīng)產(chǎn)物。其多級碎片離子m/z209為m/z253脫去1分子CO2形成，證明羧基的存在。離子m/z191是由m/z209繼續(xù)分子內(nèi)脫水形成，說明羥基的存在。M14和M18的m/z117(C8H7O-)為C9、C10與羥基和羧基所在的苯環(huán)連接的鍵斷裂后所形成的碎片離子，說明二者的羧基和羥基在同一側(cè)苯環(huán)上。M16的m/z147為羰基和羧基所在一側(cè)，m/z105為其互補(bǔ)碎片離子，說明羧基和羥基在兩側(cè)苯環(huán)上。M14、M16和M18最終被鑒定為大黃酸蒽酮脫羥基產(chǎn)物異構(gòu)體。M19的準(zhǔn)分子離子峰為m/z265.050 4(C16H9O4)，保留時間為7.53 min。在其二級質(zhì)譜中，碎片離子m/z221比準(zhǔn)分子離子小44，推測為準(zhǔn)分子離子峰中性丟失一分子CO2形成，證明了羧基的存在。離子m/z193是由碎片離子m/z221中性丟失一分子CO而形成的，根據(jù)其分子式和不飽和度，最終鑒定其結(jié)構(gòu)為甲基化3-羧基-蒽醌。

M17的保留時間為5.15 min，準(zhǔn)分子離子峰為m/z269.045 7，推測其分子式為C15H9O5。M17保留時間和二級碎片裂解行為與大黃素相似，由此可將M17準(zhǔn)確鑒定為大黃素，由大黃素甲醚失去甲基而形成。M20的準(zhǔn)分子離子m/z349.001 5比蘆薈大黃素多80，推測其為蘆薈大黃素硫酸酯化反應(yīng)物。在ESI-MS2中，m/z269是由分子離子峰中性丟失一分子SO3而形成，特征碎片m/z197與蘆薈大黃素一致。最終推測，M20為蘆薈大黃素硫酸酯化產(chǎn)物。

此外，本實驗整合了文獻(xiàn)報道的信息中大黃素甲醚可能發(fā)生的代謝反應(yīng)及其分子式改變的情況，預(yù)測其代謝物可能的分子式，通過準(zhǔn)確質(zhì)荷比信息，提取不同質(zhì)荷比的一級質(zhì)譜圖，并判斷其峰形，然后對比文獻(xiàn)報道的信息，對沒有二級質(zhì)譜的物質(zhì)進(jìn)行分析。最后從一級質(zhì)譜中初步分析出23種可能的代謝物，分析結(jié)果如表2所示，其可能的結(jié)構(gòu)如圖4所示。

表2 大黃素甲醚代謝產(chǎn)物(Ⅱ)

3.3 大黃素甲醚的體內(nèi)代謝途徑分析 大黃素甲醚的代謝通路圖見圖4。大黃素甲醚吸收入體內(nèi)后，在血液中檢測到27個代謝產(chǎn)物，尿液中檢測到21個代謝產(chǎn)物，糞便中檢測到11個代謝產(chǎn)物。大黃素甲醚在血液中檢測出了葡萄糖醛酸結(jié)合產(chǎn)物、硫酸酯化產(chǎn)物以及轉(zhuǎn)化的蒽酮、氫蒽等物質(zhì)，其中以葡萄糖醛酸化結(jié)合產(chǎn)物為主。在尿液中產(chǎn)生了谷胱甘肽代謝產(chǎn)物以及大黃酸和大黃酸蒽酮類物質(zhì)。在糞便中鑒定出了大黃酚和大黃素以及它們的硫酸酯化、葡萄糖醛酸化產(chǎn)物。

4 討論

為了檢測盡可能多的代謝物，建立了UHPLC-Q-Exactive Orbitrap MS結(jié)合整合定性分析策略對其在血液中的 Ⅰ 相代謝物和 II 相代謝物進(jìn)行靶向篩選和定性分析，在正、負(fù)離子模式下對血漿，尿液和糞便中的大黃素甲醚代謝物進(jìn)行了全面的分析和鑒定，并闡明了其主要的體內(nèi)代謝途徑。

藥物體內(nèi)代謝產(chǎn)物具有復(fù)雜多樣性，并且這些復(fù)雜的代謝產(chǎn)物含量不一，有些甚至很難被檢測到。由于質(zhì)譜掃描過程中二級質(zhì)譜會選擇全掃描中響應(yīng)前 N 強(qiáng)的離子進(jìn)行二級掃描，這就導(dǎo)致一些微量代謝產(chǎn)物只存在于一級質(zhì)譜中，而被二級掃描所忽略造成假陰性?；诖?，本文整合了文獻(xiàn)中報道的大黃素甲醚的代謝產(chǎn)物，對其可能存在的代謝產(chǎn)物進(jìn)行了初步的分析。

有研究報道，蒽醌類成分在體內(nèi)含量過高會有一定的毒性，在體內(nèi)代謝時主要通過尿液和膽汁排泄促進(jìn)其毒性的清除[25]。在本實驗中，大黃素甲醚吸收進(jìn)入體內(nèi)后，在大鼠血、尿、糞中均未發(fā)現(xiàn)其原型，在血液中檢測到27個代謝產(chǎn)物，尿液中檢測到21個代謝產(chǎn)物，糞便中檢測到11個代謝產(chǎn)物，表明了大黃素甲醚主要通過尿液進(jìn)行排泄。大黃素甲醚在大鼠體內(nèi)主要進(jìn)行葡萄糖醛酸結(jié)合、硫酸酯化等反應(yīng)以及轉(zhuǎn)化成蒽酮、氫蒽等物質(zhì)，進(jìn)一步進(jìn)入血液，輸送到各個器官，發(fā)揮其藥理作用。其中在尿液中以糖苷化、硫酸酯化和谷胱甘肽結(jié)合產(chǎn)物為主。尿液中檢測到的的谷胱甘肽結(jié)合產(chǎn)物在肝臟中會與細(xì)胞親核物質(zhì)形成共價加和物，從而導(dǎo)致肝毒性[27]。與報道一致的是，大黃素甲醚進(jìn)入體內(nèi)后，在代謝過程中會轉(zhuǎn)化成大黃素、蘆薈大黃素、大黃酸以及大黃酚等，這些物質(zhì)的蒽醌類基本母核相互轉(zhuǎn)化，其代謝物不僅來自自身，也來自于其他成分[26]，其代謝途徑見圖4。

本實驗研究了大黃素甲醚在大鼠體內(nèi)的代謝情況，為單個物質(zhì)和整個蒽醌類物質(zhì)在體內(nèi)代謝時的相互轉(zhuǎn)化提供了更進(jìn)一步的依據(jù)，同時也為蒽醌類藥物的臨床安全用藥提供了依據(jù)。本實驗基于從體內(nèi)代謝過程的角度研究蒽醌類化合物的藥效和毒性其物質(zhì)基礎(chǔ)，對于確保相關(guān)中藥臨床使用的安全、有效具有重要意義。