五子衍宗丸對實驗性自身免疫性腦脊髓炎小鼠髓鞘脫失及氧化應激損傷的影響

樊慧杰，李艷榮，柴 智*，劉建春，王新亮，茹 意，尉杰忠，肖保國，馬存根,*

(1.山西中醫(yī)藥大學，國家中醫(yī)藥管理局多發(fā)性硬化益氣活血重點研究室，山西 晉中 030619；2.山西大同大學腦科學研究所，山西 大同 037009；3.復旦大學華山醫(yī)院神經病學研究所，上海 200025)

多發(fā)性硬化是一種慢性炎癥性中樞神經系統脫髓鞘疾病，常累及脊髓、腦室周圍等部位的白質[1]。該病呈全球分布，好發(fā)于青壯年，女性發(fā)病率高于男性，致殘率高，預后差。多發(fā)性硬化可能與遺傳、免疫、感染等因素有關，氧化應激在發(fā)病機制中扮演著重要的角色。在發(fā)病的初始階段，氧化應激通過上調反應性活性氧(reactive oxygen species，ROS)的水平，進而破壞血腦屏障，同時使機體的過氧化產物增多[2]，而過多的過氧化產物比如羰基化蛋白質會使病程進一步遷延難愈[3]。實驗性自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)是國際公認的多發(fā)性硬化實驗動物模型[4]。

五子衍宗丸是臨床常用的補腎良方，現代藥理研究表明，五子衍宗丸不僅能改善生殖功能[5]，而且對神經系統有良好的保護作用。五子衍宗丸的預先給藥可以有效防治孕鼠胚胎的神經管畸形[6-7]。加味五子衍宗丸有促進神經細胞分化的作用，可能是其發(fā)揮抗癡呆藥理作用的潛在機制[8]。課題組前期已經證實五子衍宗丸對EAE有明確的治療作用[9]，在此基礎上，本研究繼續(xù)采用EAE模型，以髓鞘脫失、炎性浸潤程度進一步明確五子衍宗丸的治療作用，并基于氧化應激角度，探討五子衍宗丸治療EAE小鼠的作用機制。

1 材料

1.1 動物 清潔級健康8～10周齡C57BL/6雌性小鼠30只，體質量(19±1)g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，動物生產許可證號SCXK(京)2016-0006，實驗動物使用許可證號SYXK(晉)2020-0006。實驗前，小鼠適應性飼養(yǎng)1周，飼養(yǎng)環(huán)境為清潔級，通風良好，晝夜節(jié)律自然照明，溫度(22±2)℃，相對濕度45%～55%，小鼠自由飲食進水。對小鼠的處理過程符合動物倫理學標準，并已經通過學校實驗動物倫理委員會審查。

1.2 藥物 五子衍宗丸由北京同仁堂股份有限公司生產(批號18035041)，主要藥材為枸杞子、菟絲子(炒)、覆盆子、五味子(蒸)和鹽車前子，輔料是賦形劑蜂蜜，呈棕褐色的水蜜丸，每100粒重10 g，研磨成粉末狀后過篩(0.355 mm)，0.9%氯化鈉溶液溶解粉末配制成混懸液，在4 ℃下貯存?zhèn)溆?，臨用前取出回溫并充分混勻。

1.3 儀器 電泳儀(型號PowerPacTM)、凝膠成像分析儀(型號HOOD-Ⅱ)(美國Bio-Rad公司)；冰凍切片機(型號CM1950，德國Leica公司)。

1.4 試劑 過氧化氫酶(catalase，CAT)一抗購自美國Cell Signaling Technology公司(批號14097)；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)一抗購自美國Novus Biologicals公司(批號NB100-1992)；β-肌動蛋白(β-actin)一抗購自武漢博士德有限公司(批號AA1217B68088Z)；谷胱甘肽(glutathione，GSH)試劑盒(批號20180102)及丙二醛(malonaldehyde，MDA)試劑盒(批號20180111)均購自南京建成生物工程研究所。

2 方法

2.1 分組與造模 小鼠按體質量隨機分為佐劑組、模型組、五子衍宗丸組，每組10只，模型組和五子衍宗丸組小鼠在背部4～5脊椎兩側分4點進針，皮下注射抗原乳劑0.1 mL，由含250 μg髓鞘少突膠質細胞糖蛋白35～55(myelin oligodendrocyte glycoprotein，MOG35～55)的磷酸鹽緩沖液和含350 μg結核分枝桿菌的完全弗氏佐劑(complete freund’s adjuvant，CFA)按1∶1比例混合而成[10]；佐劑組皮下注射磷酸鹽緩沖液和CFA的1∶1混合乳劑，0.1 mL/只。免疫注射當天記錄為免疫第0天，于免疫第0、2天，模型組、五子衍宗丸組小鼠均腹腔注射免疫增強劑百日咳毒素，300 ng/只，而佐劑組小鼠腹腔注射等量的0.9%氯化鈉溶液。

2.2 給藥 五子衍宗丸組小鼠于免疫后第3天灌胃給藥，劑量為16 g/kg[9]，而佐劑組、模型組小鼠均以0.9%氯化鈉溶液灌胃。劑量均為50 mL/kg，每天2次，間隔時間為12 h，持續(xù)25 d(即到免疫后第27天)。

2.3 指標檢測 免疫后第28天麻醉、解剖小鼠，心臟灌注0.9%氯化鈉溶液直到肝臟變白，分離脊髓并將其脫水、包埋、液氮冷凍，用于冰凍切片。同時采集每只小鼠腦組織，用于氧化應激指標檢測。

2.3.1 固藍染色 每組取5只小鼠的脊髓冰凍切片，70%乙醇中浸泡15 min，57 ℃固藍溶液中孵育24 h，依次在95%乙醇、去離子水、0.05%碳酸鋰中浸洗，70%乙醇分化，經梯度脫水、透明、封片后在顯微鏡下觀察。

2.3.2 HE染色 每組取5只小鼠的脊髓冰凍切片，4%多聚甲醛固定10 min，蘇木素染色12 min，0.1%鹽酸乙醇分化20 s，伊紅溶液染色1 min，乙醇梯度脫水，二甲苯溶液透明，中性樹膠封片，室溫條件下避光晾干，在顯微鏡下觀察拍照。

2.3.3 Western blot檢測SOD、CAT表達 將小鼠腦組織置于含液氮的研缽中研磨成粉末，取一半加入裂解液，BCA法檢測蛋白濃度，計算SDS-PAGE電泳上樣體積，5%濃縮膠集中，10%分離膠分離，電泳結束后將凝膠蛋白用半干式轉膜法轉到PVDF膜(穩(wěn)壓15 V、時間30 min)，5%脫脂奶粉封閉PVDF膜1.5 h，分別加入抗SOD(1∶1 000)、抗CAT(1∶1 000)一抗，4 ℃孵育過夜，次日加入羊抗兔辣根過氧化物酶耦聯二抗(1∶10 000)孵育2 h，洗滌后加入ECL化學發(fā)光液，采用Bio-Rad凝膠成像分析儀檢測并拍攝蛋白條帶，通過Image Lab 3.0軟件分析蛋白灰度值。

2.3.4 微量酶標法檢測GSH水平 取“2.3.3”項下另一半小鼠研磨腦組織粉末，加入0.9%氯化鈉溶液制成腦組織勻漿液，采用酶標儀檢測405 nm波長處吸光度，計算腦組織中GSH水平，具體步驟參照相關試劑盒說明書進行。

2.3.5 比色法檢測MDA水平 取“2.3.4”項下小鼠腦組織勻漿液，采用酶標儀檢測532 nm波長處吸光度，計算腦組織中MDA水平，具體步驟參照相關試劑盒說明書進行。

3 結果

3.1 五子衍宗丸抑制EAE小鼠的髓鞘脫失 圖1顯示，與佐劑組比較，模型組小鼠脊髓白質呈現大范圍髓鞘脫失(P<0.01)，表明模型制備成功；與模型組比較，五子衍宗丸組小鼠脊髓白質髓鞘脫失范圍減少(P<0.01)。

注：A為脊髓固藍染色，B為脊髓白質髓鞘脫失面積占比。與佐劑組比較，**P<0.01；與模型組比較，△△P<0.01。圖1 各組小鼠脊髓白質髓鞘脫失情況

3.2 五子衍宗丸減輕EAE小鼠脊髓的炎性細胞浸潤 圖2顯示，與佐劑組比較，模型組小鼠脊髓白質呈現大量炎性細胞浸潤(P<0.01)；與模型組比較，五子衍宗丸組小鼠脊髓白質僅有少量炎性細胞浸潤(P<0.01)。

注：A為脊髓HE染色，B為脊髓炎性浸潤灶占比。與佐劑組比較，**P<0.01；與模型組比較，△△P<0.01。圖2 各組小鼠脊髓炎性細胞浸潤情況

3.3 五子衍宗丸對氧化應激指標的影響 圖3顯示，與佐劑組比較，模型組小鼠腦組織CAT表達降低(P<0.05)，SOD表達呈降低趨勢，但差異無統計學意義(P>0.05)；與模型組比較，五子衍宗丸組小鼠腦組織CAT、SOD表達升高(P<0.01)。

注：A為Western blot蛋白條帶圖，B為不同組別CAT、SOD蛋白表達統計圖。與佐劑組比較，*P<0.05；與模型組比較，△△P<0.01。圖3 各組小鼠腦組織CAT、SOD表達

圖4顯示，與佐劑組比較，模型組小鼠腦組織GSH水平降低(P<0.05)，MDA水平升高(P<0.01)；與模型組比較，五子衍宗丸組小鼠GSH水平升高(P<0.01)，MDA水平降低(P<0.01)。

注：與佐劑組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，△△P<0.01。圖4 各組小鼠腦組織GSH、MDA水平

4 討論

近年來，研究者們日益關注到氧化應激機制在多發(fā)性硬化發(fā)病中的重要性[11]。正常生理狀態(tài)下，機體就有ROS等自由基的產生，也有抗氧化體系如CAT、SOD、GSH等發(fā)揮抗氧化的作用，氧化與抗氧化維持在一個動態(tài)平衡中。研究表明，中樞神經系統氧的需求量大以及自由基的清除能力弱，所以大腦、脊髓比其它組織器官更容易受到自由基的攻擊[11]；在多發(fā)性硬化病變中神經元就有大量的ROS產生，使氧化—抗氧化體系向氧化損傷一方傾斜[12]。脂類是中樞神經系統髓鞘的主要成分，約占髓鞘干重的70%，氧化應激狀態(tài)下，ROS等過多的自由基攻擊生物膜的不飽和脂肪酸，脂質過氧化產物增多，有研究表明大量的自由基可能是多發(fā)性硬化神經系統脫髓鞘的原因之一[13]。氧化應激引起的髓鞘受損，將加劇炎性細胞對中樞神經系統的浸潤，擴大機體的炎癥反應[14]。所以減輕多發(fā)性硬化的氧化應激損傷程度，是延緩其進展的熱門靶點。

在國家中醫(yī)藥管理局制定的疾病中醫(yī)治療的方案中，將多發(fā)性硬化以“痿病”來表述[15]。關于多發(fā)性硬化病因病機與病位的認識，雖然各中醫(yī)學者的觀點不統一，但是多數學者認為多發(fā)性硬化是腎虛為本，濕熱濁毒為標的疾病[16-17]?！叭耸忌瘸删?，精成而腦髓生”是中醫(yī)認識多發(fā)性硬化的理論基礎，若腎精虧損，則髓海不足。所以在多發(fā)性硬化的臨床中藥治療中多體現了補腎固髓的思想[17]。五子衍宗丸是至今仍在臨床上廣泛應用的補腎固精之良方。有研究表明，五子衍宗丸還可以改善衰老小鼠的學習、記憶能力，同時提升其免疫水平，具體機制可能與五子衍宗丸增強衰老小鼠的抗氧化能力有關[18]。五子衍宗丸及其拆方的單味中藥枸杞子、菟絲子對老年大鼠腦和心臟組織線粒體DNA的氧化損傷均具有保護作用[19]。單味中藥五味子通過提高SOD、GSH的水平，可以減輕氧化損傷，進而維持細胞膜的穩(wěn)定性[20]。在前期研究的基礎上，本研究進一步明確五子衍宗丸對EAE的治療作用，五子衍宗丸可以減輕EAE小鼠中樞神經系統的脫髓鞘反應，減少炎性細胞的浸潤，具體機制可能與SOD及CAT蛋白表達的上調、GSH水平增加、MDA水平降低相關，使氧化應激損傷程度減輕，從而對EAE小鼠的中樞神經系統產生保護作用。

本研究將為五子衍宗丸推廣到臨床治療多發(fā)性硬化提供科學思路和實驗依據，有助于開發(fā)五子衍宗丸的老藥新用領域，使五子衍宗丸擁有更為廣闊的發(fā)展?jié)摿颓熬啊?/p>