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    吳茱萸酒制前后對痛經(jīng)小鼠鎮(zhèn)痛活性的比較及藥效物質(zhì)基礎

    2021-12-24 06:25:30劉葉倩歐陽榮任衛(wèi)瓊龍紅萍
    中成藥 2021年12期
    關鍵詞:生品扭體吳茱萸

    劉葉倩,李 弘,龔 姍,歐陽榮,任衛(wèi)瓊,龍紅萍

    (湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院,湖南 長沙 410007)

    吳茱萸來源于蕓香科植物吳茱萸Euodiarutaecarpa(Juss.)Benth、石虎EuodiaRutaecarpa(Juss.)Benth.var.officinalis(Dode)Huang或疏毛吳茱萸EuodiaRutaecarpa(Juss.)Benth.var.bodinieri(Dode)Huang的干燥近成熟果實,主要功效為溫中散寒、降逆止痛[1]。《備急千金要方》“吳茱萸三兩,以清酒三升漬一宿,煮如蟻鼻沸……治產(chǎn)后腹中痛疾病”,且其酒制品用于鎮(zhèn)痛效果顯著[2],但其活性成分缺乏系統(tǒng)的研究。

    液質(zhì)聯(lián)用技術(Liquid chromatography-mass spectrometry,LC-MS)能快速、精確地鑒定分析所獲得的質(zhì)譜信息,在鑒別化合物方面具有明顯的優(yōu)勢,是定性定量分析中藥的重要手段[3-4]。故本實驗以痛經(jīng)小鼠為研究對象,觀察吳茱萸生品和酒制品的鎮(zhèn)痛作用,同時采用UPLC-Q-TOF-MS對吳茱萸的水提液進行系統(tǒng)的定性定量分析,對比酒制前后吳茱萸化學成分及含量變化,以期為吳茱萸酒制前后鎮(zhèn)痛活性物質(zhì)的研究提供實驗依據(jù)。

    1 材料

    1.1 動物 SPF級KM小鼠70只,雌性,體質(zhì)量18~20 g,購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司,實驗動物合格證號43004700051990,實驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK(湘)2016-0002。

    1.2 試劑與藥材 吳茱萸堿(批號110802-200606)、吳茱萸次堿(批號110801-201006)、蘆丁(批號0080-9705)對照品(中國食品藥品檢定研究院);檸檬苦素(批號1180-71-8,成都瑞芬思生物科技有限公司);去氫吳茱萸堿(批號67909-49-3,河北晨光生物科技集團股份有限公司)。苯甲酸雌二醇注射液(批號B180601,寧波三生生物科技有限公司);縮宮素注射液(批號H34022979,安徽宏業(yè)藥業(yè)有限公司);羅通定片(批號H14020787,山西云鵬制藥有限公司);ELISA試劑盒PGE2、ET-1、NO(批號20190702,上海晶天生物科技有限公司)。吳茱萸生品(湖南)、酒制品(湖南)均購于湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院,經(jīng)該院張裕民主任藥師鑒定為蕓香科疏毛吳茱萸的干燥近成熟果實。甲醇、乙腈(質(zhì)譜純,德國Merck Millipore公司);甲酸銨(質(zhì)譜純,美國Fisher公司);蒸餾水(深圳屈臣氏蒸餾水有限公司)。

    1.3 儀器 Agilent 1290UPlC-6540 Q-TOF-MS儀,配置MassHunter質(zhì)譜工作站和Mass analysis質(zhì)譜數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)、Agilent Masshunter Qualitative Analysis工作站中的分子特征提取(MFE)功能、TCM-DATA中藥成分數(shù)據(jù)庫、Agilent ZORBAX EcliPse Plus C18色譜柱(3.0 mm×100 mm,1.8 μm)(美國Agilent公司);S-23高速臺式離心機(湖南湘儀科教儀器有限公司);AUW120D電子分析天平(日本Shimadzu公司);MK3型酶標儀[賽默飛世爾(上海)儀器有限公司]。

    2 方法

    2.1 藥液制備

    2.1.1 水提物制備 取吳茱萸生品與酒制品各270 g于煎藥器中,分別加入10倍量蒸餾水浸泡30 min,武火加熱至沸騰后轉文火煎煮1 h,濾過,濾渣再加入8倍量蒸餾水,重復1次,40 min后過濾,合并2次濾液,采用旋轉蒸發(fā)儀減壓濃縮,真空干燥,得到吳茱萸生品、酒制品干膏各74.57 g,每1 g干膏相當于3.62 g中藥[5]。

    2.1.2 受試藥物制備 取吳茱萸生品、酒制品干膏各3.6 g,蒸餾水溶解稀釋,高、低生藥質(zhì)量濃度均分別為0.195、0.065 g/mL,即得。取羅通定片78片,碾碎成粉末,加蒸餾水,充分混勻,配制成質(zhì)量濃度為0.47 g/mL的混懸液,即得。

    2.2 UPLC-Q-TOF-MS分析

    2.2.1 對照品、供試品溶液制備

    2.2.1.1 供試品溶液 取3 g干膏置50 mL錐形瓶中,加入30 mL 70%甲醇,超聲處理30 min,冷卻,70%甲醇補充至超聲前質(zhì)量,離心,0.22 μm微孔濾膜過濾,即得。

    2.2.1.2 對照品溶液 分別精密稱取5 mg蘆丁、去氫吳茱萸堿、檸檬苦素、吳茱萸堿、吳茱萸次堿對照品,置于10 mL量瓶中,甲醇定容至刻度,0.22 μm微孔濾膜過濾,分別吸取0.1 mL于進樣瓶中,即得。

    2.2.2 分析條件

    2.2.2.1 色譜 Agilent ZORBAX EcliPse Plus C18色譜柱(3.0 mm×100 mm,1.8 μm);流動相乙腈(A)-0.05 mmol/L甲酸銨(B),梯度洗脫(0~5 min,5%~15% A;5~10 min,15%~35% A;10~20 min,35%~65% A;20~30 min,65%~5% A);體積流量0.4 mL/min;溫度25 ℃;進樣量1 μL。

    2.2.2.2 質(zhì)譜 電噴霧離子化(ESI),正離子分析模式檢測;采用Agilent標準調(diào)諧液ESI-l low Concentration Tuning Mix G1969-85000對進樣分析前的準確質(zhì)量數(shù)進行校正。一級質(zhì)譜質(zhì)量掃描范圍m/z100~1 700;脫溶劑氣體N2體積流量6.8 L/min;脫溶劑氣溫度325 ℃;鞘氣溫度350 ℃;毛細管電壓4.0 kV;Fragment電壓150 V。二級質(zhì)譜質(zhì)量掃描范圍m/z50~1 000;二級Fragment電壓10、20、40 V。

    2.3 鎮(zhèn)痛實驗

    2.3.1 分組及建模 70只小鼠按照體質(zhì)量隨機分為7組,每組10只,分別為正常組,模型組,吳茱萸生品低、高劑量組,吳茱萸酒制品低、高劑量組,羅通定組,除正常組外,其余各組小鼠皮下注射苯甲酸雌二醇10 d,每天1次,第1、10天注射劑量為10 mg/kg,第2~9天注射劑量為5 mg/kg。

    2.3.2 給藥 根據(jù)文獻[6]報道,吳茱萸人日用量為10 g,換算得到小鼠劑量為1.3 g/kg,以臨床用量為依據(jù),設定吳茱萸生品、酒制品高、低生藥劑量均分別為3.9、1.3 g/kg。從造模第5天開始,吳茱萸生品、酒制品高、低劑量組按照20 mL/kg灌胃體積分別予以0.195、0.065 g/mL受試藥物,羅通定組等劑量灌胃0.47 mg/mL混懸液,正常組、模型組灌胃給予等體積蒸餾水,連續(xù)5 d,每天1次。

    2.3.3 扭體反應考察 在末次給藥前24 h注射最后1次苯甲酸雌二醇,給藥后40 min按照10 U/kg劑量腹腔注射縮宮素,迅速觀察小鼠第1次出現(xiàn)扭體反應的時間,作為扭體潛伏期,并記錄30 min內(nèi)扭體反應發(fā)生的次數(shù)[7]。

    2.3.4 血清指標檢測 實驗結束后小鼠眼球取血,4 500 r/min離心10 min,取其上清液,按照說明書相關操作方法,采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測小鼠血清的前列腺素E2(prostaglandinE2,PGE2)、內(nèi)皮素-1(endothelin 1,ET-1)、一氧化氮(nitric oxide,NO)水平。

    3 結果

    3.1 鎮(zhèn)痛實驗

    3.1.1 小鼠扭體次數(shù)比 與正常組比較,模型組小鼠扭體次數(shù)增多(P<0.01),提示模型制備成功;與模型組比較,吳茱萸酒制品高劑量組小鼠扭體次數(shù)減少(P<0.01),酒制品低劑量組、生品高低劑量組小鼠扭體次數(shù)有所降低,但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);與同劑量生品組比較,吳茱萸酒制品高、低劑量組小鼠扭體次數(shù)減少,但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),見圖1。

    注:與正常組比較,▲▲P<0.01;與模型組比較,**P<0.01。圖1 吳茱萸對小鼠扭體次數(shù)的影響

    3.1.2 小鼠扭體潛伏期 與正常組比較,模型組小鼠扭體潛伏期縮短(P<0.01),提示模型制備成功;與模型組比較,吳茱萸生品、酒制品低、高劑量組小鼠扭體潛伏期延長(P<0.01);與同劑量生品組比較,吳茱萸酒制品高、低劑量組小鼠扭體潛伏期延長(P<0.05),見圖2。

    注:與正常組比較,▲▲P<0.01;與模型組比較,**P<0.01;與同劑量生品組比較,#P<0.05。圖2 吳茱萸對小鼠扭體潛伏期的影響

    3.1.3 小鼠血清PEG2、ET-1、NO水平 與正常組比較,模型組小鼠血清ET-1水平升高,PEG2、NO水平降低(P<0.01);與模型組比較,吳茱萸生品高、低劑量組小鼠血清PGE2、NO水平升高,ET-1水平降低,但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),吳茱萸酒制品高、低劑量組小鼠血清PEG2、NO水平升高,ET-1水平降低(P<0.05,P<0.01);與同劑量生品組比較,吳茱萸酒制品高、低劑量組小鼠血清PGE2水平升高(P<0.01),NO水平有所升高,ET-1水平有所降低,但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),見圖3。

    注:與正常組比較,▲▲P<0.01;與模型組比較,*P<0.05;**P<0.01;與同劑量生品組比較,##P<0.01。圖3 吳茱萸對小鼠血清PGE2、ET-1、NO水平的影響

    3.2 UPLC-Q-TOF-MS分析 圖4~5顯示,從吳茱萸生品、酒制品中鑒定出24個化合物,其中前者20個,后者24個,見表1。

    表1 吳茱萸生品、酒制品所含成分質(zhì)譜信息

    圖4 供試品正離子流色譜圖

    吳茱萸酒制后,其主要鎮(zhèn)痛成分蘆丁、去氫吳茱萸堿、檸檬苦素、吳茱萸堿、吳茱萸次堿含量發(fā)生明顯變化,并明顯高于生品,見表2。

    表2 吳茱萸酒制前后主要鎮(zhèn)痛成分含量變化

    4 討論

    吳茱萸史載于《神農(nóng)本草經(jīng)》,列為中品,其言“主溫中下氣止痛”,具有散寒止痛之功[1]。吳茱萸能通過減緩縮宮素引起的子宮平滑肌收縮頻率及收縮力度,起到緩解痛經(jīng)的作用[8]。酒能入血分,主行藥勢,能增強吳茱萸溫熱之性、散寒止痛之功[9]。痛經(jīng)患者以寒證為主,針對寒證痛經(jīng)患者,溫經(jīng)散寒為其治療之根本[10]。但吳茱萸酒制前后鎮(zhèn)痛效果與有效成分之間的相關性鮮有報道。LC-MS是液相色譜和質(zhì)譜技術的結合體,既有前處理簡便,化合物信息豐富等優(yōu)點,同時可結合質(zhì)譜裂解規(guī)律,用于中藥未知成分解析,是目前中藥化學成分鑒定分析的重要手段[11]。因此,本實驗選用痛經(jīng)小鼠模型考察其鎮(zhèn)痛作用,并運用UPLC-Q-TOF-MS技術比較吳茱萸酒制前后有效成分的變化,以期為吳茱萸酒制前后鎮(zhèn)痛活性物質(zhì)的研究提供實驗依據(jù)。初步闡明吳茱萸鎮(zhèn)痛的物質(zhì)基礎。

    1.蘆丁 2.去氫吳茱萸堿 3.檸檬苦素 4.吳茱萸堿 5.吳茱萸次堿圖5 對照品正離子流色譜圖

    痛經(jīng)的發(fā)病機理與月經(jīng)期PGE2、ET-1、NO、OT的變化有關。前列腺素(prostaglandin,PG)作為重要的炎性物質(zhì),月經(jīng)期間PGE2水平降低,使得子宮內(nèi)膜細胞破壞,釋放大量的前列腺素E2α(prostaglandin E2ɑ,PGE2ɑ),引起子宮平滑肌強烈收縮,從而導致痛經(jīng)[12-14]。ET-1和NO是子宮內(nèi)膜中作用相反的兩種血管活性物質(zhì),ET-1水平的增高使血管強烈收縮,產(chǎn)生疼痛[15];NO則表現(xiàn)出對痛經(jīng)的雙向調(diào)節(jié)作用,含量升高時可抑制子宮收縮,緩解疼痛;降低可引起子宮強烈收縮,加重痛經(jīng)癥狀[16-17]。本實驗發(fā)現(xiàn),痛經(jīng)模型組小鼠扭體次數(shù)增加,潛伏期縮短,PGE2、NO水平降低,ET-1水平升高,提示造模成功。經(jīng)吳茱萸干預后,給藥組小鼠扭體次數(shù)減少、潛伏期延長,PGE2、NO水平升高,ET-1水平降低,其中酒制品高劑量組效果顯著(P<0.01)。提示酒制后吳茱萸鎮(zhèn)痛療效增加。

    借助UPLC-Q-TOF-MS技術,在吳茱萸水提物化學成分中共鑒別出24種化合物,其中吳茱萸生品20種,吳茱萸酒制品24種。吳茱萸酒制后山柰酚-3-鼠李糖基葡萄糖苷-7-葡萄糖苷、蘆丁、Evollionines A、吳茱萸酰胺成分增加。其中蘆丁的鎮(zhèn)痛活性早有報道[18]。Carvalho等[19]提出蘆丁可通過下調(diào)粒細胞集落刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor,G-CSF)的表達,減輕炎癥反應,起到緩解疼痛的目的。且在糖尿病大鼠中發(fā)現(xiàn),蘆丁可通過抑制福爾馬林試驗反應,逆轉糖尿病大鼠的化學痛覺過敏和認知障礙[20]。已有研究報道蘆丁、吳茱萸堿、檸檬苦素、吳茱萸次堿及去氫吳茱萸堿等成分具有鎮(zhèn)痛作用[21]。本實驗對吳茱萸酒制前后主要鎮(zhèn)痛成分蘆丁、去氫吳茱萸堿、檸檬苦素、吳茱萸堿以及吳茱萸次堿的含量進行了比較,發(fā)現(xiàn)酒制后五種鎮(zhèn)痛成分含量均有不同程度增加,以蘆丁、吳茱萸堿和檸檬苦素的含量變化最為明顯,提示吳茱萸酒制后鎮(zhèn)痛作用的增強可能與蘆丁、去氫吳茱萸堿、檸檬苦素、吳茱萸堿以及吳茱萸次堿五種鎮(zhèn)痛成分含量的增加有關。

    綜上,吳茱萸酒制前后鎮(zhèn)痛活性與其有效成分及含量變化發(fā)生一定程度的改變有關,為吳茱萸酒制前后藥效物質(zhì)基礎研究提供實驗依據(jù);但其酒制前后成分及含量變化及其原因,以及這些成分對痛經(jīng)小鼠鎮(zhèn)痛的具體作用機制有待進一步研究。

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