高效液相色譜法測(cè)定毛櫻桃中維生素C含量

徐雅倩，鄭龍華，楊帆，姜雨婷，曹玉珍，田超，張曉燕

(通化師范學(xué)院 食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林 通化 134000)

毛櫻桃[學(xué)名：Cerasus tomentosa(Thunb.)Wall]，俗稱山櫻桃，薔薇科，櫻屬，落葉灌木[1-2],主要生長(zhǎng)在北半球溫帶地區(qū)，吉林省長(zhǎng)白山區(qū)有大量分布[3].毛櫻桃富含蛋白質(zhì)、碳水化合物、微量元素以及多種維生素，研究表明毛櫻桃不僅具有食用價(jià)值，還有多種保健或藥用功效[4-6].毛櫻桃中維生素C含量比較豐富，但對(duì)其含量檢測(cè)的報(bào)道較少，并且開(kāi)發(fā)利用的研究也不多見(jiàn).維生素C主要包括還原型的L-抗壞血酸(L-Vc)和氧化型的D-異抗壞血酸(D-Vc)，兩者在人體內(nèi)均不能自動(dòng)合成，主要從日常的蔬菜、水果等膳食中獲取[7-8].L-抗壞血酸可以作為食品添加劑，應(yīng)用于食品工業(yè)中，例如用于防止食品腐敗變質(zhì).D-異抗壞血酸的生理活性極低，僅為L(zhǎng)-抗壞血酸的0.05[9-10].

目前，使用高效液相色譜法測(cè)定不同構(gòu)型的抗壞血酸的研究已經(jīng)取得了一定進(jìn)展，文獻(xiàn)[11]報(bào)道的方法解決了樣品前處理復(fù)雜、被測(cè)物性質(zhì)不穩(wěn)定、分離度低的問(wèn)題.張曉燕等[8]借助高效液相色譜儀縮短樣品分析時(shí)間，在短時(shí)間內(nèi)更準(zhǔn)確地進(jìn)行維生素C含量的測(cè)定.文獻(xiàn)報(bào)道中多數(shù)都是對(duì)L-抗壞血酸進(jìn)行檢測(cè).本研究使用高效液相色譜法對(duì)毛櫻桃中的L-抗壞血酸、D-異抗壞血酸的兩種成分進(jìn)行檢測(cè)，研究了毛櫻桃中維生素C的總量.該方法提取過(guò)程嚴(yán)格避光、熱，避免了氧化問(wèn)題.研究結(jié)果為毛櫻桃的食用、藥用價(jià)值及未來(lái)的開(kāi)發(fā)利用提供一定的參考.

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

高效液相色譜儀(LC-20AT型)，日本島津有限公司；紫外檢測(cè)器(LC-20A型)，日本島津有限公司；色譜柱(Inert Sμstain C18, 5 μm, 4.6×250 mm)，廣州步步宏科學(xué)儀器設(shè)備有限公司；電子天平(AL104型、感量0.1 mg)，上海亞津電子科技有限公司；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(DHG-9101-3S 型)，上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司；電子天平(YP1002、感量0.01 mg)，上海恒平有限公司；超聲波清洗器(KQ-100E 型)，昆山市超聲儀器有限公司.

偏磷酸、磷酸(分析純)，天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；甲醇(色譜純)，天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；L-抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥99%，產(chǎn)品編號(hào)：C10059331)，上海麥克林生化科技有限公司；D-異抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98%，產(chǎn)品編號(hào)：Y30D6C8306)，江蘇綠葉生物科技有限公司；試驗(yàn)用水均為市售娃哈哈水(pH為5.0～7.0，電導(dǎo)率不大于10 μS/cm).毛櫻桃樣品：采摘于吉林省長(zhǎng)白山區(qū)通化師范學(xué)院校園周邊.

1.2 樣品溶液的提取

維生素C的穩(wěn)定性較差，在pH值大于或等于7的條件下易被氧化.為保證維生素C的穩(wěn)定性，減少其含量的損失，應(yīng)在其pH值低于7的條件下進(jìn)行提取[12-13].

將除去果核的山櫻桃果肉精確稱取3 g，在避光條件下，放入研缽中加入10 mL 20 g/L的偏磷酸溶液進(jìn)行充分研磨提取，將樣品溶液全部轉(zhuǎn)移至50 mL棕色容量瓶，使用20 g/L的偏磷酸溶液稀釋定容，搖勻，先使用濾紙進(jìn)行過(guò)濾，濾液再用0.45 μm濾膜進(jìn)行過(guò)濾，做好標(biāo)記，立即上機(jī)測(cè)定.

1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

精密稱取L-抗壞血酸、D-異抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)品各10 mg至10 mL容量瓶中，使用20 g/L偏磷酸溶解并定容至刻度，配制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液.分別吸取不同體積的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，使用偏磷酸溶液依次稀釋成質(zhì)量濃度為0.05、0.10、0.50、1.00、10.00、50.00 μg/mL的L-抗壞血酸、D-異抗壞血酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，選用0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，待測(cè).

1.4 色譜條件

檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇：將標(biāo)準(zhǔn)品溶液注入液相色譜儀進(jìn)行檢測(cè)波長(zhǎng)掃描，在200～400 nm范圍內(nèi)掃描，根據(jù)紫外吸收情況確定檢測(cè)波長(zhǎng)為245 nm.

流動(dòng)相比例的篩選：國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中選用的流動(dòng)相比較復(fù)雜，本課題對(duì)流動(dòng)相進(jìn)行調(diào)整，選用0.05 mol/L磷酸溶液∶甲醇作為流動(dòng)相，體積比選擇了5種比例進(jìn)行檢測(cè)，分別為90∶10、93∶7、95∶5、96∶4、98∶2.根據(jù)色譜峰分離度、保留時(shí)間等進(jìn)行對(duì)比分析，最終選擇體積比98∶2為最佳比例.

流速的篩選：本文更換了流動(dòng)相種類(lèi)，所以選用0.90、0.80、0.70 mL/min這3種流速進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)色譜峰分離度及保留時(shí)間，確定最佳流速為0.70 mL/min.

柱溫的篩選：根據(jù)參考文獻(xiàn)[13]，并結(jié)合試驗(yàn)期間實(shí)驗(yàn)室具體溫度，柱溫選擇25 ℃.

2 結(jié)果與討論

2.1 儀器精密度

精密吸取L-抗壞血酸、D-異抗壞血酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(5 μg/mL)20 μL，在篩選的色譜條件下進(jìn)行檢測(cè)，連續(xù)測(cè)定6次.使用6次測(cè)定結(jié)果的峰面積值計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果如表1所列.由表1可知L-抗壞血酸的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.6%，D-異抗壞血酸的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.6%，結(jié)果表明該儀器精密度較好，完全滿足檢測(cè)需要.

表1 L-抗壞血酸、D-異抗壞血酸精密度測(cè)定結(jié)果(n=6)

2.2 定性分析

在1.4色譜條件下，精密吸取流動(dòng)相、標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液(10 μg/mL)、毛櫻桃樣品溶液各20 μL注入液相色譜儀進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖1所示.由圖1(b)可知，L-抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間為7.299 min，D-異抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間為7.742 min，分離度為1.50.由圖1(c)可知，毛櫻桃樣品溶液色譜峰保留時(shí)間為7.282 min，流動(dòng)相在該時(shí)間段內(nèi)沒(méi)有色譜峰，可以確定樣品溶液中檢出L-抗壞血酸，未檢測(cè)出D-異抗壞血酸.

圖1 流動(dòng)相、抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)品及毛櫻桃樣品色譜圖

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

精密吸取20 μL、不同濃度的抗壞血酸混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液注入液相色譜儀.以標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)x，色譜峰面積為縱坐標(biāo)y，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果如圖2所示.由圖2可知，L-抗壞血酸線性回歸方程：y=103 824.84x-7 302.52，相關(guān)系數(shù)r為1.0.D-異抗壞血酸線性回歸方程：y=107 724.19x-3 931.70，相關(guān)系數(shù)r為1.0.根據(jù)上機(jī)分析結(jié)果可知：L-抗壞血酸和D-異抗壞血酸兩者在0.05～50.00 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，滿足定量分析需要.

圖2 L-抗壞血酸、D-異抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

2.4 樣品L-抗壞血酸含量測(cè)定

精密吸取毛櫻桃樣品溶液20 μL，注入液相色譜儀進(jìn)行分析.分析得到的色譜峰面積結(jié)果帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線，可得L-抗壞血酸的質(zhì)量濃度為4.945 μg/mL.再根據(jù)取樣量，計(jì)算出毛櫻桃中L-抗壞血酸的含量為8.24 mg/100 g.

2.5 L-抗壞血酸含量重復(fù)性試驗(yàn)

稱取6份毛櫻桃樣品進(jìn)行平行試驗(yàn)，按照1.2方法提取，并且按照1.4色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)外標(biāo)法計(jì)算毛櫻桃中L-抗壞血酸的含量，結(jié)果如表2所列.由表2可知，6次重復(fù)試驗(yàn)測(cè)得毛櫻桃中L-抗壞血酸的含量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.3%，表明本試驗(yàn)方法的重復(fù)性較好.

表2 L-抗壞血酸的含量重復(fù)性測(cè)定結(jié)果

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

采用新配制的L-抗壞血酸和D-異抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液(10 μg/mL)考察兩種成分溶液的穩(wěn)定性.將配好的標(biāo)準(zhǔn)品溶液每隔4 h進(jìn)行一次檢測(cè)，進(jìn)樣量為20 μL，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)品溶液在24 h內(nèi)的相對(duì)平均標(biāo)準(zhǔn)偏差，考察其穩(wěn)定性，結(jié)果如表3、4所列.

由表3可知，L-抗壞血酸在8 h時(shí)RSD為1.5%，在12 h時(shí)RSD為1.6%.即L-抗壞血酸在8 h之內(nèi)穩(wěn)定，8 h以外樣品溶液峰面積逐漸減小，樣品中L-抗壞血酸發(fā)生改變.因此在進(jìn)行L-抗壞血酸含量檢測(cè)時(shí)應(yīng)在8 h之內(nèi)盡快檢測(cè)完畢，避免由于其發(fā)生變化而引起計(jì)算結(jié)果偏差.

表3 L-抗壞血酸穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

由表4可知，D-異抗壞血酸在4 h時(shí)RSD為1.6%，說(shuō)明D-異抗壞血酸穩(wěn)定性較差.進(jìn)行D-異抗壞血酸含量檢測(cè)時(shí)應(yīng)立即進(jìn)行檢測(cè)，避免由于其發(fā)生變化而引起計(jì)算結(jié)果偏差.

表4 D-異抗壞血酸穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

2.7 加標(biāo)回收試驗(yàn)

根據(jù)L-抗壞血酸含量測(cè)定結(jié)果(8.24 mg/100 g)，分別稱取質(zhì)量相近的樣品3份，每份樣品中分別加入100.00、250.00、500.00 μg的L-抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)品.再另外稱取3份樣品加入D-異抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)品，按照1.2樣品提取處理方法進(jìn)行處理，在1.4色譜條件下進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果如表5所列.由表5可知，L-抗壞血酸的平均加標(biāo)回收率為90.83%～92.52%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.9%.D-異抗壞血酸的平均加標(biāo)回收率為91.93%～92.99%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.7%，表明此方法結(jié)果良好.

表5 L-抗壞血酸、D-異抗壞血酸加標(biāo)回收率試驗(yàn)

3 結(jié)論

本文采用高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定山櫻桃中L-抗壞血酸和D-異抗壞血酸的含量，方法方便快捷，準(zhǔn)確度好、靈敏性高、回收率好.檢測(cè)出毛櫻桃中L-抗壞血酸含量為8.24 mg/100 g，未檢出D-異抗壞血酸.此方法樣品前處理簡(jiǎn)單，可減少毛櫻桃中不同構(gòu)型抗壞血酸含量的損失.試驗(yàn)的測(cè)定結(jié)果表明毛櫻桃中L-抗壞血酸的含量較高，D-異抗壞血酸未測(cè)定出，此研究結(jié)果可為毛櫻桃的L-抗壞血酸的開(kāi)發(fā)利用及其他研究提供一定的參考.