三種測定蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性方法的比較

周翠燕，俞敏達(dá)，李文奇

(1.清華大學(xué) 生命科學(xué)與醫(yī)學(xué)研究院，北京 100084; 2.國家蛋白質(zhì)科學(xué)研究(北京)設(shè)施清華基地，北京 100084; 3.清華大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院， 北京 100084； 4.清華大學(xué) 結(jié)構(gòu)生物學(xué)高精尖創(chuàng)新中心，北京 100084; 5.北京市第四中學(xué)國際校區(qū)，北京 100032)

蛋白質(zhì)在加熱過程中會發(fā)生熱變性解折疊，蛋白質(zhì)的熱變性中點(diǎn)溫度(melting temperature，Tm)是指在蛋白質(zhì)解折疊50%時(shí)對應(yīng)的溫度[1].蛋白質(zhì)的熱變性過程與其空間構(gòu)象的改變密切相關(guān)，Tm值能反映變溫過程中蛋白質(zhì)構(gòu)象改變的趨勢，是衡量蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性的一個重要指標(biāo)[2].蛋白質(zhì)Tm值的測定在生物醫(yī)藥行業(yè)具有廣泛的應(yīng)用，如嗜熱蛋白、工業(yè)酶等的改造與篩選[3]，蛋白質(zhì)藥物與配體、制劑或輔料的相互作用，蛋白質(zhì)藥物的緩沖液穩(wěn)定條件篩選等[4].目前，常用的蛋白質(zhì)Tm值的測定方法有差示掃描量熱法(differential scanning calorimetry，DSC)、圓二色光譜法(circular dichroism，CD)和差示掃描熒光法(differential scanning fluorimetry，DSF)等.

差示掃描量熱法的應(yīng)用始于20世紀(jì)60年代，是在程序控溫下，通過測量輸給待測物和參比物的功率差與溫度的關(guān)系，以獲得吸放熱量的技術(shù)[5].差示掃描量熱法能定量測量熱力學(xué)參數(shù)，可提供與蛋白質(zhì)熱變性過程中構(gòu)象變化有關(guān)的熱效應(yīng)信息[4, 6-7].圓二色譜法同樣誕生于20世紀(jì)60年代，其原理是利用左、右兩束偏振光透過具有手性結(jié)構(gòu)的生物大分子等活性介質(zhì)，獲得的圓二色譜來分析其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，是蛋白質(zhì)、核酸、糖類等生物大分子二級結(jié)構(gòu)分析的常規(guī)手段之一[8].變溫過程中測量蛋白等物質(zhì)的圓二色譜，能反映其隨溫度升高結(jié)構(gòu)變化的趨勢，所以圓二色譜法也是測定蛋白質(zhì)Tm值的有效方法[9].差示掃描熒光法(也被稱作ThermoFluor)出現(xiàn)于2001年，Pantoliano等[10]最先應(yīng)用此技術(shù)測定了上百種蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性.差示掃描熒光法分為添加外源熒光染料與不添加熒光染料兩種方式，都是利用加熱使蛋白內(nèi)部疏水基團(tuán)暴露這一特點(diǎn)進(jìn)行檢測.前者通過添加與蛋白疏水部分親和而產(chǎn)生熒光信號的染料，追蹤記錄變溫過程中熒光信號的變化曲線來測定Tm值，后者則是通過檢測蛋白去折疊過程中帶有熒光生色基團(tuán)的芳香族氨基酸(色氨酸和酪氨酸)所處疏水環(huán)境的變化來檢測Tm值.

為了比較這三種廣泛應(yīng)用的蛋白質(zhì)Tm值測定方法的檢測特點(diǎn)和檢測效果，本文選擇了5種具有不同結(jié)構(gòu)特點(diǎn)的蛋白質(zhì)進(jìn)行分析.單結(jié)構(gòu)域單體的arabidopsis pyrabactin resistant like 10(PYL 10)、單結(jié)構(gòu)域同源二聚體的arabidopsis pyrabactin resistant like 2(PYL 2)、多結(jié)構(gòu)域單體的protein disulfide isomerase(PDI)、多結(jié)構(gòu)域單體的Middle East respiratory syndrome 27(MERS-27)及多結(jié)構(gòu)域多種聚集狀態(tài)的bovine serum albumin(BSA)，其分子量、二級結(jié)構(gòu)和高級結(jié)構(gòu)特點(diǎn)等信息如表1(按分子量大小排序)所列.試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，三種方法所測的5類蛋白的Tm值整體上較為一致，但也存在一定差異.而結(jié)構(gòu)更復(fù)雜的蛋白，并不一定有更多個Tm值.

表1 蛋白質(zhì)樣品信息匯總

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器

差示掃描量熱儀，馬爾文公司，型號為MicroCal Manual Vp-cap DSC(VP-DSC)；圓二色光譜儀，英國應(yīng)用光物理(Applied Photophysics Ltd)，型號為Chirascan plus；差示掃描熒設(shè)備，Nanotemper公司，型號為Prometheus NT.48.

1.2 菌株與質(zhì)粒

SnRK2.6、PYL 10基因由清華大學(xué)顏寧實(shí)驗(yàn)室惠贈，PDI基因由中國科學(xué)院生物物理所王志珍實(shí)驗(yàn)室惠贈，MERS-27基因由王新泉實(shí)驗(yàn)室惠贈，BSA購買自北京索萊寶科技有限公司，大腸桿菌DH5α和BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室制備，HEK293F細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng).

1.3 酶與生化試劑

質(zhì)粒小提試劑盒購自天根生物科技有限公司，蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)marker為本實(shí)驗(yàn)室制備；用于制備緩沖劑的Tris，NaCl，HEPES購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，純度均大于99%；Ni-NTA鎳柱柱材購自Qiagen公司；Sources Q、Superdex 200、protein A色譜柱購自Cytiva公司.

1.4 蛋白質(zhì)表達(dá)

將表達(dá)質(zhì)粒pet15D-PYL 10、pet15D-PYL 2、pet15D-PDI轉(zhuǎn)化至BL21感受態(tài)細(xì)胞，涂板過夜培養(yǎng)，挑菌點(diǎn)接種至100 mL氨芐抗性LB培養(yǎng)基中, 37 ℃、220 r/min培養(yǎng)3～4 h, 以1∶100的比例將菌液轉(zhuǎn)接至1 L氨芐抗性LB培養(yǎng)基中, 培養(yǎng)3～4 h至OD600(即600 nm時(shí)的光密度值)約為0.8～1時(shí)降溫至18 ℃，平衡1 h后加入0.2 mmol/L異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)表達(dá)過夜，收菌體用于后續(xù)蛋白的純化.

MERS-27使用293F細(xì)胞表達(dá)，將輕鏈、重鏈質(zhì)粒、線性聚乙烯亞胺(PEI)按質(zhì)量比1∶1.2∶2混合于293培養(yǎng)基中孵育30 min，轉(zhuǎn)染生長期對數(shù)期的293F(按1 L細(xì)胞約加入1 mg質(zhì)粒比例加入)，培養(yǎng)約48 h離心收取上清純化抗體.

1.5 親和層析、離子交換層析與分子排阻層析

PYL 10、PYL 2、PDI使用Ni-NTA親和掛柱，250 mmol/L咪唑洗脫.抗體MERS-27使用protein A親和掛柱，1 mol/L pH為2.7甘氨酸洗脫后過分子篩.

PYL 10、PYL 2、PDI使用陰離子交換柱Sources Q進(jìn)一步分離純化，使用緩沖液buffer A(250 mmol/L Tris pH為8.5)稀釋蛋白樣品約3倍體積后上Sources Q柱，以緩沖buffer B(250 mmol/L Tris pH為8.5, 1 mol/L NaCl)進(jìn)行5%～50%體積比梯度洗脫，收取純度較高的部分進(jìn)行濃縮過分子篩.

將Superdex 200層析柱用pH為7.2，10 mmol/L HEPES，150 mmol/L NaCl緩沖液平衡，分別純化PYL 10、PYL 2、PDI、MERS-27、BSA(干粉溶解至1 mg/mL過柱)，收取純度較高部分測定其濃度.

1.6 Bradford法蛋白質(zhì)定量

取1 mL 1倍關(guān)系的考馬斯亮藍(lán)G-250稀釋液于1.5 mL離心管中, 根據(jù)蛋白質(zhì)溶液的濃度加入1～20 μL蛋白質(zhì)溶液并混合均勻，使用分光光度計(jì)測量595 nm吸收值，根據(jù)事先制作標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算蛋白濃度，并將蛋白濃度調(diào)整至0.5～0.7 mg/mL用于后續(xù)Tm值測定.

1.7 三種Tm值測量方法參數(shù)設(shè)置與試驗(yàn)操作

三種方法的變溫范圍均為20～95 ℃，變溫速率均為1 ℃/min.緩沖液條件均為10 mmol/L HEPES pH為7.2、150 mmol/L NaCl，樣品質(zhì)量濃度均在0.5～0.7 mg/mL.三種Tm測量方法的樣品用量與試驗(yàn)時(shí)長信息如表2所列.

表2 三種測量方法的樣品用量與試驗(yàn)時(shí)長比較

1.7.1 差示掃描量熱法

首先在樣品池中加入緩沖液重復(fù)4次變溫程序以獲得較準(zhǔn)確的基線，再分別測定不同樣品獲得變溫曲線.

1.7.2 圓二色光譜法

單點(diǎn)變溫法：每個樣品先進(jìn)行190～280 nm的波譜掃描，確定其CD信號最高或最低的波長(即變溫實(shí)驗(yàn)中變化最顯著的波長)，在該波長下進(jìn)行變溫掃描實(shí)時(shí)檢測(主要分布在210～220 nm).

多點(diǎn)變溫法：抗體樣品檢測中使用了多點(diǎn)變溫法，變溫掃描過程中檢測整個205～250 nm波段的變化.單點(diǎn)變溫?cái)?shù)據(jù)數(shù)據(jù)采用sigmoid或者double sigmoid模型擬合，選取最優(yōu)模型擬合結(jié)果，多點(diǎn)變溫?cái)?shù)據(jù)使用global 3軟件分析.

1.7.3 差示掃描熒光法

利用毛細(xì)管吸取蛋白樣品約10 μL，5個蛋白樣品同時(shí)進(jìn)行變溫掃描檢測.

2 結(jié)果與討論

2.1 蛋白質(zhì)的表達(dá)與純化結(jié)果分析

蛋白PYL 2、PYL 10、PDI由原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)，使用Ni-NTA親和純化，洗脫的蛋白經(jīng)陰離子交換柱Sources Q進(jìn)一步純化.抗體MERS-27由293F細(xì)胞分泌表達(dá)，過protein A親和純化.5種蛋白最終經(jīng)分子篩Superdex 200純化后置換到相同的buffer條件中，純化結(jié)果dodecyl sulfate, sodium salt(SDS)-polyacrylamide gel electrophoresis(SDS-PAGE)如圖1所示.由圖1可見，分子量大小與預(yù)期一致，5種蛋白純度很高，均達(dá)到95%以上，調(diào)整其質(zhì)量濃度至0.5～0.7 mg/mL用于下一步測試分析.

圖1 蛋白純化的SDS-PAGE分析

2.2 差示掃描量熱法測定結(jié)果

差示掃描量熱法測定5個蛋白質(zhì)的變溫掃描曲線如圖2所示.由圖2可見，5種蛋白的Tm值分布在40～80 ℃之間，其中PYL 2圖譜是尖銳的單峰，而PYL 10、PDI、BSA及MERS-27圖譜則呈現(xiàn)峰高與峰寬均有所差異的雙峰，反映了5種蛋白質(zhì)在升溫?zé)嶙冃赃^程具有不同的解折疊特點(diǎn).

圖2 DSC變溫掃描曲線

2.3 圓二色譜法對蛋白Tm值的測定結(jié)果

圓二色譜法測定5個蛋白的變溫掃描曲線如圖3所示.由圖3可見，PYL 2的變溫曲線在50 ℃左右時(shí)，斜率變化很大.PDI的曲線分別在30～60、60～70 ℃區(qū)間時(shí)，出現(xiàn)兩個不同曲線斜率.而PYL 10與BSA曲線斜率變化均沒有PYL 2大，MERS-27在65～75 ℃區(qū)間的曲線由下降陡變?yōu)樯仙笥窒陆担茰y是因?yàn)榭贵w受熱從而析出沉淀.而析出的沉淀則影響了CD光譜的檢測，因而出現(xiàn)信號異常.

圖3 CD變溫掃描曲線

2.4 差示掃描熒光法對蛋白Tm值的測定結(jié)果

使用差示掃描熒光法測定5種蛋白質(zhì)樣品，試驗(yàn)得到的變溫掃描曲線如圖4所示.由圖4可見，對350/330 nm曲線(1)進(jìn)行一階求導(dǎo)，可以得到對應(yīng)的峰圖(2).一階導(dǎo)曲線可以直觀地反映受熱過程中蛋白結(jié)構(gòu)的變化情況，峰尖或波谷對應(yīng)蛋白的Tm值.

圖4 DSF變溫掃描曲線

2.5 三種方法測定蛋白Tm值的結(jié)果對比

差示掃描量熱法、圓二色譜法、差示掃描熒光法測定5種蛋白質(zhì)的Tm值的結(jié)果如表3所列.

表3 差示掃描量熱法、圓二色譜法、差示掃描熒光法對蛋白Tm值的測定結(jié)果統(tǒng)計(jì)及差異比較

使用三種測定方法對5種不同蛋白質(zhì)的Tm值進(jìn)行測量，每種方法重復(fù)三次，選取其中一次變溫曲線展示在結(jié)果中(圖2～4).樣品用量及所用時(shí)長見1.6節(jié)，可以看出樣品用量：差示掃描量熱法>圓二色譜法>差示掃描熒光法，測定的總用時(shí)長：差示掃描量熱法>圓二色譜法>差示掃描熒光.此外，軟、硬件操作及后期數(shù)據(jù)處理的便捷性：差示掃描熒光>差示掃描量熱法>圓二色譜法.三種方法測量蛋白樣品的Tm值高低均為MERS-27>BSA>PYL 10>=PDI>PYL 2，反應(yīng)的趨勢較為一致.

MERS-27的Tm值測定中，圓二色譜法曲線在65 ℃至75 ℃區(qū)間有信號異常[圖3(e)]，這是因?yàn)榭贵w受熱而沉淀析出影響了CD光譜的檢測.降低抗體濃度，采用多點(diǎn)變溫法測定獲得的數(shù)據(jù)表明抗體至少有一個確定的Tm值點(diǎn)71.5 ℃.在BSA的Tm值測定中，差示掃描量熱法圖譜顯示在78 ℃測得信號很低的峰，但圓二色譜法和差示掃描熒光法則沒有在該溫度點(diǎn)檢測到信號.

通過對三種檢測方法均檢測出的Tm值進(jìn)行單因素方差分析，發(fā)現(xiàn)三種檢測方法對PYL 10的Tm值檢測結(jié)果一致.圓二色譜法未測出MERS-27的Tm1，但測出的Tm2與其他兩種檢測方法結(jié)果一致.三種方法對PYL 2及PDI的檢測結(jié)果不一致，其中PYL 2的差示掃描量熱法與差示掃描熒光法檢測結(jié)果有一定的差異.PDI的三種檢測方法對其Tm1的檢測結(jié)果差異較為顯著.

3 結(jié)論

本文通過比較三種廣泛使用的蛋白質(zhì)Tm值測定方法分析5種不同特點(diǎn)的蛋白質(zhì)發(fā)現(xiàn)，雖然檢測原理各不相同，但不同方法測定的Tm值結(jié)果總體一致或相近，除PDI的Tm1外，其余結(jié)果均相差2 ℃以內(nèi).同為光譜學(xué)方法的圓二色譜法和差示掃描熒光法檢測結(jié)果具有更高的一致性.需要指出的是在檢測抗體MERS-27時(shí)，檢測過程中觀察到絮狀沉淀析出，推測是該沉淀干擾CD信號檢測而不能確定Tm1，這說明MERS-27抗體的Tm值雖高，但是受熱不穩(wěn)定，容易產(chǎn)生聚集.表明圓二色譜法不適合受熱易沉淀的蛋白質(zhì)的Tm值檢測，但是也可以利用這一特點(diǎn)作為抗體藥物等快速鑒定聚集產(chǎn)生的方法[16].

此外，圖譜中峰寬窄或曲線陡緩能夠在一定程度上反映結(jié)構(gòu)受熱變化的快慢.例如，三種方法對PYL 2的Tm值測定中，尖銳的峰型(DSC、DSF)或是陡變的曲線(CD)都表明這是一個比較快的變化過程.

已知研究結(jié)果顯示，抗體類蛋白在熱變性時(shí)具有不同熱穩(wěn)定性的各結(jié)構(gòu)域會先后去折疊，因而會檢測到多個Tm值[17-18].本文對比了蛋白Tm數(shù)量與蛋白結(jié)構(gòu)域及聚集形態(tài)的關(guān)系，PYL 2和PYL 10具有單結(jié)構(gòu)域，而PDI、BSA及MERS-27都具有多結(jié)構(gòu)域，而PYL 10，PDI，MERS-27在溶液中都是以單體形式存在， BSA具有多種聚合狀態(tài)，PYL 2則以二聚體形式存在[11-15].本文研究結(jié)果表明，結(jié)構(gòu)更復(fù)雜的蛋白，并不一定具有更多個Tm值.

比較三種方法實(shí)際操作的特點(diǎn)發(fā)現(xiàn)，DSF法在樣品用量及測定效率上更有優(yōu)勢，比較適合進(jìn)行高通量篩選.但該方法需要樣品含有色氨酸、酪氨酸或額外添加熒光染料，這可能會對樣品測量范圍帶來一定限制.DSC法雖然在樣品用量與檢測效率上不及DSF，但作為量熱的經(jīng)典方法仍是不可缺少的Tm值測量手段，在進(jìn)行批量樣品的熱穩(wěn)定性篩選時(shí)，聯(lián)合使用DSF法初篩，DSC法復(fù)篩是十分有效的組合方式.此外，DSC 能測定蛋白質(zhì)變性過程中的熱容變化ΔCp、焓變 ΔH、解折疊自由能ΔG、玻璃態(tài)轉(zhuǎn)變溫度、分子流動臨界溫度等其他重要熱力學(xué)參數(shù).CD作為檢測蛋白二級結(jié)構(gòu)的經(jīng)典方法，在Tm值測定方面具有其獨(dú)特優(yōu)勢和一定的局限性，也是研究加熱過程中蛋白結(jié)構(gòu)改變的重要方法[9].

蛋白質(zhì)Tm值測定具有重要的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值，例如輔助生物藥物開發(fā)、生產(chǎn)和質(zhì)量控制，評估生物相似性、優(yōu)化蛋白藥物配方等，還可以作為探索蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)的手段之一指導(dǎo)蛋白質(zhì)工程，如比較不同突變對蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的影響[19-20]，研究結(jié)構(gòu)域改變與功能活性改變關(guān)聯(lián)性等.比較不同Tm值測定方法，全面了解技術(shù)特點(diǎn)及測量效果對于Tm值測定的實(shí)際應(yīng)用具有一定的指導(dǎo)意義，在科研或生產(chǎn)工作中可以靈活選用或聯(lián)用多種技術(shù)來闡明不同條件下的結(jié)構(gòu)變化特點(diǎn).