肖 麒,吳彥兵,陳 煉,李 鵬
(1.南京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,江蘇 南京 210023) (2.南京林業(yè)大學(xué)生物與環(huán)境學(xué)院,江蘇 南京 210037)
14-3-3蛋白質(zhì)最早由Moore和Perez于1967 年在牛腦組織提取物中發(fā)現(xiàn),根據(jù)蛋白經(jīng)過DEAE cellulose(二乙氨乙基纖維素柱)層析中的片段數(shù)目以及其在凝膠電泳中的遷移率,將其命名為 14-3-3蛋白[1]. 14-3-3蛋白是一類廣泛存在于真核生物中分子量較小(27 kDa~32 kDa)的酸性調(diào)控蛋白家族[2],主要以穩(wěn)定的同源或異源二聚體形式存在于細(xì)胞質(zhì)中,其單體由9個反向平行的α-螺旋組成,哺乳動物 14-3-3 蛋白二聚體的的X射線結(jié)構(gòu)為U形,具有一個高度保守內(nèi)部凹槽[3]. 這個內(nèi)部凹槽是14-3-3與配體相互作用的結(jié)構(gòu)域,能容納來自單一蛋白質(zhì)結(jié)合伴侶的兩個區(qū)域或來自兩個蛋白質(zhì)結(jié)合伴侶的一個區(qū)域,用于調(diào)節(jié)14-3-3蛋白與靶蛋白結(jié)合[4]. 14-3-3蛋白分子有3個保守的堿性氨基酸組成,一個能與磷酸化磷酸基團形成離子鍵和氫鍵的口袋,這就解釋了14-3-3蛋白能夠與到含有磷酸化蘇氨酸和磷酸化絲氨酸的蛋白質(zhì)特異性結(jié)合的原因[5]. Ichimura等[6]首次對14-3-3蛋白家族的作用進行闡述,認(rèn)為 14-3-3 蛋白與酪氨酸羥化酶激活物有關(guān). 在有關(guān)釀酒酵母的蛋白質(zhì)互作研究中證明14-3-3蛋白可以與271種不同的磷酸化的蛋白質(zhì)相互作用,14-3-3蛋白與不同分子會產(chǎn)生不同的功能,比如:穩(wěn)定蛋白質(zhì)的活性或非活性磷酸化形式、改變構(gòu)象、亞細(xì)胞定位以及蛋白的相互作用關(guān)系[7]. 因此,14-3-3蛋白可以與不同蛋白質(zhì)結(jié)合從而參與多種磷酸化調(diào)節(jié)的信號通路,并在生物代謝[8]、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[9]、細(xì)胞周期控制[10]、凋亡[11]、蛋白質(zhì)運輸、轉(zhuǎn)錄[12]、應(yīng)激反應(yīng)[13]等方面發(fā)揮著重要作用.
14-3-3蛋白是由不同基因編碼產(chǎn)生,目前已知哺乳動物14-3-3蛋白有7個亞型,根據(jù)其在高效液相色譜(HPLC)的洗脫順序,用希臘字母(β、ε、γ、η、σ、τ、ζ/zeta)進行命名,并且這些亞型的表達(dá)量在不同類型的組織中存在差異[14]. 其中,14-3-3ζ蛋白因其在人類癌癥的形成和發(fā)展中所起的作用而廣為人知[15].14-3-3ζ作為一個重要的原癌基因,可與細(xì)胞內(nèi)多種分子相互作用,改變細(xì)胞信號傳導(dǎo)、調(diào)控細(xì)胞周期和抑制細(xì)胞凋亡,在惡性腫瘤的形成、生長、侵襲及轉(zhuǎn)移的過程中發(fā)揮了重要的生物學(xué)功能[16]. 大量研究也證實 14-3-3ζ在人類多種常見惡性腫瘤中呈高表達(dá),且其高表達(dá)水平不僅與腫瘤的轉(zhuǎn)移存在一定相關(guān)性,也與腫瘤耐藥、預(yù)后等方面存在一定相關(guān)性[17]. 此外,14-3-3ζ可能在免疫響應(yīng)中發(fā)揮著重要作用. 用脂多糖和肽聚糖等刺激三角渦蟲(Dugesiajaponica)時,14-3-3ζ表達(dá)顯著上調(diào)[18]. 通過RNA干擾技術(shù)證明14-3-3ζ可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架重塑參與埃及伊蚊(Aedesaegypti)和白紋伊蚊(A.albopictus)革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌的吞噬作用[19]. 實時定量PCR結(jié)果顯示,14-3-3ζ基因在擬穴青蟹(Scyllaparamamosain)各組織器官均有表達(dá),但在卵巢中的表達(dá)量顯著高于其他組織,在卵黃發(fā)生中期14-3-3ζ的表達(dá)量顯著高于增殖期,推測其在卵巢中發(fā)揮重要作用[20].但還未見關(guān)于中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis)14-3-3ζ基因的相關(guān)研究報道. 本研究采用cDNA末端快速擴增(Rapid amplification of cDNA ends,RACE)技術(shù)從中華絨螯蟹體內(nèi)克隆14-3-3ζ基因的cDNA全長序列,用生物信息學(xué)的方法對該基因的結(jié)構(gòu)與功能進行了初步分析,并對中華絨螯蟹的14-3-3ζ基因進行了選擇壓力分析,研究結(jié)果可為后續(xù)深入研究該基因的作用提供資料.
實驗用中華絨螯蟹均采自江蘇泰州興化中堡鎮(zhèn),殼長(30±5)mm. 實驗前在曝氣水中暫養(yǎng),水溫為(20±2)℃,期間用蝦蟹飼料喂養(yǎng),每天換一次水,使其適應(yīng)實驗室的養(yǎng)殖環(huán)境. 取第三步足肌肉組織 100 mg 轉(zhuǎn)移至含有1 mL Trizol 凍存管中,迅速用液氮凍存,用于提取總RNA.
提取總RNA按RNeasy Mini Kit(Qiagen,Germany)說明書于生物安全柜上操作,提取的RNA分裝后于-80 ℃保存. 取1 μL總RNA樣本稀釋50倍(即1 μL RNA樣品加入49 μL RNase-free water)于BioPhotometer核酸和蛋白質(zhì)定量儀(Eppendorf,Germany)上檢測RNA的濃度和純度(OD260/OD280),總RNA檢驗合格后用于后續(xù)實驗. 采用Super SMARTTMPCR cDNA Synthesis Kit(Clontech,Palo Alto,USA)進行cDNA的合成,操作按試劑盒說明書進行.
從 GenBank下載中華絨螯蟹近緣物種的14-3-3ζ的氨基酸序列后進行比對,找出上下游連續(xù)的保守位點,用 Primer Premier 5.0 設(shè)計cDNA末端快速克隆(RACE)反應(yīng)的特異引物(見表1),引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成.
表1 14-3-3ζ基因cDNA片段擴增所用引物與擴增片段大小Table 1 Nucleotide sequences of primers used in cDNA fragments amplified of 14-3-3ζ gene and amplicon length size
按照 SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit與Advantage?2 PCR Enzyme System(Clontech,Palo Alto,USA)試劑盒說明書,采用巢式PCR擴增中華絨螯蟹14-3-3ζ基因的5′末端序列. 以Primer primer 5.0 設(shè)計下游特異性引物GSP1-ζ5′,上游引物為試劑盒中的通用引物(universal primer,UPM)進行5′ RACE. 以第一次PCR產(chǎn)物為模板,用設(shè)計的下游引物GSP2-ζ3′和UPM 進行第二次PCR. RACE反應(yīng)(50.0 μL)體系為:10×Advantage 2 PCR buffer 5.0 μL,50×dNTP Mix(2.5 mmol/L)1.0 μL,Milli-Q water(Toyobo,Japan)34.5 μL,10×Universal Primer A Mix(10 μmol/L)5.0 μL,5′RACE/3′RACE特異引物(10 μmol/L)1.0 μL,RACE-Ready cDNA 2.5 μL,50×Advantage 2 polymerase(Clontech,USA)1.0 μL. PCR反應(yīng)參數(shù):94 ℃預(yù)變性 3 min;94 ℃ 30 s,68 ℃ 30 s,72 ℃ 3 min,25個循環(huán);72 ℃ 延伸10 min;4 ℃保存. 擴增產(chǎn)物通過1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測,用DNA回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物中的目的片段. 將目的片段連入pMD19-T載體,轉(zhuǎn)化到EscherichiacoliDH5α 感受態(tài)細(xì)胞后16 ℃連接過夜,通過藍(lán)白菌斑檢測挑選出陽性克隆送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行序列測定.
分別使用在線工具protparam(https://web.expasy.org/protparam/)、NetNGlyc(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/)、NetPhos(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)對中華絨螯蟹14-3-3ζ蛋白質(zhì)序列的理化性質(zhì)、糖基化位點和磷酸化位點進行分析和預(yù)測. 利用線上工具TMHM(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)和TMPRED(https://embnet.vitalit.ch/software/TMPRED_form.html)預(yù)測中華絨螯蟹14-3-3ζ蛋白質(zhì)序列的跨膜結(jié)構(gòu)區(qū),SignalP 4.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.1/)用于預(yù)測信號肽,14-3-3ζ蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位用PSORT II軟件(https://psort.hgc.jp/form2.html)預(yù)測.
從NCBI蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中下載節(jié)肢動物,軟體動物,扁盤動物和哺乳動物的14-3-3ζ蛋白質(zhì)序列,利用MAFFT[21]軟件的默認(rèn)參數(shù)將這些蛋白質(zhì)序列與中華絨螯蟹14-3-3ζ蛋白質(zhì)序列進行比對. 使用MEGA 7[22]軟件的鄰接法構(gòu)建無根的系統(tǒng)發(fā)生樹,設(shè)置自展重復(fù)1000次. 利用SMART(http://smart.emblheidelberg.de/)鑒定網(wǎng)上下載的14-3-3ζ蛋白質(zhì)序列與中華絨螯蟹14-3-3ζ蛋白質(zhì)序列的結(jié)構(gòu)域. 使用線上工具Phyre2(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index)預(yù)測中華絨螯蟹14-3-3ζ蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu). 根據(jù)三維結(jié)構(gòu)信息使用在線工具ESPript 3.0(http://espript.ibcp.fr/ESPript/cgi-bin/ESPr-ipt.cgi)繪制序列二級結(jié)構(gòu)圖. 從NCBI分別下載編碼南美對蝦(Penaeusvannamei)、擬穴青蟹(Scyllaparamamosain)、斑節(jié)對蝦(Penaeusmonodon)、墨吉對蝦(Penaeusmerguiensis)、端足蟲(Hyalellaazteca)和球鼠婦Armadillidiumnasatum14-3-3ζ蛋白的mRNA CDS序列,經(jīng)過上述相同的比對和構(gòu)樹方法分析后,利用CodeML中的分支模型(Branch model)檢測中華絨螯蟹14-3-3ζ基因是否受到選擇壓力[23].
在RACE反應(yīng)中,進行5′RACE和3′RACE PCR反應(yīng),通過測序分別獲得583 bp和433 bp的基因片段. 經(jīng)DNAStar Lasergene 7.1軟件[24]對位拼接后獲得1 081 bp的cDNA片段,經(jīng)BLAST比對驗證其為 14-3-3ζ 基因的cDNA全長序列(圖1).14-3-3ζ基因的全長cDNA序列具有一個98 bp的5′-端非翻譯區(qū)(terminal untranslated region,UTR)和一個239 bp的3′-端非翻譯區(qū). 它具有一個744 bp的開放閱讀框,編碼一個具有247個氨基酸的多肽. 結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果顯示該開放閱讀框編碼的氨基酸序列包含14-3-3保守結(jié)構(gòu)域,這個保守區(qū)域是14-3-3蛋白的典型的功能域. 翻譯的起始密碼子為ATG(位于99-101),終止密碼子為TGA(位于840~842位),其后沒有加尾信號AATAAA. 序列中A+T和C+G的百分比分別為47.92%和52.08%. 測定的序列經(jīng)比對、裝配后獲得全長cDNA序列并提交美國國家生物信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)保存(GenBank登錄號:MW473724). 將核苷酸序列推導(dǎo)的氨基酸序列在公共數(shù)據(jù)庫(NCBI的NR數(shù)據(jù)庫)進行同源性搜索比對后分析發(fā)現(xiàn),本實驗克隆的14-3-3ζ基因在氨基酸水平與擬穴青蟹(NCBI編號:AFD28274.1)的14-3-3蛋白一致度為97.58%,與南美白對蝦(NCBI編號:XP_027210306.1)的14-3-3蛋白一致度為97.57%,與斑節(jié)對蝦(Penaeusmonodon,登錄號XP_037791730.1)的14-3-3ζ蛋白一致度為95.14%;在核苷酸水平與擬穴青蟹(NCBI編號:JQ218935.1)14-3-3 ζ基因的一致度達(dá)94.19%,與南美白對蝦(NCBI編號:XM_027354505.1)和斑節(jié)對蝦(NCBI編號:XM_037935801.1)14-3-3 ζ基因的一致度分別為87.64%和87.45%. 上述序列之間較高的一致度進一步印證14-3-3蛋白在結(jié)構(gòu)和進化上的保守性. 進化樹結(jié)果顯示,中華絨螯蟹與擬穴青蟹親緣關(guān)系最近,與甲殼動物的斑節(jié)對蝦和墨吉對蝦聚為一小支,與節(jié)肢動物的遺傳距離較近,而與魚類及魚類以上的高等動物的遺傳距離相對較遠(yuǎn)(圖1). 選擇壓力分析表明中華絨螯蟹14-3-3ζ基因沒有受到正選擇壓力(P=0.69),其非同義替換與同義替換比值為0.016.因此,14-3-3ζ受到純化選擇,該蛋白的功能可能是保守的.
圖1 基于鄰接法構(gòu)建的中華絨螯蟹和其他物種 14-3-3ζ蛋白系統(tǒng)發(fā)生樹Fig.1 Phylogenetic tree of the 14-3-3ζ amino acidsequences between E.sinensis and other species using Neighbor-joining method
采用ProtParam工具進行14-3-3ζ蛋白理化性質(zhì)分析,結(jié)果表明14-3-3ζ蛋白的分子量約為28.0 kDa,理論等電點pI為4.70,原子總數(shù)3 899個,分子式為C1218H1934N336O402S9;在組成14-3-3 ζ蛋白的20種氨基酸中,谷氨酸(Glu)所占的比例最高,達(dá)到10.5%,其次是丙氨酸(Ala),占比達(dá)到9.30%,組氨酸(His)所占的比例最低,為0.4%;脂肪指數(shù)為77.45;14-3-3ζ蛋白質(zhì)的不穩(wěn)定指數(shù)為52.08,根據(jù)GRP(Guruprasad-Reedy-Pandit)法的分類,14-3-3 ζ蛋白不穩(wěn)定. 親水平均系數(shù)為-0.66,表明該蛋白質(zhì)可能為親水蛋白. 基于TMHMM和TMPRED的分析結(jié)果14-3-3ζ蛋白不存在跨膜區(qū). 14-3-3ζ蛋白的信號肽預(yù)測使用SignalP程序,通過S-平均值(mean S value)來判斷是否為分泌蛋白,若S-平均值大于0.5,則預(yù)測為分泌蛋白,存在信號肽;基于這種算法的結(jié)果表明,14-3-3ζ蛋白不含有信號肽序列,它為非分泌型蛋白. PSORT II server分析14-3-3 ζ蛋白的亞細(xì)胞定位結(jié)果表明14-3-3 ζ蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)中的可能性有43.5%,定位于細(xì)胞核和線粒體中的可能性均為17.4%. 14-3-3 ζ蛋白多肽鏈上含有5個蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)磷酸化位點,4個酪蛋白激酶II(casein kinase II,CK2)磷酸化位點,3個蛋白激酶A(cyclic-AMP dependent protein kinase A,PKA)磷酸化位點,2個酪蛋白激酶I(casein kinase I,CK1)磷酸化位點,2個重組鏈激酶(recombinant streptokinase,RSK)磷酸化位點,2個細(xì)胞周期依賴激酶1(cyclin-dependent kinase 1,cdc2),1個蛋白激酶G(protein kinase G),1個DNA 依賴的蛋白激酶(DNA-dependent protein kinase,DNAPK),1個絲氨酸蛋白激酶(Serine-protein kinase,ATM)磷酸化位點,促分裂素原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase,MAPK),原癌基因酪氨酸蛋白激酶(proto-oncogene tyrosine-protein kinase,SRC)和2個N端糖基化(Asn糖基化)位點(圖2). 14-3-3蛋白是一種重要的調(diào)控蛋白,該蛋白可以通過自身序列上的磷酸化位點調(diào)節(jié)許多蛋白質(zhì)的活性[25]. 比如,胰腺導(dǎo)管腺癌在缺氧條件下胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular regulated protein kinases,ERK)可以引起14-3-3ζ蛋白第37位絲氨酸發(fā)生磷酸化,促進YAP(Yes-associated protein)與14-3-3ζ蛋白復(fù)合體分離,并幫助YAP定位到細(xì)胞核從而增強低氧誘導(dǎo)因子-1(hypoxia inducible factor-1,HIF-1)依賴的 PKM2(糖酵解丙酮酸激酶)轉(zhuǎn)錄和糖酵解[26]. 因此,上述磷酸化位點可能在14-3-3ζ蛋白發(fā)揮生物學(xué)功能中起到重要作用.
灰色標(biāo)記為預(yù)測磷酸化位點,波浪線標(biāo)記為預(yù)測糖基化位點,黑體為起始/終止密碼子,下劃線標(biāo)記ORF驗證引物圖2 中華絨螯蟹14-3-3ζ基因的全長cDNA序列和推導(dǎo)的氨基酸序列結(jié)構(gòu)Fig.2 Nucleotide and deduced amino acid sequences of 14-3-3ζ gene from E.sinensis
使用Phyre2(protein homology/analog Y recognition engine)服務(wù)器對中華絨螯蟹14-3-3ζ蛋白的三級結(jié)構(gòu)建模,結(jié)果表明單項最高分模板(single highest scoring template)為隱孢子蟲(Cryptosporidiumparvum)14-3-3蛋白的晶體結(jié)構(gòu),230(93%)個中華絨螯蟹14-3-3ζ蛋白的氨基酸可以與該模板匹配,置信度為100%. 14-3-3ζ蛋白的二級結(jié)構(gòu)組分中存在9個α螺旋結(jié)構(gòu),不存在β折疊等結(jié)構(gòu),這一結(jié)果與擬穴青蟹14-3-3ζ蛋白結(jié)構(gòu)類似[20]. 多重序列比對結(jié)果顯示,不同物種的14-3-3ζ蛋白的9個α螺旋區(qū)域高度保守,表明14-3-3ζ蛋白在進化上高度保守. 14-3-3蛋白以同源或異源二聚體形式存在,由同源二聚體和異源二聚體形成的U型槽可以與單個或不同蛋白上的兩個模體(motifs)相互作用,從而調(diào)節(jié)不同14-3-3目標(biāo)蛋白互作,或改變單個目標(biāo)蛋白的構(gòu)象和活性[27]. 14-3-3ζ蛋白N末端的4個α螺旋參與二聚體的形成,14-3-3二聚體的形成是通過一個14-3-3單體的α1和α2對應(yīng)的另一個14-3-3蛋白單體的α3和α4相互作用形成[28]. 14-3-3ζ在C-末端序列一致度較低較差(圖3)可能是由于14-3-3ζ在與配體結(jié)合時,C端被拋出,暴露高度保守內(nèi)部凹槽,從而使14-3-3ζ與目標(biāo)蛋白結(jié)合[29].
圖3 代表性物種14-3-3ζ蛋白的氨基酸序列多重比對Fig.3 Alignment of the amino acid sequences of among different 14-3-3ζ proteins
本文克隆獲得了中華絨螯蟹14-3-3基因的全長cDNA序列,并對其蛋白結(jié)構(gòu)與理化性質(zhì)等進行了深入的生物信息學(xué)分析,通過序列同源性比對、序列結(jié)構(gòu)比較和一些生物信息學(xué)預(yù)測分析,結(jié)果表明14-3-3蛋白是14-3-3ζ家族成員,且在進化上較為保守,該蛋白為非分泌型蛋白,不具有跨膜區(qū)域,定位于細(xì)胞質(zhì)中,其分子量與已報道的14-3-3ζ蛋白分子量相近;14-3-3ζ蛋白具有家族保守的14-3-3結(jié)構(gòu)域,該蛋白結(jié)構(gòu)域上包含多個磷酸化位點可能在14-3-3ζ發(fā)揮生物學(xué)功能中起到重要作用. 選擇壓力分析表明中華絨螯蟹14-3-3ζ受到純化選擇,其功能可能高度保守.