內(nèi)生大豆間座殼Diaporthe sojae的子囊殼促生培養(yǎng)及鑒定

豆明珠,蒲順昌,閆淑珍,陳雙林

(南京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,江蘇 南京 210023)

Diaporthe在世界范圍內(nèi)分布,其生活方式包括內(nèi)生菌、腐生菌和病原菌[1].Diaporthe由Nitschke[2]引入,是間座殼科Diaporthacea的模式屬,該屬以Diaportheeres為模式種. 目前的國際藻類、真菌和植物的命名規(guī)則(ICN)要求對多型性真菌使用單一名稱[3]. Rossman等[4]基于命名優(yōu)先原則決定使用該屬較早的有性型名稱Diaporthe來代替其無性型名稱Phomopsis,解決該屬的命名問題.Diaporthe包括有性型和無性型兩種狀態(tài),有物種名記錄的Diaporthe為1 072個,Phomposis為989個(Index Fungorum 2019),但目前未能完全對其無性型和有性型的物種完成一一對應(yīng). Gomes等[5]詳細描述了Diaporthe中的54個物種,包括它們的的形態(tài)和分子序列信息. Dissanayake等[6]重點研究了目前已知的171種通過培養(yǎng)或直接測序它們的主模式標(biāo)本、附加模式標(biāo)本、等模式標(biāo)本或新模式標(biāo)本進行識別的相關(guān)的物種. 目前迫切需要重新制定Diaporthe的物種劃分[7].間座殼屬的形態(tài)學(xué)特征主要包括兩部分[8].間座殼屬Diaporthe的形態(tài)分類存在著物種界限模糊的問題[9],尤其是子囊殼大小、子囊的大小和子囊孢子的大小等,在相近物種之間經(jīng)常存在交叉,迫切需要重新制訂間座殼屬Diaporthe物種劃分的形態(tài)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)[7],因此,子囊殼、子囊和子囊孢子的成熟度對于間座殼屬真菌的準(zhǔn)確鑒定至關(guān)重要.

Guarnaccia等[1]采用在WA培養(yǎng)基上放置無菌松針對分離自歐洲葡萄的間座殼屬Diaporthe真菌進行產(chǎn)孢誘導(dǎo),從而獲得了成熟的子囊殼,實現(xiàn)了準(zhǔn)確的物種鑒定和描述. 李會平等在WA培養(yǎng)基上放置大豆莖稈誘導(dǎo)了所培養(yǎng)的Diaporthephaseolorumvar.caulivora產(chǎn)生大量子囊殼[10].不論是野外直接獲得的間座殼屬Diaporthe真菌標(biāo)本,還是在實驗室分離的間座殼屬Diaporthe真菌培養(yǎng)物,都存在著如何保證獲得足夠多的和成熟的子囊殼用于間座殼屬Diaporthe的準(zhǔn)確鑒定這一問題.2017年7月——2018年7月,在分離野大豆Glycinesoja內(nèi)生真菌時,獲得了1株間座殼屬Diaporthe真菌. 然而,該菌株在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上僅產(chǎn)生為數(shù)不多的子囊殼,使得不能對其進行準(zhǔn)確的物種鑒定. 為此,本研究探索了對野大豆內(nèi)生間座殼真菌的子囊殼促生培養(yǎng),并結(jié)合形態(tài)特征和分子序列對分離和培養(yǎng)的野大豆內(nèi)生間座殼真菌進行鑒定.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株

野大豆GlycinesojaSieb. et Zucc.植株樣品于2017年8月7日從山東東營黃河三角洲國家級自然保護區(qū)外圍區(qū)(118o59′9″E,37o45′38″ N)采集,按照Sun等[11]的組織分離法進行內(nèi)生真菌的分離,分離培養(yǎng)基為改良的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA). 其中,從野大豆葉片中分離的菌株DYYP4342初步鑒定為間座殼屬Diaporthe真菌,菌種保存于南京師范大學(xué)微生物菌種保藏中心(MCCNNU).

1.1.2 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA):馬鈴薯200 g,葡萄糖20 g,瓊脂20 g,水1 000 mL.

水瓊脂培養(yǎng)基(WA):瓊脂 10 g,水1 000 mL.

改良的PDA:每1000 mL PDA培養(yǎng)基中添加50 mL野大豆汁液.

1.1.3 試劑

乳酸酚棉藍染色液;5% KOH;2% CTAB;3 mol/L NaAc;氯仿-異戊醇(24∶1);Taq DNA聚合酶;10×PCR buffer、DL2000 Marker;rDNA-ITS的PCR擴增引物由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成.

1.2 方法

1.2.1 子囊殼的促生培養(yǎng)

將長度為5 cm的松針和大豆莖稈分別置于藍口玻璃瓶中(250 mL),在121 ℃、15 min高壓條件下滅菌2次,分別獲得滅菌松針、滅菌大豆莖稈. 從PDA平板上生長旺盛的野大豆內(nèi)生間座殼菌株DYYP4342菌落邊緣,以無菌打孔器取直徑為10 mm的菌餅,轉(zhuǎn)接到直徑為9 cm培養(yǎng)皿中的PDA平板和WA平板上,在培養(yǎng)基上菌餅的兩側(cè)平行放置滅菌松針或滅菌大豆莖稈. 設(shè)置6組處理,分別是在WA平板和PDA平板上僅接種菌餅、在WA平板和PDA平板上接種菌餅的同時加放滅菌松針或滅菌的大豆莖稈,每組處理3次重復(fù). 在25 ℃,12 h光照培養(yǎng)與12 h暗培養(yǎng)交替處理條件下培養(yǎng). 培養(yǎng)20 d與30 d后在Nikon C-LEDS 復(fù)合顯微鏡下,用Canon DS126311數(shù)碼相機拍攝子囊殼的外觀特征并進行計數(shù)[12]. 因子囊殼聚生,故以子座作為統(tǒng)計單位進行子囊殼的計數(shù).

采用SPSS 21.0軟件進行單因素方差分析(ANOVA),采用Tukey檢驗進行顯著性差異檢驗[13].

1.2.2 形態(tài)特征觀察

將分離菌株接種于PDA平板上,于25 ℃ 暗培養(yǎng)7 d后,觀察菌落正反面的顏色和氣生菌絲的疏密程度等菌株DYYP4342的培養(yǎng)特征. 挑取成熟子囊殼,在JSZ6體式顯微鏡(南京江南永新光學(xué)有限公司)下徒手切片. 將切片材料置于載玻片上,滴加5% KOH,再滴加乳酸酚棉藍染色液,封蓋. 在顯微鏡下觀察并利用BX53F顯微數(shù)碼測量系統(tǒng)(Olympus,Japan)測量成熟子囊、子囊孢子的大小,對選定的結(jié)構(gòu)進行30次測量,并計算出平均值和標(biāo)準(zhǔn)差(SD). 范圍被表示為min.-max.×min.-max. (mean+SD). 顯微圖像采用帶有微分干涉對比度(DIC)的Imager A1顯微鏡(Carl Zeiss,Germany)在200×與630×放大倍數(shù)下拍攝.

1.2.3 菌株的ITS序列獲得和系統(tǒng)發(fā)育分析

按照Guo等[14]的方法,用無菌牙簽從平板上刮取培養(yǎng)7 d的菌株DYYP4342菌絲體,采用CTAB法提取菌絲DNA. 采用真菌通用引物ITS1-F(5′CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′)和ITS4(5′TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)擴增核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(rDNA-ITS1),其中ITS1-F為正向引物,ITS4為反向引物. PCR 反應(yīng)體系為25 μL,含有10×Taq DNA 聚合酶緩沖液 12.5 μL、正向引物和反向引物(10 μmol/L)各 1 μL、DNA樣品 1 μL 和滅菌去離子水9.5 μL. 反應(yīng)條件為 95 ℃預(yù)變性2 min;95 ℃變性 1 min,退火50 ℃ 1min,72 ℃延伸 1 min,共30個循環(huán);72 ℃ 延伸7 min. PCR擴增產(chǎn)物質(zhì)量采用1%瓊脂糖凝膠電泳法檢測,擴增產(chǎn)物交由上海生工生物工程公司測序.

在NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)數(shù)據(jù)庫中對所測菌株DYYP4342的ITS序列進行BLAST比對. 下載GenBank中豆科植物上發(fā)生的12種間座殼屬Diaporthe(主要為模式標(biāo)本分離株ex-type 或附加模式標(biāo)本分離株 ex-epitype)的30條ITS序列,使用MAFFT 7.0軟件(https://mafft.cbrc.jp/alignment/software/)對測序序列和下載序列進行在線多序列比對,然后使用MEGA 7.0軟件進行比對序列的手動截齊調(diào)整. 參照Dissanayake等從GenBank中下載DiaporthellacorylinaCBS 121124 菌株的ITS 序列(KC343004)作為外群,基于貝葉斯推斷法(Bayesian inference,BI)使用MrBayes 3.1.2軟件構(gòu)建貝葉斯系統(tǒng)發(fā)育樹,使用FigTree v1.4.3 與Adobe Illustrator CC2019軟件對構(gòu)建的進化樹進行編輯標(biāo)示.

表1 用于系統(tǒng)發(fā)育分析的GenBank中間座殼屬真菌的ITS 序列信息Table 1 GenBank accession numbers of Diaporthe species treated in the phylogenetic analysis

2 結(jié)果與討論

2.1 子囊殼在培養(yǎng)基和植物材料上的發(fā)生

2.1.1 子囊殼在培養(yǎng)基和植物材料上的培養(yǎng)特征

野大豆內(nèi)生間座殼菌株DYYP4342在大豆莖稈和松針上都能夠產(chǎn)生多于在單純的PDA平板和WA平板上的子囊殼(圖1). 在WA平板,子囊殼發(fā)生在菌餅邊緣(圖1a);當(dāng)存在有大豆莖稈或松針時,子囊殼既可出現(xiàn)在菌餅邊緣,也可出現(xiàn)在大豆莖稈或松針附近,但更多地是在整個大豆莖稈或松針上發(fā)生(圖1b,c). 在PDA平板上,子囊殼最初發(fā)生在菌餅邊緣,隨著培養(yǎng)時間的延長,子囊殼會散生于在PDA平板各處,一般埋生于PDA內(nèi),而以喙突出于培養(yǎng)基外(圖1d);當(dāng)存在有大豆莖稈時,子囊殼既出現(xiàn)在菌餅邊緣,也可散生于PDA上,或在大豆莖稈上發(fā)生(圖1e);當(dāng)存在有松針時,子囊殼在菌餅邊緣、PDA表面和松針上都有發(fā)生,但是以松針周圍的培養(yǎng)基上發(fā)生的最多(圖1f).

a-c分別為 WA、WA+滅菌的大豆莖稈和WA+滅菌的松針上的菌落圖,d-f分別為PDA、PDA+滅菌的大豆莖稈和PDA+滅菌的松針上的菌落圖.圖1 野大豆內(nèi)生間座殼菌株DYYP4342在不同培養(yǎng)基上的生長狀態(tài)(接種后培養(yǎng)30 d)Fig.1 The colony of endophytic Diaporthe fungal strain DYYP4342 isolated from Glycine soja on different medium(30 days after inoculation)

2.1.2 子囊殼在培養(yǎng)基和植物材料上的發(fā)生數(shù)量

在培養(yǎng)基上添加無菌大豆莖稈或者松針會明顯地促進野大豆內(nèi)生間座殼Diaporthe菌株DYYP4342子囊殼的產(chǎn)生,且這些子囊殼主要發(fā)生在大豆莖稈或者松針上(圖2). 野大豆內(nèi)生間座殼Diaporthe菌株DYYP4342的子囊殼埋生于培養(yǎng)基內(nèi)或者大豆莖稈、松針內(nèi),大多聚生,極少單生,孔口形成較長的喙突出于基質(zhì)外(圖2).

在體式顯微鏡下對不同培養(yǎng)基不同介質(zhì)誘導(dǎo)產(chǎn)生的子囊殼的形態(tài)進行觀察,不同介質(zhì)誘導(dǎo)產(chǎn)生的子囊殼的成熟度及形狀略為不同. 在WA和PDA培養(yǎng)基中,添加無菌大豆莖稈作為誘導(dǎo)介質(zhì)所產(chǎn)生的子囊殼相較于添加無菌松針作為誘導(dǎo)介質(zhì)所產(chǎn)生的子囊殼的成熟度要高,并且添加無菌大豆莖稈作為誘導(dǎo)介質(zhì)所產(chǎn)生的子囊殼為球狀而添加無菌松針作為誘導(dǎo)介質(zhì)所產(chǎn)生的子囊殼更為細長(圖2b,e);不添加誘導(dǎo)介質(zhì)的對照組WA與PDA平板上所產(chǎn)生的子囊殼的形狀差異不大(圖2a-d).

a-c分別為WA菌餅、WA上滅菌大豆莖稈和WA上滅菌松針上產(chǎn)生的子囊殼,d-f分別為PDA菌餅、PDA上滅菌大豆莖稈和PDA上滅菌松針上的產(chǎn)生的子囊殼,標(biāo)尺=2 000 μm.圖2 野大豆內(nèi)生間座殼菌株DYYP4342的子囊殼在不同培養(yǎng)基上的發(fā)生狀態(tài)(接種后培養(yǎng)30 d)Fig.2 The perithecium appearancey of endophytic Diaporthe fungal strain DYYP4342 isolated from Glycine sojae on different medium(30 days after inoculation)

A為不同培養(yǎng)基誘導(dǎo)子囊殼的產(chǎn)生(20 d),B為不同培養(yǎng)基誘導(dǎo)子囊殼的產(chǎn)生(30 d). 色柱上方*表示經(jīng)Tukey檢驗在P<0.05水平與對照組相比差異顯著,**表示經(jīng)Tukey檢驗在P<0.01水平與對照組相比差異極顯著.圖3 不同時間子囊殼的產(chǎn)生個數(shù)Fig.3 Number of p produced perithecia at different times

對分離菌株促進產(chǎn)生的子囊殼進行了分析. 結(jié)果表明,添加無菌植物材料會促進間座殼屬Diaporthe內(nèi)生真菌子囊殼產(chǎn)生. 培養(yǎng)20 d時在WA培養(yǎng)基中添加大豆莖稈時產(chǎn)生的子囊殼平均值為(88±8.71)個/皿與對照組WA培養(yǎng)基子囊殼數(shù)量(3±1)個/皿相比差異極顯著(P<0.01). WA培養(yǎng)基中添加無菌松針時產(chǎn)生的子囊殼平均值為(15.3±1.53)個/皿與對照組WA培養(yǎng)基子囊殼數(shù)量(3±1)個/皿相比沒有顯著性差異(圖3A). PDA培養(yǎng)基中添加大豆莖稈產(chǎn)生的子囊殼為(63±7.2)個/皿與對照組PDA培養(yǎng)基子囊殼數(shù)量(30.3±6.65)個/皿相比差異極顯著(P<0.01). PDA培養(yǎng)基中添加無菌松針產(chǎn)生的子囊殼為(53±11.53)個/皿時與對照組PDA培養(yǎng)基(30.3±6.65)個/皿相比子囊殼數(shù)量差異顯著(P<0.05)(圖3A). 培養(yǎng)30 d時在WA培養(yǎng)基中添加大豆莖稈產(chǎn)生的子囊殼為(100±7.81)個/皿與對照組WA培養(yǎng)基(3.3±0.58)個/皿相比子囊殼數(shù)量差異極顯著(P<0.01). WA培養(yǎng)基上添加無菌松針產(chǎn)生的子囊殼為(57.6±16.56)個/皿與對照組WA培養(yǎng)基(3.3±0.58)個/皿相比子囊殼數(shù)量差異極顯著(P<0.01)(圖3B). 在PDA培養(yǎng)基中添加大豆莖稈產(chǎn)生的子囊殼數(shù)量(88.6±13.05)個/皿與對照組PDA培養(yǎng)基(55.3±2.08)個/皿相比子囊殼數(shù)量差異顯著(P<0.05). 在PDA培養(yǎng)基中添加無菌松針產(chǎn)生的子囊殼數(shù)量為(75.6±13.05)個/皿與對照組PDA培養(yǎng)基子囊殼數(shù)量(55.3±2.08)個/皿相比子囊殼數(shù)量沒有顯著性差異(圖3B).

2.2 菌種鑒定

2.2.1 形態(tài)特征鑒定

從野大豆Glycinesoja葉片中分離獲得的內(nèi)生真菌菌株DYYP4342在PDA平板上25 ℃恒溫培養(yǎng)7 d,菌落直徑可達9.0 cm. 菌絲初期呈白色,邊緣規(guī)則,氣生菌絲發(fā)達致密,呈毯狀,后期逐漸轉(zhuǎn)為灰色或淡黃褐色. 有性型特征:子囊殼黑色,球狀或近球狀,聚生,埋生于基質(zhì)內(nèi),具有伸出于基質(zhì)外的乳突狀突起,突起(喙)長728.2 μm～2278.3 μm. (圖4B,C);子囊殼直徑為261.5 μm～303.2 μm(圖4D)無側(cè)絲. 子囊單囊壁,無柄、棍棒狀,內(nèi)含8個子囊孢子,頂端有明顯的頂環(huán)(圖4E,G-J). 子囊大小:(35.18～42.97)×(6.25～8.61)μm(av.±SD:(38.39±1.8)×(7.23±0.58),n=30). 子囊孢子透明,重疊單列,橢圓形或梭狀(圖4K～L),二室的,有4個水滴狀斑點,中間為較大的水滴狀斑點,兩端則為較小的水滴狀斑點,子囊孢子大小:(8.02～11.66)×(2.23～3.54)μm(av.±SD:(9.98±0.75)×(3.03±0.24),n=30)(圖4F,K～L). 在所有的培養(yǎng)條件下均未觀察到無性型分生孢子器、α型分生孢子和β型分生孢子.

根據(jù)形態(tài)特征鑒定為大豆間座殼DiaporthesojaeLehman.

宿主-喜樹Camptothecaacuminata,辣椒Capsicumannuum,柑橘屬Citrussp.,甜瓜Cucumismelo,大豆Glycinemax,向日葵Helianthusannuus,琉璃菊Stokesialaevis,葡萄Vitisvinifera[14-20].在野大豆Glycinesoja上還沒有Diaporthesojae的報道.

A在WA+無菌大豆莖稈上的菌落圖;B PDA+無菌大豆莖稈誘導(dǎo)產(chǎn)生的子囊殼;C 乳突狀突起(喙);D 子囊殼橫切圖;E子囊;F子囊孢子;G-J子囊;K-L子囊孢子Bars. B=2000 μm;C-D=50 μm;E-L=10μm.圖4 大豆間座殼Fig.4 Diaporthe sojae

在野大豆Glycinesoja上還沒有Diaporthesojae的報道,已經(jīng)在栽培大豆Glycinemax上報道的間座殼屬Diaporthe真菌則有:Diaporthecaulivora、Diaporthenovem、Diaporthelongicolla、Diaporthephaseolorum、Diaportheaspalathi、Diaportheeres、Diaporthemasirevicii、Diaporthemiriciae、Diaporthesojae、Diaporthemelonis、Diaportheueckerae.盡管野大豆Glycinesoja與栽培大豆Glycinemax是近緣種,是其直接祖先[21],但是,對于大豆間座殼Diaporthesojae而言,野大豆Glycinesoja屬于其新被發(fā)現(xiàn)的宿主.在野大豆Glycinesoja分離大豆間座殼Diaporthesojae時,選擇的是無病害的健康植株組織,因此,該菌是符合內(nèi)生真菌的定義的[22],而對于其在野大豆中的作用,則需要進一步的研究.

2.2.2 系統(tǒng)發(fā)育分析

基于rDNA-ITS構(gòu)建的貝葉斯系統(tǒng)發(fā)育樹(圖5)表明,分離自野大豆Glycinesoja的間座殼屬Diaporthe內(nèi)生真菌菌株DYYP4342與DiaporthesojaeFAU635、DiaporthesojaeCBS116019和DiaporthesojaeDP0601聚為分支VII,構(gòu)成一個獨立的支系,且獲得良好支持(BPP=0.96,BPP=Bayesian posterior probabilities),因此支持了根據(jù)形態(tài)特征獲得的鑒定結(jié)果,從野大豆中分離的間座殼屬內(nèi)生真菌菌株是大豆間座殼Diaporthesojae.這一分支中還有發(fā)生在向日葵上的DiaporthekochmaniiBRIP54033,本研究結(jié)果支持了Udayanga等[15]的基于形態(tài)分類學(xué)和分子系統(tǒng)學(xué)的意見,即Diaporthekochmanii不是一個獨立的物種,應(yīng)歸于Diaporthesojae.

貝葉斯分析基于最適模型GTR+I+G. 在系統(tǒng)發(fā)育樹中,共有12個分支,其中11個分支對應(yīng)于大豆Glycinemax中已報道的11種間座殼屬Diaporthe物種,且每一分支都具有較高的貝葉斯后驗概率(圖5),支持了這些形態(tài)學(xué)物種的獨立性. 分支Ⅰ為(Hobbs)Santos等[18]最初發(fā)現(xiàn)的、已知在阿根廷、美國、中國分布的Diaporthelongicolla;分支Ⅱ為Beraha & O’Brien最初發(fā)現(xiàn)的、已知在巴西、德國、美國分布的Diaporthemelonis;分支Ⅲ為Shivas,Thompson & Tan最初發(fā)現(xiàn)的、已知在澳大利亞分布的Diaporthemiriciae;分支Ⅳ為Udayanga & Castlebury最初發(fā)現(xiàn)的、已知在中國、美國分布的Diaportheueckerae;分支Ⅴ為Shivas,Morin,Thompson & Tan最初發(fā)現(xiàn)的、已知在澳大利亞分布的Diaporthemasirevicii;Santos,分支Ⅷ為Vrandecic & Phillips最初發(fā)現(xiàn)的、已知在克羅地亞、意大利、南非、美國分布的Diaporthenovem;分支Ⅸ為(Athow & Caldwell)Santos,Vrandecic & Phillips最初發(fā)現(xiàn)的、已知在阿根廷、巴西、加拿大、日本、韓國等分布的Diaporthecaulivora;分支Ⅹ為Jansen,Castlebury & Crous最初發(fā)現(xiàn)的、已知在阿根廷、南非、美國分布的Diaportheaspalathi;分支Ⅺ為Nitschke最初發(fā)現(xiàn)的、已知在中國、意大利等分布的Diaportheeres;分支Ⅻ為(Cooke & Ellis)Saccardo最初發(fā)現(xiàn)的、已知在巴西、中國、美國等分布的Diaporthephaseolorum;除11種在大豆Glycinemax上發(fā)生的間座殼屬真菌外,分支Ⅵ為南非豆科植物南非紅茶Aspalathuslinearis上的Diaportheambigua,并且與大豆Glycinemax上的間座殼屬真菌具有較密切的親緣關(guān)系.

分支上的值顯示的是貝葉斯法推理的后驗概率(BPP≥0.85)圖5 基于BI的rDNA-ITS序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 Phylogram generated from Bayesian analysis based on rDNA-ITS regions

3 結(jié)論

本研究選擇的植物材料大豆Glycinemax為大豆間座殼Diaporthesojae在自然條件下的宿主之一,另一植物材料松針目前尚未報道為Diaporthesojae的宿主.本研究中針對不同植物材料這一影響因素對大豆間座殼Diaporthesojae子囊殼的促進產(chǎn)生進行了比較研究,提供了有一定說服力的結(jié)果,不同植物材料對大豆間座殼Diaporthesojae有性型子囊殼的產(chǎn)生結(jié)果不同,無菌大豆莖稈在WA和PDA培養(yǎng)基中比無菌松針在WA和PDA平板上促進產(chǎn)生的子囊殼的數(shù)量多. 子囊殼促進實驗的方法對于間座殼屬Diaporthe的其他物種的有性型的人工培養(yǎng)觀察具有一定的參考意義,在進行間座殼屬Diaporthe物種的有性型的培養(yǎng)中可添加該物種分離的常見宿主植物材料以促進其產(chǎn)生成熟子囊殼. 本實驗中對子囊殼進行計數(shù)時以子座為單位進行計數(shù)這可能會低估了每皿中子囊殼的數(shù)量.

通過對成熟子囊殼切片進行形態(tài)學(xué)鑒定和基于rDNA-ITS進行的系統(tǒng)發(fā)育分析,確定了該株分離自野大豆內(nèi)生真菌的間座殼屬Diaporthe的明確物種. Udayanga等對大豆、瓜類植物中的Diaporthesojaecomplex進行了基于ITS/EF/TUB/CAL/HIS的系統(tǒng)發(fā)育及致病性分析,認(rèn)為Diaporthelongicolla、Diaporthephaseolorum、Diaporthesojae、Diaporthemelonis、Diaportheueckerae等屬于Diaporthesojaecomplex. 然而,在本研究中仍然將它們作為不同的物種進行完整的形態(tài)與系統(tǒng)發(fā)育比較. 在本研究中主要用于比較的為從Dissanayake等對間座殼屬174個物種的系統(tǒng)發(fā)育分析中選擇出的在大豆宿主中發(fā)現(xiàn)的11個間座殼屬物種. 其中在本研究的系統(tǒng)發(fā)育樹分支Ⅰ中Gomes等將菌株CBS 180.55Diaporthephaseolorumvar.sojae、CBS 659.78Diaporthephaseolorumvar.sojae歸為D.sojae. Huang等將CBS 100.87Phomopsislongicolla、CBS 180.55Diaporthesojae歸為Diaporthelongicolla. 本研究中在分別使用D.sojae的附加模式標(biāo)本的分離株(ex-epitype)的序列FAU635與D.longicolla模式標(biāo)本的分離株(ex-type)的序列ATCC60325進行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建,CBS 180.55D.sojae、CBS 659.78D.sojae、CBS 100.87Phomopsislongicolla與D.longicolla聚類為一支建議可以歸入D.longicolla. 分支Ⅲ中分離自甜瓜Cucumismelo的菌株FAU656*為Udayanga等建立Diaportheueckerae時的模式標(biāo)本的分離株(ex-type),在本研究中發(fā)現(xiàn)其與Diaporthemiriciae聚為一支.分離自野大豆的菌株的顯微形態(tài)與Diaporthephaseolorum很接近,但仔細比對分離自野大豆的菌株DYYP4342子囊孢子的大小為8.02-11.66×2.23-3.54 μm與Udayanga等描述的Diaporthephaseolorum(9.7)12×3.5(-4.3)有略微差異,子囊孢子的寬度要略窄. 子囊孢子大小更接近于Diaporthesojae(9)9.5-11.9(-12)×3-4 μm,并且在系統(tǒng)發(fā)育樹分支Ⅶ中與物種Diaporthesojae附加模式標(biāo)本的分離株(ex-epitype)聚類為一支. 故而結(jié)合形態(tài)與系統(tǒng)發(fā)育分析,分離自野大豆的間座殼屬菌株應(yīng)為Diaporthesojae.

本研究從野大豆植株中分離鑒定出的Diaporthesojae為該物種在野大豆宿主中的首次記錄.Diaporthesojae建種于1923年,Lehman分離自美國北卡羅來納州大豆Sojamax(L.)Piper,根據(jù)原始文獻,Diaporthesojae的名稱來源于其宿主Sojamax(L.)Piper,并且子囊殼僅在培養(yǎng)中可出現(xiàn)[23],Diaporthesojae可以感染大豆的莖,豆莢和葉子,引起大豆莢和莖枯病.