瓶鼻海豚(Tursiops truncatus)及其近緣物種 牛(Bos taurus)TLR8基因免疫應(yīng)答功能的探究

谷 龍,章緯菁,于芳芳,任文華

(南京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,江蘇 南京 210023)

鯨類的陸地祖先在大約5 600萬(wàn)年前從陸地進(jìn)入海洋[1],面對(duì)和陸地不同的生態(tài)環(huán)境,鯨類從形態(tài)、生理到分子水平發(fā)生了一系列進(jìn)化適應(yīng),例如為了應(yīng)對(duì)海洋中多樣且隨著洋流迅速傳播的病原體[2],鯨類的免疫功能發(fā)生了相應(yīng)的變化. 鯨類既有和陸生哺乳動(dòng)物同源的免疫器官,又有其獨(dú)特的解剖結(jié)構(gòu)如淋巴上皮喉部腺體等[3]. 在分子水平上,有研究發(fā)現(xiàn)主要組織相容性復(fù)合物(MHC)基因變異與鯨類對(duì)病原體侵襲的免疫能力有關(guān)[4];對(duì)印度太平洋駝背海豚(Sousachinensis)的白細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的分析也發(fā)現(xiàn)了大量可能在免疫耐受中起作用的相關(guān)基因[5]. 此外,一些關(guān)于Toll樣受體(Toll-like receptor,TLRs)分子進(jìn)化的研究證明,TLRs在鯨類中發(fā)生了正選擇[6-9].

哺乳動(dòng)物的免疫類型分為先天免疫和獲得免疫兩種系統(tǒng),TLRs作為先天免疫系統(tǒng)的核心成分,處于抵御病原體的第一線. TLRs位于細(xì)胞膜表面或細(xì)胞內(nèi)膜系統(tǒng)上,作為中間介導(dǎo)分子,識(shí)別病原體相關(guān)的分子模式(Pathogen-associated molecular patterns,PAMPs),并啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的級(jí)聯(lián)反應(yīng),最終形成適應(yīng)性免疫[10]. 哺乳動(dòng)物有10～15種TLRs,每種都適應(yīng)特定病原體的不同配體[11-12].TLR1、TLR2、TLR4、TLR5、TLR6、TLR10和TLR11位于細(xì)胞膜上,參與識(shí)別桿菌、鞭毛蛋白、真菌和衣原體等病原微生物,被稱為非病毒性TLRs.TLR3、TLR7、TLR8和TLR9位于細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞器膜上,比如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上,參與識(shí)別病原微生物的核酸物質(zhì),如單鏈或雙鏈病毒RNA,屬于病毒型TLRs[13]. 其中,TLR8的天然配體主要是單鏈病毒RNA(ssRNA)[12,14],也能被某些人工合成的激動(dòng)劑如瑞奎莫特(Resiquimod,R848)、咪唑莫特(Imiquimod)等激活. 配體被TLR8識(shí)別后,通過(guò)髓樣分化因子88(MyD88)信號(hào)通路激活下游轉(zhuǎn)錄因子(如 NF-κB 和c-Jun)[15-16],產(chǎn)生一系列的細(xì)胞免疫因子如IL-8、IL-12等[17],從而對(duì)病毒產(chǎn)生天然免疫.

TLRs作為Ⅰ型跨膜蛋白,均具有相似的結(jié)構(gòu),通常由胞外域、跨膜域和胞內(nèi)域組成. 其中,胞外域主要包含數(shù)個(gè)富含亮氨酸重復(fù)序列(Leucine rich repeats,LRRs)結(jié)構(gòu)域;胞內(nèi)域?yàn)門oll-IL-1結(jié)構(gòu)域(TIR結(jié)構(gòu)域),參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo);胞外域和胞內(nèi)域之間通過(guò)單個(gè)跨膜螺旋結(jié)構(gòu)域相連[18]. 徐等對(duì)鯨類包括TLR8在內(nèi)的10種TLRs進(jìn)行生物信息學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)其胞外域具有大量正選擇位點(diǎn),并且絕大多數(shù)正選擇位點(diǎn)發(fā)生了激進(jìn)的氨基酸替代[19].

鯨類和陸生哺乳動(dòng)物TLR8基因結(jié)構(gòu)和功能的差異目前尚未見報(bào)道,本研究通過(guò)克隆測(cè)序鑒定了瓶鼻海豚和牛兩個(gè)物種的TLR8基因序列,并對(duì)其氨基酸序列和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了生物信息學(xué)分析;此外通過(guò)克隆瓶鼻海豚和牛TLR8基因,轉(zhuǎn)染人源胚腎細(xì)胞系HEK293細(xì)胞(該細(xì)胞自身不表達(dá)TLR8,通過(guò)人工激活劑R848刺激可以產(chǎn)生TLR8),檢測(cè)其下游基因的表達(dá)差異,探討鯨類適應(yīng)海洋環(huán)境發(fā)生的免疫適應(yīng)分子機(jī)制.

1 材料與方法

1.1 樣品和主要試劑

瓶鼻海豚肌肉樣本取自本課題組積累的中國(guó)沿海擱淺或意外捕獲/殺死的死亡個(gè)體,牛肝臟樣本采購(gòu)自南京市棲霞區(qū)附近屠宰場(chǎng). 動(dòng)物材料處理的所有程序均經(jīng)南京師范大學(xué)機(jī)構(gòu)評(píng)審委員會(huì)批準(zhǔn). 用DNA/RNA樣品保護(hù)劑(Takara)處理樣品,液氮保存. 本實(shí)驗(yàn)使用HEK293細(xì)胞系購(gòu)自美國(guó)ATCC公司.

RNA保護(hù)試劑RNAiso、Plus、PrimeScriptTMRT 試劑盒、DNA Marker、限制性內(nèi)切酶、T4連接酶購(gòu)自Takara公司;R848(Resiquimod)購(gòu)自InvivoGen公司;Luciferase報(bào)告系統(tǒng)試劑盒、NF-κB-Luc質(zhì)粒、pRL-TK質(zhì)粒購(gòu)自Promega公司;Lipofectamine 2000 購(gòu)于Invitrogen公司;切膠純化試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自Axygen公司;胎牛血清、Opti-MEM培養(yǎng)基購(gòu)自Gbico公司;SYBR Green Master(ROX)購(gòu)自Roche公司;pcDNA3.1+質(zhì)粒購(gòu)自Thermo公司;NF-κB(P65)、β-actin、IL-8兔抗鼠一抗和羊抗兔二抗購(gòu)自美國(guó)ImmunoWay 公司.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 瓶鼻海豚基因組DNA提取

瓶鼻海豚TLR8CDS處于一個(gè)外顯子內(nèi),使用酚氯仿抽提法提取了瓶鼻海豚基因組DNA用于目的基因的擴(kuò)增.

1.2.2 牛肝臟組織總RNA提取和RT-PCR獲得cDNA

按照RNA提取試劑盒TRIzolReagent(Invitrogen公司)說(shuō)明書進(jìn)行牛新鮮肝臟樣品總RNA提取,加入50 μL Rnase-free water溶解沉淀,產(chǎn)物濃度檢測(cè)后-80 ℃保存.

根據(jù)PrimeScriptTMRT試劑盒(Takara公司)說(shuō)明書逆轉(zhuǎn)錄RNA成cDNA,4 ℃保存.

1.2.3 瓶鼻海豚和牛TLR8基因克隆

GenBank中瓶鼻海豚和牛TLR8基因的收錄號(hào)分別為XM_004317714、EF583902.1,據(jù)此序列使用引物設(shè)計(jì)軟件Primer Premier 5和DNASTAR設(shè)計(jì)其開放閱讀框的引物,在上下游引物的5′端分別添加限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基. 引物序列見表1 Primers for PCR部分.

分別以瓶鼻海豚基因組DNA和牛cDNA為模板擴(kuò)增TLR8基因,簡(jiǎn)稱為dTLR8和cTLR8. PCR產(chǎn)物測(cè)序.

1.2.4 TLR8蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析

使用MEGA軟件對(duì)瓶鼻海豚和牛的TLR8蛋白進(jìn)行序列比對(duì);使用SignalP-5.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)預(yù)測(cè)信號(hào)肽;使用TMHMM Sever,v.2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)預(yù)測(cè)跨膜區(qū);使用SMART網(wǎng)站(http://smart.embl-heidelberg.de/)預(yù)測(cè)TLR8功能域;使用 EZMOL(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/ezmol/)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu);使用Pymol軟件對(duì)瓶鼻海豚和牛兩種蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行比對(duì).

1.2.5TLR8重組質(zhì)粒的構(gòu)建和HEK293細(xì)胞轉(zhuǎn)染

dTLR8和cTLR8基因全長(zhǎng)片段分別與pcDNA3.1+質(zhì)粒連接,轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5α,使用Axygen試劑盒進(jìn)行質(zhì)粒抽提.

培養(yǎng)細(xì)胞密度至合適時(shí)使用試劑Lipofectamine 2000進(jìn)行轉(zhuǎn)染,將Opti-MEM與Lipofectamine 2000或質(zhì)粒等比例混合.

1.2.6 雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)NF-κB表達(dá)

將dTLR8-pcDNA3.1+質(zhì)?；騝TLR8-pcDNA3.1+質(zhì)粒與NF-κB啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的螢火蟲熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒(NF-κB-Luc)及海腎熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒(pRL-TK)共轉(zhuǎn)染至HEK293細(xì)胞,24 h后加入R848進(jìn)行刺激(每孔1 μg/mL),培養(yǎng)一段時(shí)間后通過(guò)Dual-luciferase報(bào)告系統(tǒng)試劑盒(Promega公司)進(jìn)行熒光強(qiáng)度的測(cè)定,從而獲得NF-κB表達(dá)情況.

1.2.7 qRT-PCR檢測(cè)IL-8表達(dá)情況

將dTLR8-pcDNA3.1+質(zhì)粒與cTLR8-pcDNA3.1+質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染至HEK293細(xì)胞,24 h后加入R848進(jìn)行刺激(每孔1 μg/mL),處理8 h后提取RNA并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)TLR8及其下游免疫因子IL-8的mRNA表達(dá)水平. 引物序列見表1 Primers for qRT-PCR部分.

表1 引物序列Table 1 Primers sequences

實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù),且每次重復(fù)使用3個(gè)復(fù)孔.

1.2.8 Western blot檢測(cè)NF-κB和IL-8

離心收集被R848刺激的轉(zhuǎn)染TLR8-pcDNA3.1+的HEK293細(xì)胞,充分裂解,檢測(cè)細(xì)胞上清總蛋白濃度,并調(diào)整為一致的終濃度. 12%分離膠SDS-PAGE電泳. 轉(zhuǎn)移蛋白至PVDF膜上分別進(jìn)行一抗二抗反應(yīng). 使用凝膠成像儀進(jìn)行曝光顯色.

1.2.9 數(shù)據(jù)處理

重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次,t檢驗(yàn)檢測(cè)統(tǒng)計(jì)數(shù)值差異,顯著差異用*表示(P<0.05),極顯著差異用**來(lái)表示(P<0.01).

2 結(jié)果與討論

2.1 瓶鼻海豚和牛TLR8基因克隆

根據(jù)GenBank中瓶鼻海豚和牛TLR8基因的收錄號(hào)分別設(shè)計(jì)引物,以瓶鼻海豚基因組DNA和牛RNA逆轉(zhuǎn)錄成的cDNA為模板擴(kuò)增TLR8基因,PCR產(chǎn)物檢測(cè)如圖1A、B第2泳道所示,產(chǎn)物序列長(zhǎng)度約3 000 bp,經(jīng)測(cè)序分別證實(shí)獲得克隆目的片段分別為3 198 bp和3 102 bp,各含有完整的開放閱讀框3 105 bp和 3 072 bp,測(cè)序結(jié)果通過(guò)NCBI網(wǎng)站BLAST比對(duì)證實(shí)分別為瓶鼻海豚和牛的TLR8基因.

A:牛TLR8 PCR產(chǎn)物和檢驗(yàn);B:瓶鼻海豚TLR8 PCR產(chǎn)物和檢驗(yàn) 1:DNA Marker;2:TLR8 PCR產(chǎn)物;3:cTLR8-pcDNA3.1+/dTLR8-pcDNA3.1+構(gòu)建后載體雙酶切結(jié)果;4:空載pcDNA3.1+質(zhì)粒雙酶切結(jié)果.圖1 TLR8 PCR產(chǎn)物和表達(dá)載體雙酶切檢驗(yàn)Fig.1 The test of PCR products and expression vectors of TLR8

2.2 瓶鼻海豚和牛TLR8蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

2.2.1 瓶鼻海豚和牛TLR8蛋白質(zhì)序列比對(duì)

使用MEGA軟件對(duì)瓶鼻海豚和牛TLR8的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì),兩個(gè)物種分別含有1 035和1 024個(gè)氨基酸殘基(圖2),且牛和瓶鼻海豚相比,氨基酸位點(diǎn)存在多處不同:牛TLR8蛋白質(zhì)在第97～98位點(diǎn)檢測(cè)到2個(gè)氨基酸的缺失,在第322～330位點(diǎn)檢測(cè)到9個(gè)氨基酸的缺失. 同時(shí),一級(jí)結(jié)構(gòu)檢測(cè)到3個(gè)與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)功能相關(guān)的高度保守的基序:Box1、Box2和Box3.

“*”表示瓶鼻海豚和牛TLR8相同的氨基酸位點(diǎn);“.”表示不同的氨基酸位點(diǎn);雙下劃線為信號(hào)肽;單下劃線為跨膜區(qū);方框依次為Box1、Box2和Box3.圖2 瓶鼻海豚和牛TLR8蛋白序列比對(duì)結(jié)果Fig.2 Sequence comparison of Tursiops truncatus and Bos taurus TLR8

A:瓶鼻海豚TLR8蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域;B:牛TLR8蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域圖3 瓶鼻海豚和牛TLR8蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)Fig.3 Prediction of domain of Tursiops truncatus and Bos taurus TLR8 protein

2.2.2 瓶鼻海豚和牛TLR8蛋白質(zhì)的信號(hào)肽、跨膜區(qū)和結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)

信號(hào)肽(SP)是引導(dǎo)新合成蛋白質(zhì)到膜中或跨膜轉(zhuǎn)移的短肽鏈. 本研究使用信號(hào)肽預(yù)測(cè)工具SingaIP-5.0 sever在線對(duì)瓶鼻海豚和牛TLR8蛋白質(zhì)的信號(hào)肽進(jìn)行預(yù)測(cè),結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩個(gè)物種的信號(hào)肽均為第1～17個(gè)氨基酸(圖2).

使用蛋白質(zhì)跨膜預(yù)測(cè)網(wǎng)站TMHMM Sever v.2.0對(duì)瓶鼻海豚和牛TLR8蛋白質(zhì)的分析發(fā)現(xiàn),瓶鼻海豚的跨膜區(qū)為第820～843個(gè)氨基酸,牛的跨膜區(qū)為第809～831個(gè)氨基酸. 瓶鼻海豚膜外區(qū)共820個(gè)氨基酸殘基,牛與之相比有159個(gè)差異,占19.4%. 瓶鼻海豚膜內(nèi)區(qū)共192個(gè)氨基酸殘基,牛與之相比有7個(gè)差異,占3.6%(圖2).

使用SMART在線服務(wù)預(yù)測(cè)瓶鼻海豚和牛TLR8蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域,結(jié)果顯示瓶鼻海豚膜外區(qū)包括18個(gè)LRR(leucine-rich repeats)序列(圖3A),其中瓶鼻海豚在120～143,632～655位點(diǎn)有2個(gè)LRR_TYR結(jié)構(gòu)域(LRR_typical subfamily),在766～817有1個(gè)LRRCT(LRR C-terminal domain);牛有17個(gè)LRR序列(圖3B),其中有2個(gè)分別位于118～141,193～216位點(diǎn)的LRR_TYR結(jié)構(gòu)域,1個(gè)位于755～806位點(diǎn)的LRRCT結(jié)構(gòu)域. 本研究發(fā)現(xiàn),牛不僅比瓶鼻海豚缺少1個(gè)LRR序列(即瓶鼻海豚LRR3序列),并且兩者后續(xù)LRR的位置和數(shù)量也有一定區(qū)別. 膜內(nèi)區(qū)負(fù)責(zé)引導(dǎo)下游信號(hào)通路,較膜外域保守,且兩個(gè)蛋白均預(yù)測(cè)到與白介素-1型受體同源的TIR(Toll/IL-1 receptor domain,TIR)結(jié)構(gòu)域.

2.2.3 瓶鼻海豚和牛TLR8蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

利用在線分析軟件SOPMA預(yù)測(cè)分析瓶鼻海豚和牛TLR8蛋白質(zhì)所形成的二級(jí)結(jié)構(gòu),所得結(jié)果如圖所示(圖4). 瓶鼻海豚TLR8蛋白中分別有486個(gè)α螺旋(46.96%),142個(gè)β折疊(13.72%),47個(gè)β轉(zhuǎn)角(4.54%)和360個(gè)無(wú)規(guī)則卷曲(34.78%);牛TLR8蛋白中分別有440個(gè)α螺旋(42.97%),150個(gè)β折疊(14.65%),54個(gè)β轉(zhuǎn)角(5.27%)和380個(gè)無(wú)規(guī)則卷曲(37.11%). 在瓶鼻海豚和牛TLR8蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中,α螺旋數(shù)量差異達(dá)到了46個(gè)(占10.4%),β折疊、β轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)則卷曲數(shù)量沒(méi)有顯著差別,但是它們的α螺旋、β折疊、β轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)則卷曲位置存在差別.

圖中彩色字母表示二級(jí)結(jié)構(gòu),藍(lán)色 h 代表α螺旋,紅色 e 代表β折疊,綠色 t 代表β轉(zhuǎn)角,黃色 c 代表無(wú)規(guī)則卷曲. A:瓶鼻海豚TLR8蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu);B:牛TLR8蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)圖4 瓶鼻海豚和牛TLR8蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.4 Prediction of the secondary structure of Tursiops truncatus and Bos taurus TLR8 protein

2.2.4 瓶鼻海豚和牛TLR8蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)分析

瓶鼻海豚和牛TLR8的3D結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)顯示(圖5),瓶鼻海豚的α螺旋和β折疊的數(shù)量為18個(gè)和22個(gè),牛的為18個(gè)和21個(gè). 同時(shí),兩個(gè)物種的膜外域均為馬蹄形結(jié)構(gòu),α螺旋凸向環(huán)形外側(cè),β折疊在內(nèi)側(cè),瓶鼻海豚TLR8蛋白有8個(gè)大小不等的α螺旋和18個(gè)β折疊,牛有9個(gè)α螺旋和17個(gè)β折疊,兩者存在1個(gè)α螺旋和β折疊的差異;膜內(nèi)域均為類球形結(jié)構(gòu),α螺旋包裹在球形外側(cè),β折疊在內(nèi)側(cè),瓶鼻海豚由10個(gè)α螺旋和4個(gè)β折疊通過(guò)loop連接而成,牛有9個(gè)α螺旋和4個(gè)β折疊,兩者存在1個(gè)α螺旋的差異.

A:瓶鼻海豚TLR8的三維結(jié)構(gòu);B:瓶鼻海豚TLR8膜內(nèi)區(qū)放大圖;C:牛TLR8的三維結(jié)構(gòu);D:牛TLR8膜內(nèi)區(qū)放大圖 圖中紅色圈代表TLR8膜內(nèi)區(qū),綠色框代表Box1,紅色框代表Box2,藍(lán)色框代表Box3.圖5 瓶鼻海豚和牛TLR8蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.5 Three-dimensional structure prediction of Tursiops truncatus and Bos taurus TLR8 protein

2.3 瓶鼻海豚和牛TLR8重組質(zhì)粒載體構(gòu)建

雙酶切擴(kuò)增得到的瓶鼻海豚和牛TLR8基因,將其連接至雙酶切后的pcDNA3.1+質(zhì)粒,從而構(gòu)建表達(dá)載體. 構(gòu)建后的cTLR8-pcDNA3.1+/dTLR8-pcDNA3.1+載體雙酶切驗(yàn)證結(jié)果見圖1,A、B 3泳道均出現(xiàn)了兩條帶,一條帶在3 000 bp附近,和TLR8PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度相當(dāng),另一條帶在5 000 bp附近,長(zhǎng)度與4泳道的空載質(zhì)粒一致,表明質(zhì)粒構(gòu)建成功.

A:1:DNA Marker;2:不使用R848刺激的空載pcDNA3.1+;3:使用R848刺激的空載pcDNA3.1+;4:不使用R848刺激的cTLR8-pcDNA3.1+;5:使用R848刺激的cTLR8-pcDNA3.1+;6:不使用R848刺激的dTLR8-pcDNA3.1+;7:使用R848刺激的dTLR8-pcDNA3.1+;B:Control:空載pcDNA3.1+;cTLR8:轉(zhuǎn)染了cTLR8-pcDNA3.1+表達(dá)載體的細(xì)胞;dTLR8:轉(zhuǎn)染了dTLR8-pcDNA3.1+表達(dá)載體的細(xì)胞.圖6 TLR8的初始表達(dá)和轉(zhuǎn)染效率Fig.6 The expression and transfection efficiency of TLR8

2.4 TLR8的初始表達(dá)和轉(zhuǎn)染效率的探究

本研究使用半定量PCR對(duì)細(xì)胞中TLR8表達(dá)情況進(jìn)行了檢測(cè),結(jié)果如圖6A所示,2、3泳道無(wú)條帶說(shuō)明野生型細(xì)胞不表達(dá)TLR8;4、5和6、7兩條泳道的條帶明暗程度無(wú)差異. 因此可以認(rèn)為,R848刺激與否基本不影響TLR8的表達(dá).

同時(shí)本研究使用qRT-PCR檢測(cè)了轉(zhuǎn)染pcDNA3.1+、cTLR8-pcDNA3.1+和dTLR8-pcDNA3.1+的細(xì)胞中TLR8mRNA的表達(dá)量. 結(jié)果如圖6B所示,除空載質(zhì)粒外,兩種轉(zhuǎn)染細(xì)胞TLR8的表達(dá)量大致相當(dāng). 因此可以認(rèn)為,當(dāng)其他條件相同時(shí),cTLR8-pcDNA3.1+和dTLR8-pcDNA3.1+可以被視為具有相似的轉(zhuǎn)染效率.

2.5 R848刺激HEK293細(xì)胞對(duì)TLR8下游基因NF-κB和IL-8表達(dá)水平的影響

為了探究R848刺激對(duì)TLR8激活下游通路的影響,本研究通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了下游基因NF-κB的表達(dá)水平,結(jié)果如圖7A所示:在未使用R848刺激時(shí),轉(zhuǎn)染cTLR8-pcDNA3.1+質(zhì)粒、dTLR8-pcDNA3.1+質(zhì)粒組和對(duì)照組相比,熒光值小幅度提升;在使用R848刺激后,對(duì)照組熒光值略有下降,而轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒組熒光值分別較空載質(zhì)粒組提升至4倍和2.8倍左右,且較非刺激組也提升約至2.5倍和2倍左右.

此外,本研究通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)了下游基因IL-8的表達(dá)水平,結(jié)果如圖7B所示:在未使用R848刺激時(shí),三種轉(zhuǎn)染組IL-8的表達(dá)量大致相當(dāng);在使用R848刺激后,對(duì)照組IL-8的表達(dá)量略有下降,轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒組較未刺激IL-8的表達(dá)量顯著提升:轉(zhuǎn)染cTLR8-pcDNA3.1+質(zhì)粒組刺激后表達(dá)量較未刺激提升至約4倍左右,轉(zhuǎn)染dTLR8-pcDNA3.1+質(zhì)粒組刺激后表達(dá)量較未刺激提升至約1.6倍左右,且數(shù)據(jù)差異極顯著(**,P<0.01). 由此可見,兩組轉(zhuǎn)染組細(xì)胞均能有效提升R848刺激后IL-8的表達(dá)量,且轉(zhuǎn)染了牛TLR8細(xì)胞的表達(dá)量提升更為顯著.

Control:空載pcDNA3.1+;cTLR8:cTLR8-pcDNA3.1+載體的轉(zhuǎn)染細(xì)胞;dTLR8:dTLR8-pcDNA3.1+載體的轉(zhuǎn)染細(xì)胞;白色為未加R848組,黑色為加R848組.圖7 R848刺激對(duì)TLR8下游基因NF-κB和IL-8表達(dá)水平的影響Fig.7 The effect of R848 stimulation on the expression of NF-κB and IL-8 downstream of TLR8

Ctrl:未加R848組;R848:加R848組;cTLR8-pcDNA3.1+:轉(zhuǎn)染了cTLR8-pcDNA3.1+表達(dá)載體的細(xì)胞;dTLR8-pcDNA3.1+:轉(zhuǎn)染了dTLR8-pcDNA3.1+表達(dá)載體的細(xì)胞.圖8 轉(zhuǎn)染牛/瓶鼻海豚TLR8的HEK293細(xì)胞刺激后下游蛋白的相對(duì)表達(dá)量Fig.8 The relative expression of downstream proteins of the HEK293 transfected with Bos taurus/Tursiops truncatus TLR8 after stimulation

2.6 Western blot檢測(cè)R848刺激對(duì)TLR8下游通路NF-κB和IL-8蛋白的影響

本研究使用R848對(duì)轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行刺激,提取細(xì)胞內(nèi)蛋白后使用Western blot檢測(cè)對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組中TLR8、NF-κB和IL-8的含量變化. 結(jié)果如圖8所示,在受到R848刺激后,轉(zhuǎn)染了?；蚱勘呛ｋ郥LR8基因的一組較對(duì)照組相比,其下游基因NF-κB和IL-8的表達(dá)量有了較為明顯的上升.同時(shí),與瓶鼻海豚TLR8轉(zhuǎn)染組相比,牛TLR8轉(zhuǎn)染組刺激后表達(dá)量的增加更為顯著. 由此可見,R848對(duì)于HEK293細(xì)胞的刺激能在一定程度上增加TLR8及其下游基因NF-κB和IL-8的表達(dá)量.

3 結(jié)論

一般研究認(rèn)為,TLRs基因家族高度保守,基因中任一氨基酸位點(diǎn)的替代、缺失都可能影響其功能,從而失去對(duì)某些病原微生物的免疫應(yīng)答[20]. Mukherjee等[21]和Barreiro等[22]的研究均表明TLRs在進(jìn)化中發(fā)生了純化選擇,然而最近的一些生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)鯨類TLR4在由陸地向海洋遷移的過(guò)程中發(fā)生了適應(yīng)性進(jìn)化[23],也在鯨類TLR8中檢測(cè)到了位于胞外結(jié)構(gòu)域的正選擇信號(hào)[19]. 本研究對(duì)瓶鼻海豚與牛TLR8基因的蛋白結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn),兩個(gè)物種胞內(nèi)域的TIR結(jié)構(gòu)域高度相似,因?yàn)槠渲饕?fù)責(zé)細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳遞,相對(duì)保守[24];相比之下,胞外域表現(xiàn)出更明顯的分化,存在一系列的氨基酸替換、插入和缺失位點(diǎn). 這可能是由于胞外域參與識(shí)別不同病原微生物的PAMP[25],而鯨類在二次入水過(guò)程中面臨的病原體差異相應(yīng)的介導(dǎo)了胞外域LRRs的進(jìn)化[18]. 在本實(shí)驗(yàn)中,發(fā)現(xiàn)牛和瓶鼻海豚相比,第三個(gè)LRR序列的位置有一定差異. LRR3能夠幫助TLR8識(shí)別富含AU的特異性配體ORN[26],其在靈長(zhǎng)目中高度保守,在牛和嚙齒目等物種中檢測(cè)到相似的氨基酸插入和缺失. 和嚙齒目相反,牛LRR3的變異不影響ORN直接識(shí)別、活化TLR8通路[26]. 然而,瓶鼻海豚與牛TLR8的氨基酸和LRR3的差異對(duì)免疫功能的影響有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證.

TLR8基因作為Toll樣受體家族成員,參與先天免疫的應(yīng)答. Zhou和 Hackstein等關(guān)于人TLR8基因的研究發(fā)現(xiàn),R848的刺激能夠活化TLR7/8的MyD88信號(hào)通路,促進(jìn)合成下游細(xì)胞因子,引起免疫應(yīng)答[27-28]. 此外,有研究發(fā)現(xiàn)R848的刺激也能夠激活豬、牛等哺乳動(dòng)物的TLR8基因[29]. 但是,R848的單獨(dú)刺激卻無(wú)法激活大鼠等嚙齒目的TLR8基因[29-31]. 對(duì)于鯨類這種二次入水的哺乳動(dòng)物,TLR8基因的免疫應(yīng)答功能尚未見報(bào)道. 本研究選用瓶鼻海豚代表鯨類,選用牛代表鯨類的陸生近緣哺乳動(dòng)物,在細(xì)胞和蛋白水平上檢測(cè)TLR8下游通路NF-κB和IL-8的表達(dá)情況. 結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染了牛和瓶鼻海豚TLR8基因的兩組細(xì)胞較對(duì)照組相比,其下游蛋白NF-κB和IL-8的表達(dá)量有了較為明顯的上升. 因此,本研究認(rèn)為瓶鼻海豚TLR8基因能夠通過(guò)激活下游信號(hào)通路,促進(jìn)合成NF-κB和IL-8等細(xì)胞因子,進(jìn)而引起細(xì)胞免疫應(yīng)答. 此外,牛R848刺激組表達(dá)量的提升比瓶鼻海豚組的提升更為顯著. Liu等[29]使用R848分別刺激轉(zhuǎn)染了數(shù)種陸生哺乳動(dòng)物TLR8基因的細(xì)胞,結(jié)果顯示和牛相比,刺激后人、豬和綿羊TLR8的下游蛋白NF-κB的表達(dá)量均顯著提升,而貓、馬的表達(dá)量則和牛相似. 因此,本研究認(rèn)為瓶鼻海豚TLR8基因?qū)848的敏感性可能低于包括牛在內(nèi)的大部分陸生哺乳動(dòng)物.

鯨類從陸地重返海洋后,面臨著截然不同的生活環(huán)境,如溫度、鹽堿度、病原體和滲透壓等,給鯨類帶來(lái)了巨大的挑戰(zhàn)[32-33]. 海洋中的病毒數(shù)量達(dá)到了數(shù)十億每升,病毒種類也極其多樣,但其中大部分為噬菌體或植物病毒等較難引起鯨類免疫應(yīng)答反應(yīng)的病原體[34-38]. 此外,海洋哺乳動(dòng)物的種類和數(shù)量相較于陸生哺乳動(dòng)物而言要少的多,這在一定程度上限制了部分病原微生物的傳播范圍和傳播速度. 以上各種原因,導(dǎo)致鯨類TLR8基因在海洋環(huán)境中發(fā)生了適應(yīng)性進(jìn)化,從而影響了其蛋白結(jié)構(gòu)和免疫應(yīng)答功能. Tian[9]等的研究發(fā)現(xiàn),瓶鼻海豚和牛的TLR4對(duì)陸地細(xì)菌的反應(yīng)存在物種特異性,且牛的TLR4反應(yīng)更強(qiáng)烈,這和本研究的結(jié)論相似. 綜上所述,和?；蚱渌懮溉閯?dòng)物相比,瓶鼻海豚TLR8基因?qū)848的敏感性較低,推測(cè)可能是海洋和陸地生態(tài)系統(tǒng)之間連通和傳播方式的差異導(dǎo)致了海洋和陸生哺乳動(dòng)物TLR8基因的差異進(jìn)化,這也符合 Nakajima[24]等提出的宿主-病原體共進(jìn)化的“軍備競(jìng)賽”理論.