橙子番茄混合果酒帶渣主發(fā)酵工藝優(yōu)化

李丹，鄧仕彬，劉濤，鄭常玲，汪秀妹，黃雅茹，陳雅芳

（莆田學院環(huán)境與生物工程學院，枇杷種質資源創(chuàng)新與利用福建省高校重點實驗室，福建 莆田 351100）

橙子是我國常見的一種柑橘類水果，其表皮顏色鮮艷，果肉和果汁占比高，味道清甜，營養(yǎng)豐富。橙子屬于不容易腐爛發(fā)霉的水果，保存期相對較長。橙子有較高的營養(yǎng)價值，維生素含量較高[1]。此外還具有抗炎、抗癌、抗氧化、抗過敏、延緩衰老、滋潤養(yǎng)顏、補肝安神等重要生理功能，有益于人體健康[2-4]。番茄是一種常見的營養(yǎng)豐富的果蔬，外觀呈紅色，既可以生食、炊后食用，也可加工制成醬、汁或制成番茄罐頭保藏，是老幼皆宜的果蔬[5]。番茄中的番茄紅素含量較高[6]，番茄紅素具有抗氧化功能和清除自由基能力，還能發(fā)揮抗衰、抑癌等生理功能[7-8]。由于番茄不宜長時間貯存且不能長途運輸，采摘后應盡快利用，避免造成嚴重損失[9]。隨著消費多元化和營養(yǎng)健康果酒方面消費需求的增長，市面上單一品種的葡萄酒已經不能滿足消費者的需要[10]，因此以橙子和番茄作為主要原料，研制具有抗氧化能力且高營養(yǎng)價值的釀制復合果酒，可以滿足消費者對健康多元化食品的需要。

揮發(fā)性成分的種類、含量影響著果酒的感官品質[11]。傅里葉紅外光譜技術（Fourier transform infrared spectrometer，FTIR）具有無損快速鑒定復雜體系官能團的特點。橙子和番茄中的抗氧化活性成分隨著發(fā)酵過程的進行，逐漸滲透到酒液中，使果酒具有清除自由基的作用[12]。本試驗以橙子、番茄為主要試材，通過改變果漿體積比、焦亞硫酸鈉添加量、初始糖度、酵母接種量4個條件，以優(yōu)化混合果酒的發(fā)酵工藝，在分析各因素對混合果酒的感官品質影響的基礎上，采用響應面（Box-Behnken）試驗優(yōu)化條件。采用氣相色譜-質譜聯(lián)用技術對優(yōu)化后的混合果酒的香氣成分進行分析，并對混合果酒的抗氧化性能進行分析，采用傅里葉紅外光譜技術測定果酒的特征官能團信息，豐富果酒的市場。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

倫晚橙、番茄：市售；蔗糖：廈門古龍食品有限公司；葡萄酒、果酒專用酵母：安琪酵母股份有限公司；纖維素酶（100 000 U/g）、果膠酶（30 000 U/g）：山東隆科特酶制劑有限公司；焦亞硫酸鈉（食品級）：河南華興生物科技有限公司；無水檸檬酸（食品級）：福建緣菱鑫生物科技有限公司；硫酸亞鐵、水楊酸、無水乙醇、過氧化氫、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、鐵氰化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

AR12CN型電子天平、STARTER 2100酸度計：奧豪斯儀器（上海）有限公司；DK-S24恒溫水浴鍋：上海森信實驗儀器有限公司；PYX-300G-B恒溫培養(yǎng)箱：廣東科力韶關實驗儀器有限公司；PAL-1糖度計：廣州愛拓（ATAGO）科學儀器有限公司；RHW-80酒精濃度計：漳州市新奧光電儀器有限公司；UV-5500PC紫外可見分光光度計：上海元析儀器有限公司；V-1100D可見分光光度計：上海美譜達儀器有限公司；MJWBL5431J攪拌機：廣東美的生活電器制造有限公司；H1850醫(yī)用離心機：湖南湘儀離心機儀器有限公司；QP2010氣相色譜質譜聯(lián)用儀：日本島津公司；TENSORⅡ傅里葉紅外光譜儀：德國布魯克科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 混合果酒發(fā)酵操作要點

將橙子和番茄清洗干凈，切塊后在打漿機中打漿，橙子果漿[橙子∶水=1∶1（體積比）]與番茄果漿[番茄∶水=2∶1（體積比）]按照一定體積比混合，混合果漿加入一定量的焦亞硫酸鈉，80 mg/L果膠酶和80 mg/L的纖維素酶，攪拌溶解，放入50℃水浴鍋中酶解2 h，隨后以白砂糖調節(jié)混合果漿的初始糖度，以檸檬酸調節(jié)pH值至3.5。將一定量的酵母加入到30 mL糖液（糖度為5°Brix）中，在38℃下活化0.5 h。將酵母液加入至果漿完成酵母接種，密封置于25℃恒溫培養(yǎng)箱進行發(fā)酵。形成的混合果酒經過澄清、過濾后，將成品進行糖度、酒精度測定和感官評定。

1.3.2 單因素試驗

按照 1.3.1 的方法，研究果漿體積比（3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3）、初始糖度（16、18、20、22、24、26 °Brix）、焦亞硫酸鈉添加量（10、30、50、70、90 mg/L）、酵母接種量（0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 g/L） 和發(fā)酵時間（1、2、3、4、5、6、7、8、9 d）對混合果酒品質的影響。

1.3.3 響應面試驗

分析單因素試驗對混合果酒品質的影響，選擇初始糖度、焦亞硫酸鈉添加量、酵母接種量進行響應面優(yōu)化，得到混合果酒的最佳工藝。試驗因素水平見表1。

表1 響應面因素水平設計Table 1 Factors and levels of Box-Behnken testes design

1.3.4 混合果酒體外抗氧化活性測定

·OH清除率和Fe3+還原力的測定參考程宏楨等[12]的方法。

1.3.5 理化指標及感官評價方法

色度和透光率參考梁冬梅等[13]的方法；酒精度采用酒精度計測定；pH值采用酸度計測定；糖度采用糖度計測定；還原糖、干浸出物參照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用試驗方法》進行測定；感官評價參照GB/T 15037—2006《葡萄酒》檢測。邀請接受過感官培訓的評定小組（10人），對混合果酒的色澤、透明度、香氣、滋味及典型性進行綜合評價，最終得分取平均值，評分標準見表2。

表2 感官評分標準Table 2 Sensory rating criteria

1.3.6 香氣成分測定

采用氣相色譜-質譜聯(lián)用，參考馬德秀等[14]、高馨雨等[15]和賈愷等[16]的方法進行測定。

1.3.7 特征官能團測定

將酒液干燥后進行FTIR測定。

1.4 數據處理

采用Excel 2019整合數據，Origin 8.5繪圖，Design Expert8.0.6進行響應面優(yōu)化。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 果漿體積比對混合果酒感官評分的影響

將橙子和番茄的果漿分別按照 3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3的體積比進行混合，添加果酒專用酵母進行發(fā)酵，發(fā)酵8 d后對混合果酒進行感官評價，感官評分見圖1。

圖1 不同果漿體積比制得的混合果酒的感官評分Fig.1 Sensory evaluation of mixed fruit wine prepared with different pulp volume ratio

由圖1可知，橙子和番茄果漿體積比為1∶2時，發(fā)酵制得的混合果酒感官評分最高。在此條件下，混合果酒顏色呈淡橙色或淡紅色，有光澤且澄清，口感較柔和。番茄的香甜味較大程度地掩蓋了橙子的苦味。因此，后續(xù)優(yōu)化試驗選用果漿體積比1∶2釀造混合果酒。

2.1.2 發(fā)酵時間對混合果酒發(fā)酵的影響

不同初始糖度下混合果酒糖度隨著時間的變化結果見圖2。

圖2 不同初始糖度下糖度隨發(fā)酵時間的變化Fig.2 Change in sugar contents with fermentation time under different initial sugar content

由圖2可知，隨著混合果酒發(fā)酵時間的延長，混合果酒的糖度逐漸降低，發(fā)酵6 d后，糖度呈穩(wěn)定趨勢。因此，后續(xù)優(yōu)化試驗選擇發(fā)酵時間為6 d。

2.1.3 初始糖度對混合果酒發(fā)酵的影響

初始糖度對混合果酒發(fā)酵的影響見圖3。

由圖3可知，初始糖度在16°Brix～24°Brix范圍內，酒精度隨初始糖度增加而上升。這是由于在此初始糖度范圍內，可利用營養(yǎng)物質多，酵母生長繁殖旺盛，生成酒精量就越多。初始糖度在24°Brix～26°Brix范圍內，酒精度變化很小。這是由于酒液中糖含量較高，發(fā)酵酒液滲透壓升高，酵母不能生長到理想的狀態(tài)，影響了酒精的合成。由于果酒酒精度不必要求過高，而過高的糖度會影響混合果酒口感并且浪費材料，結合感官評分的結果，確定初始糖度為24°Brix為較優(yōu)條件。

圖3 初始糖度對混合果酒發(fā)酵的影響Fig.3 Effect of initial sugar content on fermentation of fruit wine

2.1.4 焦亞硫酸鈉添加量對混合果酒發(fā)酵的影響

焦亞硫酸鈉添加量對混合果酒發(fā)酵的影響見圖4。

圖4 焦亞硫酸鈉添加量對混合果酒發(fā)酵的影響Fig.4 Effect of addition amount of sodium pyrosulfite on fermentation of fruit wine

由圖4可知，在試驗范圍內，焦亞硫酸鈉添加量為70 mg/L時，酒精度最大。混合果酒中添加焦亞硫酸鈉可降低微生物的生存率，焦亞硫酸鈉添加量在10mg/L～70 mg/L時，酒液中其他雜菌難以存活而酵母菌可以生存，酒液中的白砂糖被酵母菌中的蔗糖酶水解為單糖，生成酒精和CO2，因此酒精度升高，糖度降低。當焦亞硫酸鈉添加量為90 mg/L時，焦亞硫酸鈉濃度過高抑制酵母菌的生長繁殖，酵母菌無法利用白砂糖轉化為酒精，因此酒精度低，糖度升高。結合感官評分，確定焦亞硫酸鈉添加量70 mg/L為較優(yōu)條件。

2.1.5 酵母接種量對混合果酒發(fā)酵的影響

酵母接種量對混合果酒發(fā)酵的影響見圖5。

圖5 酵母接種量對混合果酒發(fā)酵的影響Fig.5 Effect of inoculation amount of yeast on fermentation of fruit wine

由圖5可知，當酒液中酵母接種量為0.4 g/L時，酒精度最大，糖度最小。酵母接種量低于0.4 g/L時，酵母繁殖量低，混合果酒不能得到充分發(fā)酵，因此糖不能被酵母全部吸收轉化，從而酒精度低，糖度高。而酵母添加量較高時，添加量越高，酵母的生存競爭力越大，導致酵母存活率越低，最終糖度升高，酒精度降低。當酵母接種量為0.4 g/L時，酵母存活率高，且存活狀態(tài)旺盛，因此糖利用率較高，糖度較低而酒精度高，結合感官評分，確定酵母接種量0.4 g/L為較優(yōu)條件。

2.2 響應面優(yōu)化

2.2.1 響應面試驗結果

優(yōu)化試驗結果見表3。

表3 響應面試驗設計方案及結果Table 3 Results of Box-Behnken central composite design

根據Design Expert V8.0.6軟件的分析，得到A初始糖度、B焦亞硫酸鈉添加量、C酵母接種量對感官評分的回歸方程：感官評分=81.4+1.13A-2.75B+0.63C-0.5AB-1.25AC+0.5BC-5.58A2-4.83B2-2.57C2。

2.2.2 方差分析

回歸模型的方差分析結果見表4。

表4 回歸模型的方差分析Table 4 Variance of regression model

由表 4可知，該模型極顯著（P=0.000 2＜0.01），失擬項不顯著（P=0.298 4＞0.05），模型的選取具有合理性。決定系數R2=0.968 3，校正系數R2adj=0.927 6，表明此模型可以用于可靠分析混合果酒的發(fā)酵工藝。一次項初始糖度差異顯著（P＜0.05），焦亞硫酸鈉添加量差異極顯著（P＜0.01），交互項表現不顯著（P＞0.05），二次項 A2、B2、C2差異均為極顯著（P＜0.01），表示本試驗的因素選擇合理。根據F值可判斷因素對響應值的影響程度，表4中一次項所對應的F值大小排序為B＞A＞C，表明焦亞硫酸鈉添加量影響力最強，酵母接種量影響最弱。

2.2.3 交互作用分析

根據3D響應圖中各因素的走勢可以推斷對響應值的作用大小。響應面曲面中，越平坦的曲面可判定為影響響應值的能力越小，反之亦然。各因素對混合果酒感官評分影響的響應面圖見圖6。

由圖6可知，從曲面的傾斜度可以判斷，焦亞硫酸鈉添加量的曲面最陡峭，表明對感官評分的影響最大，初始糖度的曲面次之，酵母接種量的曲面最平緩，這與方差分析的結果一致[17]。

圖6 各因素對混合果酒感官評分影響的響應面Fig.6 Response surface graph of the effects of different factors on sensory score of mixed fruit wine

2.2.4 混合果酒最佳條件的驗證

通過軟件分析與優(yōu)化，最優(yōu)發(fā)酵參數為初始糖度24.21°Brix、焦亞硫酸鈉添加量 64.25 mg/L、酵母接種量0.41 g/L，該數據下混合果酒的感官評分為81.875 5分。為了使試驗操作更好地進行，修正后的參數值為初始糖度24.2°Brix、焦亞硫酸鈉添加量65 mg/L、酵母接種量0.41 g/L，進行3次平行，得出的混合果酒感官評分為83分，與預測的數值十分接近，表示該試驗結果可信度較高，也可以更好地預測混合果酒的發(fā)酵條件會如何影響感官評分。

2.3 混合果酒的性質分析

2.3.1 混合果酒抗氧化活性分析

混合果酒·OH清除能力見圖7。

圖7 混合果酒·OH清除率Fig.7 The scacenging ability of·OH of mixed fruit wine

由圖7可知，混合果酒的·OH清除率較高，在樣品添加量范圍內變化幅度較小，VC的·OH清除率在添加量為0.3 mL～1.2 mL之間呈現上升趨勢，在添加量高于1.2 mL后，持續(xù)保持較高的清除率。在樣品添加量0.3 mL～1.2 mL時，混合果酒的清除率高于VC的清除率，當混合果酒的添加量為0.3 mL時，其·OH清除率已經達到98%。樣品添加量為1.2 mL～2.0 mL時，混合果酒和VC的清除率都保持較高狀態(tài)，且VC的清除率略高于混合果酒的清除率[18]。

混合果酒對Fe3+還原力的影響見圖8。

圖8 混合果酒對Fe3+還原力的影響Fig.8 The effect of fruit wine on Fe3+reducing ability

由圖8可知，在樣品添加量范圍內，混合果酒及VC的Fe3+還原力均隨著樣品添加量的增加而逐漸增大，最后趨于穩(wěn)定。由于番茄中存在的番茄紅素具有強力的抗氧化特性，且在工藝過程中添加了焦亞硫酸鈉（抗氧化劑），與 FeCl3發(fā)生反應可以使 K3[Fe（CN）6]的 Fe3+還原為Fe2+?；旌瞎圃谔砑恿繛?.25 mL～1.50 mL時，其Fe3+還原力小于VC的Fe3+還原力，當混合果酒添加量為1.75 mL～2.00 mL時，混合果酒的Fe3+還原力略高于 VC的 Fe3+還原力[19]。

2.3.2 指標分析

由最優(yōu)工藝進行3組平行驗證試驗，測定出混合果酒的酒精度 9.6%vol，pH3.5，糖度 7.6 °Brix，透光率73.1%，色度1.303，還原糖54.12 g/L，干浸出物28.4 g/L，感官評分81分。

2.3.3 香氣成分分析

混合果酒的主要香氣成分見表5。

表5 混合果酒的香氣成分Table 5 Aroma components of fruit wine

由表5可知，這些香氣成分主要有酯類、醇類、酸類等，其中峰面積占比＞1%的香氣物質有異戊醇34.37%（蘋果白蘭地香氣）、硫酸二丁酯16.22%（花香香韻）、辛酸乙酯14.80%（白蘭地酒香味）、癸酸乙酯10.08%（果香、酒香、白蘭地香味）、苯乙基乙醇4.11%（玫瑰香味）、乙酸異戊酯3.64%（香蕉香氣）、甲酸正己酯2.49%（水果香味）、辛酸2.17%（水果香氣）、己酸乙酯1.65%（曲香、菠蘿香型香氣），占峰面積最高的成分為異戊醇34.37%?？得鼷惖萚20]研究柑橘果酒香味物質中，辛酸乙酯、癸酸乙酯和正己酸乙酯為果酒做出主要貢獻，與本試驗結果相近。超過800種的香氣成分蘊藏在果酒中[21-22]，大多數酯類物質具有花果香味和酒香味，因此賦予了混合果酒的香氣。

2.3.4 特征官能團的測定結果

果酒的紅外特征光譜圖見圖9。

圖9 果酒的紅外光譜圖Fig.9 Infrared spectrum of fruit wine

由圖9可知，3 297 cm-1處的強寬吸收帶為O-H伸縮振動，對應酒中的羧基中的OH；2 917 cm-1為C-H 伸縮振動區(qū)（3 000 cm-1～2 700 cm-1）；1 714 cm-1的吸收峰處于羰基C=O的伸縮振動區(qū)（1 900 cm-1～1 650 cm-1），可能對應的是混合果酒中的酯類物質；1 605 cm-1的吸收峰位于雙鍵伸縮振動區(qū)（1 690 cm-1～1 500 cm-1），可能對應的是混合果酒中含有苯環(huán)骨架的物質；1 222 cm-1和1 402 cm-1的吸收峰位于X-H面內彎曲振動及X-Y伸縮振動區(qū)（1475cm-1～1000cm-1），1 402 cm-1附近的吸收峰說明混合果酒中含脂肪族-α-氨基酸[23]，1 222 cm-1的吸收峰對應的是酯類的=CO-C基團，對應混合果酒中的酯類物質；1 035 cm-1的強尖峰說明混合果酒中含有伯醇類物質；921 cm-1位于烯烴、芳烴的C-H面外振動區(qū)。

3 結論

本文采用單因素、響應面試驗，擬定橙子番茄混合果酒發(fā)酵工藝，優(yōu)化后工藝條件為橙子果漿（橙子∶水=1∶2）與番茄果漿（番茄∶水=1∶1）的體積比為 1∶2，初始糖度24.2°Brix，酵母接種量0.41 g/L，焦亞硫酸鈉添加量65 mg/L，感官評分為83分。在最優(yōu)條件下得到的混合果酒色澤呈淡紅色，果香與酒香味協(xié)調，酸甜適中，回味香甜?；旌瞎频摹H清除率可達到98%，Fe3+還原力隨著樣品的添加量增大而增大。采用氣相色譜-質譜聯(lián)用技術分析混合果酒的揮發(fā)性香氣物質，主要成分為異戊醇、硫酸二丁酯、辛酸乙酯和癸酸乙酯等?；旌瞎圃诩t外光譜圖中存在較明顯的特征峰，這些特征峰與混合果酒所含物質組分相符。