紫蘇黃酮抗菌活性表征

劉思佳，邢鈺彬，星萍，陳曉平

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林 長春 130118）

紫蘇（Perilla frutescens L.）是一年生草本植物，屬于唇形科（Labiatae）[1]，又被稱作赤蘇、香蘇等。紫蘇是一種藥食同源的經(jīng)濟作物[2]，是我國最早公布的藥食同源植物之一[3]。據(jù)研究表明，紫蘇中的活性物質(zhì)有抗菌[4]、抗過敏、抗氧化[5]、抗腫瘤[6]、抑菌防腐等功效。經(jīng)常食用紫蘇能起到降血脂、抗衰老、抗癌、提高記憶力、健腦等功能[7]。紫蘇的各個部位在食品行業(yè)都被廣泛應(yīng)用[8-9]。紫蘇葉作為優(yōu)質(zhì)食材深受消費者喜愛。另外，市場上還有許多與紫蘇有關(guān)的產(chǎn)品，如紫蘇汁、紫蘇保健茶、紫蘇籽精油、紫蘇保健酒等[10-14]。國內(nèi)學(xué)者對紫蘇葉的研究也越來越多。由于紫蘇豐富的營養(yǎng)價值，對紫蘇中化學(xué)成分及生物活性的研究已成為國內(nèi)外食品領(lǐng)域研究的熱點，但我國對于紫蘇的研究起步較晚，大多集中在紫蘇黃酮提取工藝優(yōu)化方面，對紫蘇黃酮抗菌活性的研究甚少[15]。

本研究利用超聲波輔助乙醇提取法對紫蘇黃酮進行提取。分別以大腸桿菌（Escherichia coli，E.coli）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，S.aureus）、霉菌及酵母菌（Saccharomycetes）為供試菌，采用濾紙片法等研究方法，通過抑菌圈、最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）、最低殺菌濃度（minimum bactericidal concentration，MBC）等指標(biāo)測定，探究紫蘇黃酮抗菌活性。在此基礎(chǔ)上，進一步研究紫蘇黃酮抗菌活性的pH值穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性，為紫蘇的開發(fā)利用和新型純天然食品保鮮劑的研究提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

紫蘇：市售；蒸餾水：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院實驗室自制；無水乙醇、氫氧化鈉、硫酸亞鐵、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氯化鈣、鹽酸、硝酸鈉、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、氯化鉀：廣州化學(xué)試劑廠；植物蛋白胨、胰蛋白胨、瓊脂粉：上海緣肽生物技術(shù)有限公司；酵母提取物：山東玉寶生物科技股份有限公司；蔗糖、葡萄糖：西亞化學(xué)試劑有限公司；大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、霉菌、酵母菌：豐暉生物科技有限公司。以上試劑均為分析純。

1.2 主要儀器與設(shè)備

鼓風(fēng)干燥箱（DHG-9037A）、電子天平（FA2004）：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；粉碎機（SZFJ-200）：中國旭朗機械有限公司；超聲波提取儀（HJ911-8P）：上海達洛科技有限公司；高速冷凍離心機（KH20R）：湖南凱達科學(xué)儀器有限公司；紫外可見分光光度計（UV759/UV759CRT）：湖南聚創(chuàng)環(huán)保有限公司；生化培養(yǎng)箱（BJPX-150）、高壓蒸汽滅菌鍋（BKQ-B100I）：山東博科科學(xué)儀器有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（R502B）：上海SENCO有限公司；循環(huán)水式真空泵（SHB-III型）：鄭州長城科工貿(mào)有限公司；普通型冷凍干燥機（LGJ-10）：北京松源華興科技發(fā)展有限公司；pH計（pH-9701）：北京格樂普高新技術(shù)有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 紫蘇黃酮提取

將紫蘇葉放入鼓風(fēng)干燥箱中進行60℃恒溫干燥，干燥后將冷卻至37℃的紫蘇葉放入粉碎機進行粉碎，粉碎后的紫蘇粉過80目篩，準(zhǔn)確稱取紫蘇干粉5.0 g，置于錐形瓶中，加入一定量的乙醇溶劑，置于超聲波提取儀中進行一定時間的提取、抽濾并收集濾渣，重復(fù)此步驟提取2次，合并濾液，放置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中，對其進行減壓濃縮，將濃縮后的樣品用60%乙醇定容至100 mL，即得黃酮提取液，備用。

1.3.2 黃酮含量測定

參考杜若源等[16]的方法稍作修改，以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，采用NaNO2-Al（NO3）3顯色法制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線詳見圖1。標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=0.853 4x+0.525 1，R2=0.999 5。黃酮含量以每克干燥樣品中所含的相當(dāng)于蘆丁的量進行計算[17]，根據(jù)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算紫蘇中黃酮的含量。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of rutin

1.4 紫蘇黃酮抗菌活性研究

1.4.1 菌種培養(yǎng)及菌懸液的制備

將活化好的4種供試菌種接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，大腸桿菌與金黃色葡萄球菌通過37℃恒溫培養(yǎng)24h待其活化。用接種環(huán)挑取少量供試菌于50mL的培養(yǎng)基內(nèi)，37℃振蕩培養(yǎng)24h，酵母菌在28℃下培養(yǎng)24 h，霉菌在30℃下培養(yǎng)48 h。分別取適量菌液用無菌水進行稀釋，使菌懸液濃度達到108CFU/mL備用[18]。

1.4.2 抑菌圈試驗

采用濾紙片法[19]，取濃度為108CFU/mL的各菌液1.0 mL分別加入到25 mL營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，均勻混合后倒入平皿恒溫培養(yǎng)，以菌能夠長滿培養(yǎng)皿且能夠分布均勻為評判適宜菌液濃度標(biāo)準(zhǔn)。

1）利用打孔器，將滲透性強的濾紙片打孔，孔徑為8 mm左右，并將其放置于干凈的培養(yǎng)皿中，在121℃高溫高壓蒸汽滅菌20min，滅菌后置無菌操作臺，備用。

2）設(shè)置不同濃度紫蘇黃酮提取液為試驗組，分別為 2.5、5、10、15 mg/mL；設(shè)置濃度為 5 mg/mL 的山梨酸鉀作為陽性對照組；以無菌水作空白對照組，進行后續(xù)試驗操作。

3）在無菌操作臺中操作配制好的菌懸液，吸取100 μL搖勻后的菌懸液放在平板上，使用滅菌后的涂布棒將已經(jīng)冷卻凝固的固體培養(yǎng)基均勻涂布。每個培養(yǎng)基平皿設(shè)置無菌水為空白對照組（C）、設(shè)置5 mg/mL的山梨酸鉀為陽性對照組（P）、試驗組 1（T1，2.5mg/mL）、試驗組 2（T2，5 mg/mL）、試驗組 3（T3，10 mg/mL）、試驗組4（T4，15 mg/mL）。將滅菌濾紙片用無菌鑷子放入到含有不同濃度黃酮提取液的滅菌培養(yǎng)皿中浸泡。用無菌鑷子夾取含黃酮的濾紙片，將多余液體在內(nèi)培養(yǎng)皿邊上擦掉，放置在含菌平板培養(yǎng)基表面，并進行按壓，且不能破壞培養(yǎng)基，使濾紙片能與培養(yǎng)基進行密切接觸。濾紙片距培養(yǎng)皿邊緣10 mm。每個培養(yǎng)皿均勻放置6張紙片。

4）將處理好的細(xì)菌平板于37℃恒溫培養(yǎng)箱中進行恒溫培養(yǎng)24 h～48 h后取出，觀察菌落的生長情況，用十字交叉法測量抑菌圈直徑，測量3次取平均值。

1.4.3 MIC測定

采用曹銘晨等[20]方法，略作修改。采用倍比稀釋法，取試管分別編號1號～8號，1號管裝1.8 mL液體培養(yǎng)基，2號～8號管分別裝入1 mL液體培養(yǎng)基。通過高溫高壓滅菌后冷卻，在無菌臺上操作，分別加入0.2 mL濃度為1 mg/mL紫蘇黃酮溶液子1號管中，搖勻，從1號試管吸取1 mL混合液移入2號管，按這種方式依次進行操作。1號～7號管中紫蘇提取物濃度分別為 10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125、0.156 mg/mL。到 8號管棄去1 mL，用8號管作為對照組。再在1號～8號試管各加入菌懸液0.1 mL，37℃恒溫培養(yǎng)24 h后，肉眼觀察試管混濁還是澄清，澄清試驗管的最低濃度為紫蘇黃酮對該菌的MIC值。

1.4.4 MBC測定

將紫蘇黃酮提取液的濃度大于等于MIC的試管繼續(xù)進行為期24 h的培養(yǎng)，并觀察其生長的情況，以依舊沒有菌生長的黃酮提取液濃度為其MBC值[21]。

1.4.5 pH值對紫蘇黃酮抗菌活性的影響

按照程道梅等[22]方法稍作修改。用檸檬酸溶液（0.1 mol/L）和NaOH溶液（2%）分別調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH值，使其 pH 值分別為 3、4、5、6、7、8。然后利用各菌的 MIC的黃酮提取液分別進行抗菌性試驗，以對照組乙醇進行對比，研究pH值對紫蘇黃酮抗菌活性的影響。

1.4.6 紫蘇黃酮抗菌活性熱穩(wěn)定性試驗

將黃酮提取液置于80、100、121℃的條件下分別處理15 min后，以對各菌的MIC的黃酮進行抗菌試驗，探究紫蘇黃酮抗菌活性成分的熱穩(wěn)定性。

1.5 數(shù)據(jù)處理

每組試驗分別進行3次，詳細(xì)記錄試驗數(shù)據(jù)；利用SPSS軟件對各組數(shù)據(jù)進行分析處理，對紫蘇黃酮的抗菌性進行基礎(chǔ)研究。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫蘇黃酮對各供試菌抑菌活性的抑菌圈測定

紫蘇黃酮對各供試菌抑菌活性的抑菌圈測定結(jié)果見表1。

表1 紫蘇黃酮對各供試菌的抑菌活性的抑菌圈測定結(jié)果Table 1 Results of the bacteriostatic circle of perilla flavone on the bacteriostatic activities of each tested bacteria

由表1可知，不同濃度的紫蘇黃酮對4種供試菌均有一定的抑菌效果，隨著濃度的增加其抑菌效果也有明顯的增長，這是因為紫蘇中的活性成分有效抑制了各類菌種的生長。在相同濃度下，紫蘇對大腸桿菌的抑菌效果明顯優(yōu)于其他3種供試菌，其抑菌效果排列順序為大腸桿菌＞金黃色葡萄球菌＞酵母菌＞霉菌。對照組山梨酸鉀對各供試菌種也有一定抑菌效果，對革蘭氏陽性菌的抑菌效果要明顯小于革蘭氏陰性菌，所以對霉菌、酵母菌和好氧性細(xì)菌有良好的抑制作用；其主要是將微生物的脫氫酶系統(tǒng)進行抑制，從而達到抗微生物以及防腐作用。

抑菌活性能力的結(jié)果表明，紫蘇黃酮對革蘭氏陰性菌的抑菌能力要強于革蘭氏陽性菌，可能是這兩種細(xì)胞膜的組成與排列方式不同導(dǎo)致的。革蘭氏陰性菌的外部磷脂膜帶有結(jié)構(gòu)性脂多糖，它與孔蛋白構(gòu)成選擇性屏障，使得抑菌物質(zhì)滲透完全，革蘭氏陽性菌細(xì)胞膜外部有一個肽聚糖層，是無效的滲透屏障，從而抑菌作用沒有那么明顯[23]。研究表明，黃酮分子上有很多酚羥基，這些基團能夠與蛋白質(zhì)或酶以氫鍵的方式結(jié)合，破壞蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)使其變性失活，導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)固縮、解體，從而起到抑菌作用[24]。

2.2 紫蘇黃酮對各供試菌的MIC及MBC測定

紫蘇黃酮對各供試菌的最低抑菌濃度測定結(jié)果見表2。

表2 紫蘇黃酮對各供試菌的最低抑菌濃度測定結(jié)果Table 2 Results of minimal inhibitory concentration of perilla flavone on each strain tested

紫蘇黃酮對各供試菌的最低抑菌濃度及最低殺菌濃度測定結(jié)果見表3。

表3 紫蘇黃酮的最低抑菌濃度及最低殺菌濃度測定結(jié)果Table 3 Determination results of minimum inhibitory concentration and minimum bactericidal concentration of flavonoids from perilla flavone

由表2可知，在提取物濃度為0.625 mg/mL時，大腸桿菌的生長完全被抑制；在提取物濃度為1.25 mg/mL時，金黃色葡萄球菌的生長完全被抑制，提取液濃度為2.5 mg/mL時，酵母菌和霉菌的生長完全被抑制，而對照組中各菌生長均呈現(xiàn)明顯上升趨勢。因此，紫蘇提取液對大腸桿菌的MIC為0.625 mg/mL，對金黃色葡萄球菌的MIC為1.25 mg/mL，對酵母菌和霉菌的MIC均為2.5 mg/mL。

2.3 紫蘇黃酮抑菌活性的pH值穩(wěn)定性試驗

紫蘇黃酮抑菌活性的pH值穩(wěn)定性試驗結(jié)果見表4。

由表4可知，在pH值為3～7的范圍內(nèi)，在紫蘇黃酮溶液濃度為0.625 mg/mL時，大腸桿菌的生長完全被抑制；在黃酮溶液濃度為1.25 mg/mL時，金黃色葡萄球菌的生長完全被抑制，濃度為2.5 mg/mL時，霉菌和酵母菌的生長完全被抑制，當(dāng)pH值上升至8時，紫蘇黃酮的抑制活性逐漸減弱，微生物生長加快，但生長趨勢小于對照組。未添加紫蘇黃酮的空白組在pH值小于5時，對各菌的生長抑制性較強，但當(dāng)pH值大于7時，對各菌的生長抑制強度降低。

表4 pH值對紫蘇黃酮抗菌活性的影響Table 4 Effect of pH on the antibacterial activity of perilla flavone

2.4 紫蘇黃酮抑菌活性的熱穩(wěn)定性試驗

紫蘇黃酮抑菌活性的熱穩(wěn)定性試驗結(jié)果見表5。

表5 熱處理對紫蘇黃酮抗菌活性的影響Table 5 Effect of heat treatment on the antibacterial activity of perilla flavone

由表5可知，溫度設(shè)定為80℃以下時，紫蘇提取物黃酮的抗菌活性未受到影響，均呈較為穩(wěn)定的抗菌性。設(shè)定溫度為100℃，加熱15 min，紫蘇黃酮的抗菌活性仍不受影響，設(shè)定溫度為121℃，15 min時，高溫處理會使其抗菌活性減弱，這是由于受高溫的影響，黃酮中的活性成分發(fā)生分解或改性。故控制溫度條件在100℃以下，對試驗不會產(chǎn)生較大影響。

3 討論與結(jié)論

植物源抗菌物質(zhì)在自然界中廣泛存在，植物體內(nèi)的許多代謝產(chǎn)物如生物堿、黃酮類、有機酸類和酚類化合物等存在抑菌性[25]，而植物源黃酮類物質(zhì)具有廣譜抑菌性。本試驗研究了紫蘇提取物黃酮對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、霉菌及酵母菌的抗菌作用，結(jié)果顯示：紫蘇提取物黃酮對這4種供試菌均有一定的抑菌效果，其對大腸桿菌抑菌效果最好，其次為金黃色葡萄球菌，再次為酵母菌和霉菌。

作為常用酸性防腐保鮮劑的苯甲酸、山梨酸只有在酸性條件下其防腐效果才能達到優(yōu)秀。本研究結(jié)果顯示在pH值為3～7的范圍內(nèi)，紫蘇黃酮均能對微生物的生長呈現(xiàn)出較好抑制作用，可見其pH值范圍較廣，對酸、弱堿性食品均可起到一定的保藏效果。

目前已從紫蘇總黃酮中分離出許多單體成分，如迷迭香酸、檸檬酸、黃芩苷芹菜素-6，8-二-C-葡萄糖苷、木犀草素-7-氧-二葡萄糖醛酸苷、丹參素、咖啡酸、原兒茶酸。本研究為紫蘇黃酮抗菌作用的深入研究，為天然植物保鮮劑的開發(fā)提供一定的理論依據(jù)，促進紫蘇黃酮資源更加合理利用。

熱處理作為食品加工儲藏的有效方法之一，使得保鮮防腐劑要發(fā)揮其抗菌作用必須具有一定的耐熱性。本研究結(jié)果顯示，紫蘇黃酮熱穩(wěn)定性較好，100℃加熱15 min抗菌活性未受影響。

本研究結(jié)果表明，紫蘇黃酮對4種供試菌均有一定的抗菌效果，其對大腸桿菌的抗菌活性最強（MIC，MBC分別為0.625、1.3mg/mL），其次為金黃色葡萄球菌（1.25、2.5 mg/mL），再次為酵母菌（MIC，MBC 分別為 2.5、4.8 mg/mL）和霉菌（MIC，MBC 分別為 2.5、5 mg/mL）。在pH值為3～7的范圍內(nèi)，提取液濃度在各菌的MIC濃度下，均能完全抑制受試微生物的生長；溫度條件在100℃以下時，紫蘇黃酮的抗菌能力不受影響，當(dāng)溫度上升至121℃及以上時，會對抗菌活性有顯著影響。綜上所述，紫蘇作為一種天然優(yōu)質(zhì)抗菌植物資源可以加以研究開發(fā)利用。