兔卵巢顆粒細(xì)胞分離培養(yǎng)條件的優(yōu)化

靳榮帥，陳 實(shí)，周 娟，白少成，張 琛，姚 凡，陳 陽(yáng)，吳信生

（揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州 225000）

卵巢顆粒細(xì)胞存在于雌性動(dòng)物卵泡腔內(nèi)，一般顆粒細(xì)胞可分為兩大類，一類是包裹在卵母細(xì)胞周圍的卵丘顆粒細(xì)胞，一類是排列在卵泡壁上的壁層顆粒細(xì)胞[1]。包裹卵母細(xì)胞的卵丘顆粒細(xì)胞會(huì)在排卵前發(fā)生擴(kuò)散，排卵后壁層顆粒細(xì)胞會(huì)發(fā)生黃體化形成粒黃體細(xì)胞，之后與膜細(xì)胞形成黃體，這一過(guò)程對(duì)維持妊娠至關(guān)重要。卵泡的發(fā)育及排卵依賴于卵巢顆粒細(xì)胞和卵母細(xì)胞之間的高度協(xié)調(diào)發(fā)育，而這種高度協(xié)調(diào)發(fā)育主要通過(guò)2 種細(xì)胞之間持續(xù)、復(fù)雜、雙向的信號(hào)交流完成[2-3]。卵丘顆粒細(xì)胞與卵母細(xì)胞之間通過(guò)微絨毛形成縫隙連接，2 種細(xì)胞通過(guò)縫隙連接完成營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、初級(jí)代謝產(chǎn)物和一些信息分子的傳遞，進(jìn)而促進(jìn)2 種細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化，使兩者達(dá)到高度協(xié)調(diào)發(fā)育[4-5]。此外，卵母細(xì)胞無(wú)法有效利用葡萄糖產(chǎn)生能量，只能利用顆粒細(xì)胞代謝產(chǎn)生的羧酸進(jìn)行氧化磷酸化反應(yīng)產(chǎn)生發(fā)育所需的能量[3,6]。也有研究表明卵丘顆粒細(xì)胞所產(chǎn)生的丙酮酸可為卵母細(xì)胞發(fā)育提供重要的支持[7-8]。因此，兔卵巢顆粒細(xì)胞對(duì)卵母細(xì)胞的成熟及卵泡的正常發(fā)育都有著至關(guān)重要的作用。

在前期研究中，利用含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基進(jìn)行原代兔卵巢顆粒細(xì)胞培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞生長(zhǎng)增殖速度較慢。為優(yōu)化兔卵巢顆粒細(xì)胞體外培養(yǎng)體系，本實(shí)驗(yàn)在體外分離鑒定了兔卵巢顆粒細(xì)胞，并優(yōu)化了培養(yǎng)條件，為卵巢顆粒細(xì)胞在體外調(diào)節(jié)卵母細(xì)胞發(fā)育和代謝等后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 實(shí)驗(yàn)選擇4～6 月齡性成熟新西蘭白兔母兔，由揚(yáng)州市某兔場(chǎng)提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 胎牛血清為Gibco 產(chǎn)品（A31610-01）；DMEM/F-12 基礎(chǔ)培養(yǎng)基為Hyclone 產(chǎn)品（AF29527017）,DMEM 基礎(chǔ)培養(yǎng)基為Hyclone 產(chǎn)品（C11885500BT）；雙抗（青鏈霉素混合液100×）,TritonX-100，4%組織細(xì)胞固定液均為索萊寶公司產(chǎn)品；Anti-FSHR 抗體為Affinity 產(chǎn)品；羊抗兔IgG H&L（FITC）為Abcam 產(chǎn)品。

1.3 兔卵巢顆粒細(xì)胞分離 準(zhǔn)備2 只4～6 月齡的新西蘭白兔母兔，每只肌肉注射孕馬血清促性腺激素（PMSG）80 IU，6 h 后用耳緣靜脈栓塞法處死兔子。為保證卵巢在運(yùn)輸過(guò)程中保持新鮮，將兔子雙側(cè)卵巢放入預(yù)冷的PBS（含1%雙抗，pH 為7.4）中，帶入細(xì)胞間。首先將采集的卵巢組織放置于無(wú)菌培養(yǎng)皿（60×15 mm）中，用PBS 清洗2 遍。將卵巢組織放入加有雙抗（100 IU/mL青霉素和鏈霉素）的DMEM（高糖）培養(yǎng)液的無(wú)菌培養(yǎng)皿中，用1 mL 注射器針頭刺破卵巢表面的卵泡，使卵泡內(nèi)容物釋放于其中。然后用200 目不銹鋼細(xì)胞篩過(guò)濾。收集到的濾液1 000 r/min 離心5 min，棄上清。向沉積在離心管底部的細(xì)胞團(tuán)加入2 mL 紅細(xì)胞裂解液，裂解5 min 后1 000 r/min 離心5 min，棄上清液。向沉積在離心管底部的細(xì)胞團(tuán)加入DMEM（含10%胎牛血清1%雙抗）制成細(xì)胞懸液，細(xì)胞懸液接種到6 孔板中，在5%CO2，37.0℃條件下孵育24 h。

1.4 免疫熒光法鑒定兔卵巢顆粒細(xì)胞 針對(duì)卵泡刺激素受體（Follicle-Stimulating Hormone Receptor，F(xiàn)SHR）在 顆粒細(xì)胞中特異性表達(dá)的特點(diǎn)，采用細(xì)胞免疫熒光法對(duì)體外培養(yǎng)的顆粒細(xì)胞進(jìn)行鑒定。首先吸除培養(yǎng)24 h 后的原代顆粒細(xì)胞舊培養(yǎng)基，用PBS 清洗3 次，每次5 min。4%多聚甲醛固定液室溫固定30 min。PBS 漂洗3 次，每次5 min。0.3% TritionX-100 處理60 min，PBS 洗3次，每次5 min。1% BSA 室溫封閉60 min。吸出封閉液，不洗。吸棄封閉液，加入一抗（anti-FSHR，1:250），4℃孵育過(guò)夜。PBST 漂洗3 次，每次5 min。將1:2000比例稀釋好的FITC 二抗滴加其中，37℃孵育60 min。PBST 漂洗3 次，每次5 min。滴加DAPI，室溫染色10 min 左右。熒光顯微鏡下觀察顯色，拍照保存。

1.5 兔卵巢顆粒細(xì)胞培養(yǎng) DMEM 和DMEM/F-12 培養(yǎng)基都是細(xì)胞培養(yǎng)常用的培養(yǎng)基。前期在原代兔卵巢顆粒細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中首先使用了含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞生長(zhǎng)速度較慢，推測(cè)有可能是因?yàn)檠鍧舛群团囵B(yǎng)基不合適所致。因此，本實(shí)驗(yàn)分別用血清濃度為5%、10%、15% 的DMEM/F-12 培養(yǎng)基培養(yǎng)兔卵巢顆粒細(xì)胞，以期獲得最適合兔卵巢顆粒細(xì)胞生長(zhǎng)的培養(yǎng)基和血清濃度。

1.6 CCK-8 檢測(cè)細(xì)胞增殖狀況 細(xì)胞在24 孔板內(nèi)培養(yǎng)48 h 后，將細(xì)胞分別接種于4 個(gè)96 孔板內(nèi)以檢測(cè)0、24、48、72 h 時(shí)的細(xì)胞增殖狀況。待細(xì)胞貼壁后吸出培養(yǎng)基。由于2 種培養(yǎng)基顏色不同，會(huì)影響吸光值，因此棄掉原培養(yǎng)基后加入100 μL 的DMEM/F-12 培養(yǎng)基，在每孔內(nèi)分別加入10 μL 的CCK-8 溶劑，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育4 h，放入酶標(biāo)儀測(cè)量吸光值A(chǔ)450，記為0 h。以后每24 h 用同樣的方法測(cè)量1 次，共4 次。最后，以吸光值為縱坐標(biāo)、時(shí)間為橫坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析 細(xì)胞增殖的數(shù)據(jù)處理及增殖折線圖的繪制均使用GraphPadPrism8 軟件進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 兔卵巢顆粒細(xì)胞分離與鑒定 如圖1 所示，體外分離培養(yǎng)24 h 后，兔卵巢顆粒細(xì)胞呈單層貼壁性增長(zhǎng)，形態(tài)為不規(guī)則的多邊形。利用卵巢顆粒細(xì)胞特異性蛋白FSHR 進(jìn)行免疫熒光檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)視野中呈現(xiàn)綠色熒光，證實(shí)分離的細(xì)胞為顆粒細(xì)胞（圖2）。

圖1 兔卵巢顆粒細(xì)胞形態(tài)圖

圖2 免疫熒光染色圖

在細(xì)胞鑒定完成后，對(duì)卵巢顆粒細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)，結(jié)果如圖3 所示，可以明顯觀察到顆粒細(xì)胞出現(xiàn)分化。

圖3 第2 代兔卵巢顆粒細(xì)胞形態(tài)圖

2.2 不同濃度血清和培養(yǎng)基對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)的影響 在DMEM 和DMEM/F-12 培養(yǎng)基中分別加入5%、10%、15%的胎牛血清，在卵巢顆粒細(xì)胞接種密度一致的前提下，培養(yǎng)48 h 后細(xì)胞生長(zhǎng)情況如圖4 所示，隨著血清濃度增加2 種不同培養(yǎng)基中細(xì)胞匯合度都在不斷增加，其中在含有15% 血清的DMEM/F-12 條件下培養(yǎng)的細(xì)胞匯合度最高，可達(dá)60%左右。

圖4 不同血清濃度和培養(yǎng)基下細(xì)胞生長(zhǎng)狀況

2.3 不同濃度血清和培養(yǎng)基對(duì)細(xì)胞增殖的影響 如圖5所示，在加入15% 血清的DMEM/F-12 條件下細(xì)胞增殖速度最快。在5%血清條件下，培養(yǎng)72 h 后DMEM/F-12 組細(xì)胞增殖效果高于DMEM 組（P＜0.05）；在10%血清條件下，DMEM/F-12 組細(xì)胞增殖效果在48 h時(shí)高于DMEM 組（P＜0.05），在72 h 時(shí)極顯著高于DMEM 組（P＜0.01）。在3 種不同血清濃度條件下，DMEM/F-12 組細(xì)胞的增殖情況均優(yōu)于DMEM 組。

圖5 不同血清濃度和培養(yǎng)基下細(xì)胞增殖狀況

3 討 論

卵泡顆粒細(xì)胞可分為圍繞卵母細(xì)胞的卵丘細(xì)胞和圍繞卵泡壁的壁顆粒細(xì)胞。其中，壁顆粒細(xì)胞的主要功能是參與細(xì)胞分化和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，卵丘細(xì)胞的主要功能是參與細(xì)胞增殖和代謝[9-10]。排卵后顆粒細(xì)胞會(huì)分化為黃體細(xì)胞，并分泌孕酮來(lái)調(diào)節(jié)卵巢的功能[11]。在體內(nèi)，卵母細(xì)胞在發(fā)育過(guò)程中很難吸收利用氨基酸，只能通過(guò)縫隙連接利用由卵丘細(xì)胞攝取的氨基酸，即顆粒細(xì)胞間接促進(jìn)了卵母細(xì)胞代謝的完成[8]。在體外培養(yǎng)過(guò)程中，一定濃度的顆粒細(xì)胞可以提高受精卵的發(fā)育能力[12]。此外，顆粒細(xì)胞上具有FSH 受體和雌激素受體，分別可以和FSH 與雌激素相結(jié)合產(chǎn)生多種信號(hào)分子，從而促進(jìn)卵母細(xì)胞生長(zhǎng)、顆粒細(xì)胞增殖及卵泡發(fā)育成熟和排卵[9]?？梢姡w粒細(xì)胞既是卵泡的重要組成部分，也是影響卵巢功能的核心單位。

在細(xì)胞培養(yǎng)研究領(lǐng)域，大多數(shù)研究都采用DMEM和DMEM/F-12 兩種基礎(chǔ)培養(yǎng)液[13-17]。血清中含有大量的蛋白質(zhì)、脂肪等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和一些促生長(zhǎng)因子，有研究使用添加10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基對(duì)小鼠顆粒細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，結(jié)果得到的顆粒細(xì)胞純度高、增殖能力強(qiáng)[17]。此外，在豬[14]、牛[15]、鹿[18]卵巢顆粒細(xì)胞細(xì)胞體外培養(yǎng)液中，均有研究者添加了血清且細(xì)胞增殖狀況良好。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中綜合多種因素，首先采用含10%胎牛血清的DMEM/F-12 培養(yǎng)基對(duì)兔顆粒細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，為下一步細(xì)胞鑒定實(shí)驗(yàn)做準(zhǔn)備。FSHR 僅存在于卵巢顆粒細(xì)胞上[19-20]，因此可以通過(guò)測(cè)定FSHR 蛋白的表達(dá)水平來(lái)鑒定兔卵巢顆粒細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)中，兔卵巢顆粒細(xì)胞經(jīng)免疫熒光染色后，其胞質(zhì)呈現(xiàn)綠色熒光，說(shuō)明細(xì)胞上的FSHR 已經(jīng)與FSHR 抗體相結(jié)合了，而被DAPI 染色的細(xì)胞核則呈藍(lán)色。

在體外培養(yǎng)條件下，本實(shí)驗(yàn)中含有15% 血清的DMEM/F-12 條件下細(xì)胞數(shù)量最多，生長(zhǎng)狀況最好。而高亞可[11]研究表明最適合水牛卵巢顆粒細(xì)胞體外培養(yǎng)的條件為含有10%血清的DMEM 培養(yǎng)液，與兔有所不同。這也說(shuō)明了不同動(dòng)物卵巢顆粒細(xì)胞對(duì)培養(yǎng)基的要求有所不同。為了更準(zhǔn)確地探究不同條件下顆粒細(xì)胞的增殖效果，實(shí)驗(yàn)采用CCK-8 法對(duì)細(xì)胞活性進(jìn)行檢測(cè)。其原理是通過(guò)酶標(biāo)儀測(cè)量該細(xì)胞液的吸光度值,便可檢測(cè)出待測(cè)細(xì)胞樣品的活性[21-22]，由此便可知細(xì)胞的增殖狀況。本研究中，DMEM 培養(yǎng)液中的細(xì)胞在任何血清濃度下的增殖效果都優(yōu)于DMEM 中培養(yǎng)的細(xì)胞，并且在10%血清濃度下有極顯著差異；此外，隨著血清濃度增加，OD 值也在不斷增加，并在15%血清濃度下趨于平穩(wěn)。這進(jìn)一步說(shuō)明了含有15% 血清的DMEM/F-12 培養(yǎng)基更適合兔卵巢顆粒細(xì)胞的體外培養(yǎng)。

4 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)條件下，兔卵巢顆粒細(xì)胞可以通過(guò)FSHR 抗體免疫熒光鑒定，兔卵巢顆粒細(xì)胞在含有15% 血清的DMEM/F-12 培養(yǎng)基中生長(zhǎng)狀況優(yōu)于含5%、10% 血清的培養(yǎng)基。