高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同步檢測(cè)飼料中4 種常見(jiàn)霉菌毒素

陳 甫，朱風(fēng)華，韋 寧，王倩文，王雪琪，陳雪曉，李景景，朱連勤

（青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，山東青島 266109）

霉菌毒素是由產(chǎn)毒真菌在適宜的環(huán)境條件下產(chǎn)生的有毒代謝產(chǎn)物，種類繁多，在自然界分布廣泛，超過(guò)300 多種可在糧食生產(chǎn)、加工運(yùn)輸和貯藏等環(huán)節(jié)產(chǎn)生毒素[1-2]。據(jù)聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織資料顯示，全世界每年約有25% 的農(nóng)作物不同程度地受到霉菌毒素污染，失去營(yíng)養(yǎng)和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，造成的損失可達(dá)數(shù)千億美元[3-4]。霉菌毒素可以通過(guò)飼料或食品進(jìn)入食物鏈，損傷肝臟、腎臟和神經(jīng)組織等，導(dǎo)致畜禽生產(chǎn)性能下降、免疫抑制和死亡，嚴(yán)重威脅著畜牧業(yè)生產(chǎn)和畜產(chǎn)品質(zhì)量安全[3-5]。我國(guó)是霉菌毒素污染的重災(zāi)區(qū)，黃曲霉毒素B1（AFB1）、嘔吐毒素（DON）、伏馬毒素B1（FB1）和玉米赤霉烯酮（ZEN）等多種霉菌毒素的污染尤為嚴(yán)重[3,6-8]。嚴(yán)格控制霉菌毒素對(duì)糧食及其加工產(chǎn)品的污染是保障人類和動(dòng)物健康的必然要求，而檢測(cè)和調(diào)查飼料中霉菌毒素的污染是防控霉菌毒素危害的重要手段之一?，F(xiàn)今，霉菌毒素的檢測(cè)方法主要有液相色譜法、熒光光度法、酶聯(lián)免疫吸附法、薄層色譜法和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLC-MS）等[9-12]。與其他方法比，HPLC-MS 法不需要用免疫親和柱等凈化柱進(jìn)行固相萃取，進(jìn)行多個(gè)樣品檢測(cè)時(shí)具有精確度高、簡(jiǎn)便、快速、成本較低等優(yōu)勢(shì)，可同時(shí)測(cè)定樣品中的多種霉菌毒素[9-12]。而利用HPLCMS法同時(shí)檢測(cè)飼料中AFB1、FB1、ZEN 和DON 等主要霉菌毒素的研究報(bào)道較少[8]。因此，本研究在探索毒素提取方法的基礎(chǔ)上，建立了能同時(shí)測(cè)定飼料中AFB1、FB1、ZEN 和DON 等4 種毒素的HPLC-MS 法，以期為飼料中霉菌毒素的檢測(cè)、污染調(diào)查及風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 樣品采集 本試驗(yàn)所用樣品采集自山東部分地區(qū)不同廠家生產(chǎn)的飼料，采樣方法按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)（GB/T 14699.1-2005）進(jìn)行，共采集濰坊、青島、煙臺(tái)三地飼料廠肉雞配合飼料20 份和玉米34 份。樣品處理前-20.0℃保存，處理時(shí)從冰箱取出，恢復(fù)至常溫，混勻后應(yīng)用粉碎機(jī)碎粉，過(guò)40 目篩，備用。

1.2 主要儀器與試劑 高效液相色譜串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜儀（1290 Infinity/6460 HPLC-MS，Agilent 公司）、粉碎機(jī)（HC-400Y，永康市石柱鉑歐五金廠）、分析天平（JA2003A，上海精天電子儀器有限公司）、漩渦混勻器（MX-S/F，大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器（北京）股份公司），C8 柱：150.0 mm×3.0 mm，粒徑 3.0 μm。AFB1、FB1、ZEN 和DON 毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液和ELISA 檢測(cè)試劑盒（青島普瑞邦生物工程有限公司）；乙腈（色譜純，德國(guó)默克）、純甲醇（色譜純，德國(guó)默克）、甲酸（色譜純，美國(guó)FISHER），醋酸銨（色譜純，ACS 恩科）。

1.3 高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（HPLC-MS）法

1.3.1 樣品處理?xiàng)l件優(yōu)化 稱取樣品5.0 g，加入50 mL 離心管中，加入提取液25 mL 進(jìn)行提取，渦旋混勻2 min，置氣浴搖床中提取1 h；取出樣品，定量濾紙過(guò)濾，濾液經(jīng)0.22 μm 有機(jī)濾膜過(guò)濾，待測(cè)。

1.3.1.1 提取液的篩選 稱取同一樣品25 份，每份5.0 g，分為5 組，每組5 個(gè)重復(fù)。每組分別加入以下5 種提取液（表1）：84%乙腈:水、50%乙腈:水、75%甲醇:水、50%甲醇:水、水25 mL 進(jìn)行提取，按照上述處理后待測(cè)。

表1 5 種毒素提取液配比

1.3.1.2 氮吹干試驗(yàn) 稱取同一樣品10 份，隨機(jī)分為2 組，每組5 個(gè)重復(fù)。每個(gè)重復(fù)加入乙腈:水（84:16，V/V）25 mL 進(jìn)行提取，按照上述處理后得濾液。一組取濾液經(jīng)0.22 μm 濾膜過(guò)濾直接檢測(cè)，另一組在50℃下氮吹干，殘留物加1.0 mL 乙腈:水溶液，0.22 μm 濾膜過(guò)濾，待測(cè)。

1.3.2 液質(zhì)條件 以各毒素標(biāo)準(zhǔn)品為檢測(cè)對(duì)象，在正負(fù)離子模式下進(jìn)行全掃描，形成掃描檢測(cè)圖，以選擇合適的準(zhǔn)分子離子峰和電離方式，確定每種毒素的掃描模式。依據(jù)基質(zhì)空白同基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液的離子掃描圖，優(yōu)化錐孔電壓、碰撞能量等儀器的參數(shù)，把每個(gè)檢測(cè)離子的強(qiáng)度調(diào)節(jié)到最高，尋找各毒素在多反應(yīng)檢測(cè)模式下相應(yīng)的特征離子對(duì)，確定最佳質(zhì)譜條件。

1.3.2.1 洗脫條件 C8 色譜柱柱溫25～33℃，進(jìn)樣量20.0 μL，流動(dòng)相為1.0%甲酸醋酸銨溶液，梯度洗脫流速條件見(jiàn)表2。

表2 ESI 源梯度洗脫條件

1.3.2.2 質(zhì)譜條件 離子源為電噴霧離子源，掃描方式為正負(fù)離子掃描，檢測(cè)方式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)。質(zhì)譜測(cè)定參數(shù)見(jiàn)表3。

表3 質(zhì)譜測(cè)定參數(shù)

1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 將不同濃度的毒素梯度標(biāo)準(zhǔn)樣品分別進(jìn)行測(cè)定，以峰面積（x）為橫坐標(biāo)，毒素濃度（Y，μg/L）為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，計(jì)算線性范圍、系數(shù)（R2）、線性回歸方程。

1.5 加樣回收率和精密度試驗(yàn) 取配合飼料、玉米各12份，共計(jì)24 份，每份5.0 g。每類樣品12 份分別加入3 個(gè)濃度水平（50、100、500 μg/kg）的AFB1、FB1、ZEN 和DON，按照1.3 進(jìn)行樣品處理和毒素檢測(cè)，平行測(cè)定6 次，觀察方法的精密度和回收率。

1.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取一份配合飼料和玉米樣品，按照樣品制備方法平行制備8 次，分別測(cè)定AFB1、FB1、ZEN和DON 含量，計(jì)算各毒素的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）值。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析 應(yīng)用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)提取液、氮吹干試驗(yàn)毒素檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析，并應(yīng)用Duncan's 多重比較進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，試驗(yàn)數(shù)據(jù)用（平均值± 標(biāo)準(zhǔn)差）表示，差異顯著水平為P＜0.05?；厥章?、精密度和重復(fù)性試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果用平均值表示，計(jì)算RSD 值，判定回收率、精密度和重復(fù)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜定性定量分析結(jié)果 分別在正離子和負(fù)離子模式下對(duì)4 種霉菌毒素的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行全掃描，發(fā)現(xiàn)DON、FB1和AFB1在正離子模式下響應(yīng)高，ZEN 在負(fù)離子模式下響應(yīng)高。對(duì)4 種毒素的標(biāo)準(zhǔn)溶液在正負(fù)離子模式下進(jìn)行全掃描，AFB1、DON、FB1和ZEN 分別得到313.1、722.4、297.2 和 317.0 準(zhǔn)分子離子峰。將不同毒素對(duì)應(yīng)的峰分別進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜全掃描。AFB1、FB1、DON 在正離子模式下形成的定量離子對(duì)為313.1、297.2 和722.4，ZEN 在負(fù)離子模式下形成的定量離子對(duì)為 317.0，AFB1、DON 和FB1在正離子模式下形成的定性離子對(duì)為241.0、334.1、265.1 和ZEN 在負(fù)離子模式下形成的定性離子為175.1。應(yīng)用HPLC-MS 法檢測(cè)4 種霉菌毒素色譜圖發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)B1在2.8～3 min 出峰，AFB1在3.8～4 min 出峰，DON 在4.7～4.9 min 出峰，ZEN在5.1～5.3 min 出峰。

2.2 樣品前處理?xiàng)l件結(jié)果

2.2.1 不同提取液對(duì)毒素檢測(cè)結(jié)果的影響 如圖1 所示，應(yīng)用不同的提取液對(duì)同一樣品中的4 種霉菌毒素提取檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用84%乙腈水、75%甲醇水和50%甲醇水提取FB1優(yōu)于50%乙腈水和水，應(yīng)用84%乙腈水提取AFB1優(yōu)于其他4 種提取液，應(yīng)用84%乙腈水和50%乙腈水提取DON 優(yōu)于其他3 種提取液，應(yīng)用84%乙腈水和水提取ZEN 優(yōu)于其他3 種提取液。綜上所述，選取84%乙腈水作為AFB1、FB1、ZEN 和DON 的提取液。

圖1 5 種提取液對(duì)4 種霉菌毒素提取效果的比較

2.2.2 氮吹干對(duì)毒素檢測(cè)結(jié)果的影響 由圖2 所示，樣品經(jīng)氮?dú)獯蹈蓾饪s5 倍后，AFB1、FB1、ZEN 和DON濃度均較未濃縮時(shí)的毒素濃度顯著下降。這說(shuō)明毒素在氮?dú)獯蹈傻倪^(guò)程中可能會(huì)因揮發(fā)導(dǎo)致回收率下降，檢測(cè)值降低。若檢測(cè)過(guò)程需要濃縮，建議降低氮?dú)獯蹈傻臏囟然蚣尤氡Ｗo(hù)劑。

圖2 氮吹干對(duì)4 種毒素檢測(cè)結(jié)果的影響

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線與檢出限結(jié)果 將毒素標(biāo)準(zhǔn)樣品根據(jù)配合飼料和原料中的毒素含量倍比稀釋，AFB1、FB1、ZEN、DON 濃度分別在0.01～1 000 μg/kg、10～2 000、0.1～2000、10～100 000 μg/kg 時(shí)，峰面積和毒素濃度呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2值均在0.99 以上，如圖3 所示。另外，本方法AFB1、FB1、ZEN 和DON的檢出限分別為0.005、10、10、0.1 μg/kg，定量限分別為0.01、10、1.0 μg/kg 和1.0 μg/kg，說(shuō)明同時(shí)檢測(cè)DON、AFB1、FB1和ZEN 的HPLC-MS 法靈敏度高。

圖3 HPLC-MS 法檢測(cè)AFB1、FB1、ZEN 和DON 毒素的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4 回收率和精密度結(jié)果 由表4 可知，DON、AFB1、FB1和ZEN 檢測(cè)回收率分別為95.93%～100.29%、95.12%～106.04%、99.83%～103.28%、98.73%～100.73%，RSD值分別為0.18%～1.58%、3.20%～3.61%、0.32%～1.70%、0.95%～0.98%。說(shuō)明同時(shí)檢測(cè)DON、AFB1、FB1和ZEN 的HPLC-MS 法回收率高，精密度好。

表4 不同毒素在基質(zhì)中的加樣回收率和精密度

2.5 重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果 配合飼料和玉米樣品平行8 次檢測(cè)，計(jì)算得出AFB1、DON、FB1和ZEN 的RSD 值為0.26%、0.08%、3.52% 和0.20%。說(shuō)明本方法檢測(cè)AFB1、DON、FB1和ZEN 重復(fù)性良好。

3 討 論

3.1 樣品前處理?xiàng)l件優(yōu)化 毒素的提取處理對(duì)檢測(cè)方法的準(zhǔn)確性至關(guān)重要，而不同毒素在水和有機(jī)溶劑中的溶解度不同，提取率也不相同。因此，選擇提取率高的毒素提取液能同時(shí)提取多種霉菌毒素至關(guān)重要。本研究利用5 種提取液對(duì)4 種毒素進(jìn)行提取，結(jié)果發(fā)現(xiàn)84% 乙腈水提取AFB1、FB1、ZEN 和DON 的效果優(yōu)于其他4種提取液。這與朱聰英等[13]研究結(jié)果相同。趙健等[14]和辛媛媛等[15]研究發(fā)現(xiàn)，乙腈-水-甲酸混合液提取大米和玉米中的真菌毒素效果好，回收率高。趙健等[14]研究發(fā)現(xiàn)，乙腈-水-甲酸混合液提取小麥中的真菌毒素效果好，回收率高。本研究沒(méi)有在提取液中加入甲酸，需要在以后的實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步研究。另外，為提高毒素檢測(cè)的精確度，多項(xiàng)研究均在毒素提取后對(duì)提取液進(jìn)行了濃縮，而未對(duì)氮吹干技術(shù)進(jìn)行驗(yàn)證。本研究經(jīng)過(guò)對(duì)氮吹干技術(shù)探索，發(fā)現(xiàn)經(jīng)氮吹干濃縮提取液后4 種毒素的濃度均較未濃縮時(shí)的毒素濃度顯著下降。溶劑和溫度均能對(duì)毒素濃度產(chǎn)生影響，毒素在氮?dú)獯蹈傻倪^(guò)程中可能會(huì)因溫度高和揮發(fā)導(dǎo)致回收率下降，檢測(cè)值降低[16]。若檢測(cè)過(guò)程需要濃縮，建議降低氮?dú)獯蹈傻臏囟然蚣尤氡Ｗo(hù)劑。因此，檢測(cè)樣品中毒素進(jìn)行提取后，為提高毒素檢測(cè)精度，應(yīng)對(duì)氮吹干技術(shù)對(duì)毒素檢測(cè)效果的影響進(jìn)行評(píng)測(cè)。

3.2 液質(zhì)條件的優(yōu)化 液質(zhì)條件是決定HPLC-MS 法分離目標(biāo)化合物與檢測(cè)成功的關(guān)鍵，目標(biāo)化合物在液相色譜柱中的分離是粗分離，進(jìn)入質(zhì)譜后，由一級(jí)質(zhì)譜選擇母離子，將其打碎，再由二級(jí)質(zhì)譜選擇碎片離子，從而進(jìn)行定性定量。通過(guò)正離子模式和負(fù)離子模式的全掃描可選擇合適的準(zhǔn)分子離子峰和電離方式。霉菌毒素的極性較弱，通過(guò)HPLC-MS 法在正離子和負(fù)離子模式下進(jìn)行全掃描，AFB1、FB1、DON 在正離子模式下形成定量離子，ZEN 在負(fù)離子模式下形成的定量離子對(duì)。通過(guò)色譜圖發(fā)現(xiàn)色譜峰保留時(shí)間適中，峰形較好，說(shuō)明色譜峰響應(yīng)較好。這些結(jié)果與應(yīng)永飛等[17]和鄭榮等[10]的研究結(jié)果相似，是檢測(cè)此4 種毒素較好的液質(zhì)條件。

3.3 方法可行性分析 方法驗(yàn)證在分析方法建立過(guò)程中具有重要的作用，并已成為質(zhì)量研究和質(zhì)量控制的重要組成部分，其中，線性、回收率、精密度和重復(fù)性試驗(yàn)等是評(píng)價(jià)分析檢測(cè)方法確實(shí)可行的主要檢驗(yàn)項(xiàng)目和驗(yàn)證指標(biāo)。本研究發(fā)現(xiàn)，HPLC-MS 法檢測(cè)飼料中AFB1、FB1、ZEN 和DON 的峰面積和毒素濃度呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系，檢出限和定量限均較低，回收率和精密度高，重復(fù)性良好。通過(guò)前期的調(diào)查應(yīng)用，確定了HPLC-MS 法能同檢測(cè)多種飼料中的AFB1、FB1、ZEN和DON[8]。這些結(jié)果進(jìn)一步說(shuō)明HPLC-MS 法檢測(cè)霉菌毒素確實(shí)可行，而且具有簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確度高和靈敏度好的優(yōu)點(diǎn)[18-20]。

4 結(jié) 論

本研究建立同時(shí)檢測(cè)飼料中4 種霉菌毒素的HPLC-MS 法，經(jīng)線性、精確度、精密度和重復(fù)性試驗(yàn)，確認(rèn)本方法簡(jiǎn)單、快速、線性良好、精密度高、重現(xiàn)性好，適用于飼料中霉菌毒素的定量定性檢測(cè)。