蒙藥嘎日西散質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

特格喜白音 敖登其木格 田吉 王海榮

摘要 目的：建立蒙藥嘎日西散的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。方法：采用顯微鑒別法對(duì)制劑中大黃、訶子、土木香、黑冰片、豆蔻、蓽茇、山柰、石榴8味藥材進(jìn)行定性鑒別，選取薄層色譜法對(duì)制劑中蓽茇、大黃及連翹3味藥材進(jìn)行定性鑒別，采用理化鑒別法對(duì)制劑中面堿進(jìn)行定性鑒別，采用高效液相色譜法測(cè)定蒙藥嘎日西散中游離大黃酚含量。結(jié)果：顯微鑒別特征明顯;薄層鑒別的色譜斑點(diǎn)清晰，陰性對(duì)照無干擾，專屬性強(qiáng)。高效液相色譜法大黃酚進(jìn)樣量在47.45～1 898 ng范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，r=1，平均回收率為97.08%，RSD為1.12%（n=6）。結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)建立的分析方法準(zhǔn)確、穩(wěn)定、重復(fù)性好，適用于蒙藥嘎日西散的質(zhì)量控制。

關(guān)鍵詞 嘎日西散;顯微鑒別法;薄層色譜法;高效液相色譜法;大黃酚;含量測(cè)定;質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

Abstract Objective：To establish quality standards for Garixi Powder.Methods：Microscopic identification was used for qualitative determination of rhubarb，fructus chebulae，elecampane inula root，black borneol，fructus amomi rotundus，piperis longi，rhizoma kaempferiae and punica granatum.Thin layer chromatography was applied for qualitative determination of piperis longi，rhubarb，and fructus forsythiae.Physical and chemical identification was used for qualitative determination of sodium carbonate decahydrate.High performance liquid chromatography was used for quantitative determination of free chrysophanol in thepowder.Results：The microscopic determination features were obvious and exclusive.TLC chromatographic spots were clear，and there was no interference for negative samples.A good linearity of chrysophanol was shown in range of 47.45～189 8 ng（r=1） with high performance liquid chromatography.The average recovery of chrysophanol was 97.08%，and the RSD was 1.12%（n=6）.Conclusion：The methods in this research are simple，sensitive，accurate，and with good reproducibility.It can be used for quality control of Garixi Powder.

Keywords Garixi Powder; Microscopic identification; Thin layer chromatography; High performance liquid chromatography; Chrysophanol; Content determination; Quality standard

中圖分類號(hào)：R29;R289.5文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.19.011

蒙藥嘎日西是由寒水石、訶子、大黃、山柰、面堿、黑冰片、牛膽膏粉、蓽茇、石榴、豆蔻、連翹等15味藥組成的蒙藥復(fù)方制劑。本驗(yàn)方“嘎日西”由《至高藥方》中具有祛寒性“協(xié)日”、消積功效的哈日嘠布日十味散和《蒙藥秘訣方?！分芯哂邢[理氣的阿木日六味散組成[1]。主治反流性胃炎、胃痛胃酸、脘腹脹痛、噯氣吞酸、大便秘結(jié)，經(jīng)過近20年的臨床應(yīng)用，效果良好[2]。該藥方具有祛寒性“協(xié)日”“胃寶日”，消腫理氣，消積通便作用，為蒙醫(yī)常用制劑之一，臨床使用廣泛，療效可靠。為控制其質(zhì)量，保證臨床療效，對(duì)該蒙藥復(fù)方制劑進(jìn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究，本研究采用顯微鑒別法、薄層色譜法（TLC）及理化鑒別法對(duì)處方中大黃、訶子、蓽茇和土木香等主要藥物進(jìn)行定性鑒別，選用高效液相色譜法（HPLC）對(duì)處方君藥大黃的主要有效成分大黃酚進(jìn)行定量分析，從而為建立其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供有效依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 高效液相色譜儀（賽默飛世爾科技，美國(guó)，型號(hào)：Ultimate3000）;熒光顯微鏡（尼康株式會(huì)社，日本，型號(hào)：Ti-U）;超聲波清洗機(jī)（昆山超聲儀器有限公司，型號(hào)：KQ-500DE）;暗箱式紫外分析儀（上海嘉鵬科技有限公司，型號(hào)：ZF-7）;電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司，德國(guó)，型號(hào)：BT25S）。

1.2 試劑 大黃對(duì)照藥材（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：120984-201202），蓽茇對(duì)照藥材（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：121023-201103），連翹對(duì)照藥材（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：120908-201216），大黃酚對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：110796-201621），硅膠G薄層板、硅膠GF254薄層板（青島海洋化工廠，批號(hào)：071713），其他試劑均為分析純，水為超純水。

1.3 分析樣品 嘎日西散（內(nèi)蒙古自治區(qū)國(guó)際蒙醫(yī)醫(yī)院，批號(hào)：20150111、20160206、20161106）。

2 方法與結(jié)果

2.1 顯微鑒別 取嘎日西散粉末，用水合氯醛裝片，顯微觀察[3]，大黃草酸鈣簇晶棱角大多短鈍;訶子石細(xì)胞類圓形、卵圓形，孔溝明顯，具層紋;土木香菊糖無色，呈扇形或不規(guī)則碎塊狀;黑冰片碎片黑色、呈不規(guī)則碎塊狀;豆蔻內(nèi)種皮細(xì)胞紅棕色，細(xì)胞系小，呈多角形;蓽茇外胚乳細(xì)胞呈亮黃色，細(xì)胞內(nèi)充滿淀粉粒;山柰淀粉粒眾多，主為單粒，圓形，橢圓形或類三角形，多數(shù)扁平，直徑5～30 μm，臍點(diǎn)、層紋均不明顯。石榴石細(xì)胞無色，橢圓形或類圓形，壁厚，溝孔細(xì)密。見圖1。

2.2 TLC鑒別

2.2.1 蓽茇的TLC鑒別 1）取不同批號(hào)的嘎日西散各2 g，分別加無水乙醇7.5 mL，超聲處理30 min，濾過，濾液濃縮至約1 mL，作為供試品溶液。2）按處方比例和制備工藝制成陰性樣品（缺蓽茇）和模擬樣品，同供試品溶液制法相同，制得陰性樣品溶液和模擬樣品溶液。3）取蓽茇對(duì)照藥材0.5 g，加無水乙醇5 mL，超聲處理30 min，濾過，濾液蒸干，加1 mL無水乙醇溶解制得對(duì)照藥材溶液。參照薄層色譜法實(shí)驗(yàn)[3]，在同一硅膠G薄層板上，分別吸取上述4種溶液各10 μL，點(diǎn)樣，展開劑選取甲苯-乙酸乙酯-丙酮（7∶2∶1），展開晾干后，置紫外光燈（365 nm）下檢視。在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)位置（Rf值0.57），供試品和模擬樣品色譜顯現(xiàn)顏色相同的斑點(diǎn)，陰性無干擾。見圖2。

2.2.2 大黃的TLC鑒別 1）取不同批號(hào)的嘎日西散各1.5 g，分別加甲醇6 mL，超聲處理10 min，濾過，濾液作為供試品溶液。2）按處方比例和制備工藝制成陰性樣品（缺大黃）和模擬樣品，同供試品溶液制法相同，制得陰性樣品溶液和模擬樣品溶液。3）稱取0.3 g的大黃對(duì)照藥材粉末，加入3 mL甲醇，超聲處理10 min后過濾，濾液作為對(duì)照藥材溶液[4-8]。參照薄層色譜法實(shí)驗(yàn)[3]，在同一硅膠GF254薄層板上，分別吸取上述4種溶液各10 μL，點(diǎn)樣，展開劑選取環(huán)己烷-乙酸乙酯-甲酸（12∶3∶0.1），展開晾干后，置紫外光燈（365 nm）下檢視。在與對(duì)照藥材色譜相對(duì)應(yīng)的位置，供試品和模擬樣品色譜顯現(xiàn)顏色相同的5個(gè)斑點(diǎn)（Rf值分別為0.79，0.64，0.39，0.24，0.21），陰性對(duì)照色譜相應(yīng)的位置上無斑點(diǎn)。見圖3。

2.2.3 連翹的TLC鑒別 1）取不同批號(hào)的嘎日西散各0.5 g，分別加石油醚（30～60 ℃）20 mL并密塞，超聲處理15 min，濾過，棄去石油醚液，殘?jiān)鼡]干石油醚，加甲醇5 mL，密塞，超聲處理20 min，濾過，濾液作為供試品溶液。2）按處方比例和制備工藝制成陰性樣品（缺連翹）和模擬樣品，同供試品溶液制法相同，制得陰性樣品溶液和模擬樣品溶液。3）取連翹對(duì)照藥材0.2 g，同上述方法1）制得對(duì)照藥材溶液。參照薄層色譜法實(shí)驗(yàn)[3]，在同一硅膠G薄層板上，分別吸取上述4種溶液各10 μL，點(diǎn)樣，展開劑選取三氯甲烷-甲醇（8∶1），展開，取出薄層板晾干，向板上噴灑10%硫酸乙醇溶液，在烘箱中105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯現(xiàn)清晰的顏色。在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)位置（Rf值0.35），供試品和模擬樣品色譜顯現(xiàn)顏色相同的斑點(diǎn)，陰性無干擾。見圖4。

2.3 面堿的理化鑒別 取嘎日西散0.5 g，加稀鹽酸10 mL，有氣泡產(chǎn)生。見圖5。稱取本品處方工藝制備不含面堿的陰性樣品0.5 g，加稀鹽酸10 mL，無氣泡產(chǎn)生。表明處方中其他組分對(duì)面堿鑒別無干擾，具專屬性。

2.4 大黃酚的含量測(cè)定

2.4.1 色譜條件 色譜柱為C18柱（Thermo scientific，250 mm×4.6 mm，5 μm）;以乙腈-甲醇-0.1%磷酸溶液為流動(dòng)相，按42∶23∶35的比例等度洗脫;進(jìn)樣量為10 μL;體積流量：1.0 mL/min;柱溫：25 ℃;檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm。在上述條件下，理論板數(shù)以大黃酚峰計(jì)不少于1 500，分離度>1.5。

2.4.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取9.49 mg大黃酚對(duì)照品，加入100 mL甲醇制成1 mL含0.094 9 mg大黃酚的溶液。

2.4.3 供試品溶液的制備 精密稱取3 g嘎日西散，精密加入25 mL甲醇，超聲處理（功率200 W，頻率40 kHz）45 min，放冷，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.4.4 陰性對(duì)照溶液的制備 取大黃陰性樣品，同供試品溶液制備方法，制得缺大黃的陰性對(duì)照溶液。

2.4.5 專屬性試驗(yàn) 按色譜條件測(cè)定大黃陰性對(duì)照溶液、供試品溶液、大黃酚對(duì)照品溶液，結(jié)果可見，在與對(duì)照品色譜中大黃酚峰對(duì)應(yīng)的位置上，供試品色譜圖檢出色譜峰，而陰性樣品在相應(yīng)的位置上無相應(yīng)峰出現(xiàn)，說明方中其他藥味對(duì)大黃酚的測(cè)定無干擾[9-11]。見圖6。

2.4.6 線性關(guān)系考察 取大黃酚對(duì)照品溶液（0.094 9 mg/mL），分別進(jìn)樣0.5 μL、1.0 μL、2.0 μL、5.0 μL、10.0 μL、20.0 μL，在色譜條件下進(jìn)行檢測(cè)，記錄色譜峰的峰面積。以橫坐標(biāo)為大黃酚進(jìn)樣量（ng），縱坐標(biāo)為不同進(jìn)樣體積所對(duì)應(yīng)的色譜峰峰面積繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到大黃酚進(jìn)樣量在47.45～1 898 ng范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好，回歸方程為：y=0.088 1x+0.166 1，r=1。

2.4.7 精密度試驗(yàn) 取大黃酚對(duì)照品溶液（0.094 9 mg/mL），在上述色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄每次所測(cè)的色譜峰面積[12]。大黃酚色譜峰面積的RSD（n=6）為0.62%，儀器精密度良好。

2.4.8 供試品溶液穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，按色譜條件進(jìn)樣，分別于0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h測(cè)定，以大黃酚峰面積計(jì)算，其峰面積的RSD值為0.09%，室溫條件12 h內(nèi)，樣品穩(wěn)定性良好[8，13]。

2.4.9 重復(fù)性試驗(yàn) 取批號(hào)的20161106的嘎日西散，按供試品溶液制備法[14]，平行處理6份，按色譜條件測(cè)定嘎日西散中游離大黃酚的含量，得含量均值為0.296 3 mg/g，RSD為0.55%（n=6）。見表1。

2.4.10 回收率試驗(yàn) 分別精密稱取已知游離大黃酚含量（0.296 3 mg/g）的樣品1.5 g，各6份，置具塞錐形瓶中，分別精密加入濃度為0.094 9 mg/mL的大黃酚對(duì)照品溶液5 mL（約相當(dāng)于供試品含有量的50%），加20 mL甲醇，按供試品溶液制備方法制備和色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)，計(jì)算加樣回收率和RSD值[15-17]。6次加樣回收率平均值為97.08%，RSD為1.12%。見表2。

2.4.11 樣品測(cè)定結(jié)果 取不同批次樣品，按上述供試品溶液的制備方法和測(cè)定條件，測(cè)定了3批嘎日西散中游離大黃酚含量[18-19]，每批平行測(cè)3份，樣品中游離大黃酚含量測(cè)定見結(jié)果表3。20161106批次樣品平均含量為0.294 9 mg/g，20160206批次樣品平均含量為0.452 8 mg/g，20150111批次樣品平均含量為0.476 5 mg/g。

3 討論

本研究中蓽茇和連翹的TLC鑒別分別參考了《中華人民共和國(guó)藥典》（2015年版一部）》中的“蓽茇”和“連翹”鑒別項(xiàng)下分析方法進(jìn)行薄層展開，結(jié)果所得薄層色譜斑點(diǎn)清晰，專屬性強(qiáng)，方法簡(jiǎn)便可行。在大黃TLC預(yù)實(shí)驗(yàn)中，首先參照藥典中“大黃”鑒別項(xiàng)下分析方法[3]，制備供試品溶液時(shí)，取嘎日西散粉末，用甲醇浸泡1 h，濾過，濾液蒸干后加適量超純水溶解后加鹽酸加熱回流，冷卻后，乙醚振搖提取2次，蒸干后加入三氯甲烷復(fù)溶制得。選取羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠H薄層板，展開劑為石油醚（30～60 ℃）-甲酸乙酯-甲酸（15∶5∶1）的上層溶液，進(jìn)行薄層色譜分析。試驗(yàn)結(jié)果中，色譜斑點(diǎn)不清晰，專屬性較差。本研究大黃TLC鑒別實(shí)驗(yàn)中，供試品直接加甲醇超聲，過濾，濾液點(diǎn)樣。展開劑選為環(huán)己烷-乙酸乙酯-甲酸（12∶3∶0.1），薄層板選為硅膠GF254薄層板時(shí)，TLC能達(dá)到良好的分離、斑點(diǎn)清晰、重復(fù)性好、陰性對(duì)照無干擾。該方法供試品溶液制備方法簡(jiǎn)單，使用的硅膠GF254薄層板為常用薄層板，易得，結(jié)果所得色譜斑點(diǎn)清晰，分離較好。

結(jié)合三批樣品的實(shí)測(cè)結(jié)果，本品每1 g含大黃以游離大黃酚（C15H10O4）計(jì)，均大于0.29 mg，結(jié)果暫定以最低含量的80%作為限度，故暫定本品每1 g含大黃以游離大黃酚（C15H10O4）計(jì)，不得少于0.23 mg。

嘎日西散中大黃為處方的君藥，具有清熱、解毒作用。蒽醌類化合物是大黃的主要有效成分。本研究中含量測(cè)定首先參考藥典“大黃”項(xiàng)下含量測(cè)定方法，流動(dòng)相采用甲醇-0.1%磷酸溶液（85∶15）。但因嘎日西散復(fù)方制劑的成分多而復(fù)雜，用此流動(dòng)相時(shí)，大黃酚色譜峰未能與其他干擾峰得到很好的分離。經(jīng)過色譜條件探索，將流動(dòng)相成分和比例調(diào)整成乙腈-甲醇-0.1%磷酸溶液（42∶23∶35）時(shí)，待測(cè)物峰分離良好。在定量分析過程中，首先測(cè)定制劑中總大黃素、總大黃酚、游離大黃素、游離大黃酚，但在多次測(cè)定后發(fā)現(xiàn)，總大黃素、總大黃酚、游離大黃素測(cè)定方法準(zhǔn)確度的回收率均低于50%，因此，本研究最終選用游離大黃酚含量為蒙藥嘎日西散質(zhì)量控制指標(biāo)。綜上所述，本研究所建標(biāo)準(zhǔn)可用于蒙藥嘎日西散的質(zhì)量控制。

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（2020-02-27收稿 責(zé)任編輯：楊覺雄）