鹿血晶通過(guò)降低腎小管上皮細(xì)胞的5-羥色胺合成及降解抑制順鉑誘導(dǎo)的腎損傷

張 怡，關(guān) 晶，徐 凡，梁秀睿，張譽(yù)馨，金佳琦，傅繼華

? 藥理與臨床 ?

鹿血晶通過(guò)降低腎小管上皮細(xì)胞的5-羥色胺合成及降解抑制順鉑誘導(dǎo)的腎損傷

張 怡，關(guān) 晶，徐 凡，梁秀睿，張譽(yù)馨，金佳琦，傅繼華*

中國(guó)藥科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床藥學(xué)學(xué)院，江蘇 南京 210009

探討鹿血晶保護(hù)腎臟以及抑制順鉑誘導(dǎo)腎損傷的作用機(jī)制。人腎小管上皮HK-2細(xì)胞設(shè)對(duì)照組、模型組及鹿血晶（160、400、1000 μg/mL）組和單胺氧化酶A（monoamine oxidase A，MAO-A）抑制劑氯吉蘭（15 μmol/L）組，加入藥物預(yù)處理1 h后加入順鉑（20 μmol/L）刺激24 h誘導(dǎo)細(xì)胞損傷。雄性ICR小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組及鹿血晶（0.78 g/kg）組，鹿血晶組預(yù)給藥7 d，然后模型組及鹿血晶組ip順鉑（25 mg/kg）誘導(dǎo)腎損傷，繼續(xù)治療3 d后處死動(dòng)物。檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)丙二醛（malondialdehyde，MDA）、還原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）、三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）水平、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性、上清液中腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）水平，以及細(xì)胞及小鼠腎組織活性氧（reactive oxygen species，ROS）、5-羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）水平；采用熒光探針DCFH-DA、Mito-Tracker Red CMXRos及熒光染料Hoechst 33342分別檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS含量、定位及細(xì)胞凋亡情況；Western blotting法檢測(cè)細(xì)胞B淋巴細(xì)胞瘤-2（B cell lymphoma-2，Bcl-2）、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bcl-2 associated X，Bax）、半胱氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）、Caspase-9、NADH脫氫酶1（NADH dehydrogenase 1，ND1）、細(xì)胞色素B（cytochrome b，CYTB）、ATP合成酶亞單位6（ATP synthase 6，ATP6）、核因子-κB p65（nuclear factor kappa-B，NF-κB p65）、磷酸化NF-κB p65（phosphorylated NF-κB p65，p-NF-κB p65）、抑制子κBα（inhibitor of NF-κB，IκBα）、p-IκBα蛋白表達(dá)，細(xì)胞及小鼠腎組織色氨酸羥化酶1（tryptophan hydroxylase，Tph1）、芳香簇氨基酸脫羧酶（aromatic amino acid decarboxylase，AADC）、5-HT2A受體（5-HT2Areceptors，5-HT2AR）、MAO-A蛋白表達(dá)；采用蘇木素-伊紅（HE）染色檢測(cè)小鼠腎組織病理?yè)p傷；采用免疫組化法檢測(cè)小鼠腎組織Tph1、AADC、5-HT2AR、MAO-A表達(dá)。與模型組比較，鹿血晶可抑制HK-2細(xì)胞內(nèi)ROS、MDA及上清液中TNF-α、IL-1β水平（＜0.05、0.01），降低細(xì)胞內(nèi)GSH、SOD水平（＜0.05、0.01），抑制細(xì)胞凋亡。鹿血晶（1000 μg/mL）組與氯吉蘭組的作用效果接近，兩組對(duì)順鉑誘導(dǎo)NF-κB p65磷酸化、細(xì)胞凋亡激活（Bax、Caspase-3、Caspase-9表達(dá)上調(diào)及Bcl-2表達(dá)下調(diào)）、呼吸鏈功能下降（ND1、CYTB、ATP6表達(dá)下調(diào)及ATP水平降低）的逆轉(zhuǎn)作用也接近。并且，鹿血晶（1000 μg/mL）組可明顯抑制順鉑誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞Tph1、AADC、5-HT2AR、MAO-A表達(dá)上調(diào)以及5-HT含量升高（＜0.05、0.01），而氯吉蘭組使5-HT水平進(jìn)一步升高（＜0.01）。熒光探針檢測(cè)表明，線粒體是順鉑刺激時(shí)HK-2細(xì)胞產(chǎn)生ROS的部位，且鹿血晶（1000 μg/mL）組和氯吉蘭組對(duì)其有相似的抑制效果。HE染色顯示，順鉑致小鼠腎組織損傷的部位主要在近端腎小管上皮細(xì)胞，免疫組化顯示該部位也是Tph1、AADC、5-HT2AR、MAO-A表達(dá)上調(diào)最明顯的部位。鹿血晶可抑制順鉑誘導(dǎo)的Tph1、AADC、5-HT2AR、MAO-A蛋白表達(dá)的上調(diào)及腎組織5-HT、ROS含量升高（＜0.01）。鹿血晶活性成分抑制順鉑誘導(dǎo)腎損傷的機(jī)制可能是直接作用于腎臟近端腎小管上皮細(xì)胞，抑制順鉑對(duì)細(xì)胞Tph1、AADC、5-HT2AR、MAO-A表達(dá)的上調(diào)，從而抑制細(xì)胞的5-HT合成及線粒體5-HT降解，達(dá)到抑制線粒體ROS生成、保護(hù)呼吸鏈，最終抑制氧化應(yīng)激、炎癥、細(xì)胞凋亡的效果。

鹿血晶；近端腎小管上皮細(xì)胞；線粒體；5-羥色胺合成；5-羥色胺降解；活性氧

鹿血為鹿科動(dòng)物梅花鹿和馬鹿的血液，系名貴中藥。研究表明，鹿血可以增加放化療患者的白細(xì)胞，在延緩衰老、增強(qiáng)免疫、抗疲勞、保護(hù)腎臟等方面也有明顯療效[1-2]，故臨床上常輔助用于腫瘤患者放化療后的康復(fù)性治療。常用的廣譜抗腫瘤藥物順鉑[3]可在腎臟的近端腎小管積累而造成急性腎損傷（acute kidney injury，AKI）[4-6]，這是臨床上順鉑等化療藥物難以避免的不良反應(yīng)，而鹿血類(lèi)產(chǎn)品可以明顯保護(hù)腎臟、減輕順鉑對(duì)腎臟的損傷作用。本課題組前期研究證實(shí)，鹿血類(lèi)產(chǎn)品——鹿血晶（一種鹿血的冷凍干燥制劑）可保護(hù)小鼠腎臟，明顯減輕順鉑誘導(dǎo)的AKI、保護(hù)腎功能[7]。

AKI是指患者腎功能在短時(shí)間內(nèi)迅速下降，導(dǎo)致血清肌酐和尿素氮濃度急劇升高，腎臟出現(xiàn)明顯病理?yè)p傷[8]的一種臨床表現(xiàn)。研究發(fā)現(xiàn)，AKI時(shí)腎臟的主要病變區(qū)域?yàn)榻四I小管上皮細(xì)胞，病變細(xì)胞的線粒體呼吸鏈?zhǔn)軗p，導(dǎo)致活性氧（reactive oxygen species，ROS）生成增多，從而使腎組織出現(xiàn)氧化應(yīng)激、炎癥、細(xì)胞凋亡[9-10]。鹿血晶可以保護(hù)腎臟并抑制順鉑誘導(dǎo)的腎臟ROS產(chǎn)生、氧化應(yīng)激、炎癥及細(xì)胞凋亡[7]。然而，鹿血中的活性成分保護(hù)腎臟、抑制順鉑誘導(dǎo)的ROS產(chǎn)生的作用機(jī)制尚不明確。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞氧化應(yīng)激、炎癥的發(fā)生與細(xì)胞內(nèi)5-羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）在線粒體單胺氧化酶A（monoamine oxidase A，MAO-A）催化下的降解升高密切相關(guān)，還牽涉到5-HT合成酶色氨酸羥化酶1（tryptophan hydroxylase-1，Tph1）及芳香族氨基酸脫羧酶（aromatic amino acid decarboxylase，AADC）、5-HT2A受體（5-HT2Areceptors，5-HT2AR）的激活[11-14]。本研究以順鉑刺激人腎小管上皮HK-2細(xì)胞，模擬順鉑誘導(dǎo)AKI時(shí)對(duì)腎小管上細(xì)胞的損傷作用，結(jié)合順鉑誘導(dǎo)小鼠AKI的動(dòng)物模型考察鹿血晶對(duì)腎臟的保護(hù)作用是否與抑制5-HT降解有關(guān)，并評(píng)估鹿血晶對(duì)順鉑誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞5-HT合成酶、5-HT2AR、MAO-A表達(dá)上調(diào)的影響，以探究鹿血晶保護(hù)腎臟、抑制順鉑誘導(dǎo)AKI的作用機(jī)制。

1 材料

1.1 細(xì)胞

HK-2細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。

1.2 動(dòng)物

清潔級(jí)雄性ICR小鼠，6～8周齡，體質(zhì)量18～22 g，購(gòu)自揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK（蘇）2017-0007。動(dòng)物飼養(yǎng)于中國(guó)藥科大學(xué)藥學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，環(huán)境溫度23～26 ℃，濕度50%～55%，12 h晝夜光照交替，自由進(jìn)食飲水。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)遵循中國(guó)藥科大學(xué)有關(guān)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理和使用的規(guī)定，符合3R原則。

1.3 藥品與試劑

鹿血晶凍干粉末（批號(hào)L190504）購(gòu)自蘇州紅冠莊國(guó)藥股份有限公司；順鉑購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；氯吉蘭購(gòu)自上海CSN公司；DMEM低糖培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；胎牛血清購(gòu)自上海Excell公司；丙二醛（malondialdehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、還原型谷胱甘肽（reduced glutathione，GSH）、三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所；ROS、5-HT、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）ELISA試劑盒購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；BCA試劑、Hoechst 33342染料、ROS熒光探針DCFH-DA、Mito-Tracker Red CMXRos購(gòu)自上海碧云天生物科技有限公司；Tph1抗體購(gòu)自美國(guó)SAB公司；抑制子κBα（inhibitor kappa Bα，IκBα）、核因子κB p65（nuclear factor kappa B p65，NF-κB p65）及其磷酸化抗體、B細(xì)胞淋巴瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）抗體、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）抗體購(gòu)自沈陽(yáng)萬(wàn)類(lèi)生物科技有限公司；5-HT2AR抗體、半胱氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）抗體、Caspase-9抗體購(gòu)自美國(guó)Santa公司；GAPDH抗體、AADC抗體、MAO-A抗體、NADH脫氫酶1（NADH dehydrogenase 1，ND1）抗體、細(xì)胞色素B（cytochrome B，CYTB）抗體、ATP合成酶亞單位6（ATP synthase 6，ATP6）抗體購(gòu)自武漢三鷹生物科技有限公司；HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體、HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG抗體購(gòu)自Biosharp生物科技有限公司。

1.4 儀器

Infinite M2000 Pro全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（德國(guó)Tecan公司）；IX51型熒光倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；TS2-S-SM型倒置熒光顯微鏡（日本Nikon公司）；5200 Multi全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)（上海天能有限公司）；1300型生物安全柜、Forma II型水套式CO2恒溫培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）。

2 方法

2.1 體外實(shí)驗(yàn)

2.1.1 HK-2細(xì)胞培養(yǎng) HK-2細(xì)胞用含青霉素、鏈霉素及10%胎牛血清的DMEM低糖培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞融合度達(dá)60%～80%傳代。

2.1.2 鹿血晶對(duì)順鉑誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞ROS、MDA、GSH水平、SOD活性及上清液中TNF-α、IL-1β水平的影響 取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HK-2細(xì)胞，以5×104/mL接種于6孔板，培養(yǎng)12 h。通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)確定不同質(zhì)量濃度的鹿血晶對(duì)HK-2細(xì)胞活力的影響，然后設(shè)置對(duì)照組、模型組及鹿血晶（160、400、1000 μg/mL）組和氯吉蘭（15 μmol/L）組。實(shí)驗(yàn)時(shí)，稱(chēng)取1 g鹿血晶凍干粉末，溶于20 mL PBS溶液，于超凈臺(tái)中用0.22 μm孔徑的濾器濾過(guò)除菌，即得無(wú)菌的鹿血晶母液（50 mg/mL），以培養(yǎng)基稀釋至所需濃度。各給藥組加入相應(yīng)藥物預(yù)處理1 h，模型組和各給藥組再加入順鉑（20 μmol/L）處理24 h；對(duì)照組加入不含藥物的無(wú)血清培養(yǎng)基處理24 h。收集細(xì)胞，按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行MTT實(shí)驗(yàn)或檢測(cè)ROS、MDA、GSH水平和SOD活性；收集上清液，按照試劑盒說(shuō)明檢測(cè)TNF-α、IL-1β水平。

2.1.3 鹿血晶對(duì)順鉑誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞凋亡的影響 按“2.1.2”項(xiàng)下方法分組并處理細(xì)胞，棄去培養(yǎng)液，用熒光染料Hoechst 33342染色，采用熒光顯微鏡（激發(fā)波長(zhǎng)350 nm、發(fā)射波長(zhǎng)460 nm）DAPI通道（藍(lán)色熒光）觀察細(xì)胞凋亡情況。

2.1.4 鹿血晶對(duì)順鉑誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞IκBα、p-IκBα、NF-κB p65、p-NF-κB p65、Bax、Bcl-2、Caspase-3、Caspase-9、ND1、CYTB、ATP6、5-HT2AR、Tph1、AADC和MAO-A蛋白表達(dá)的影響 設(shè)置對(duì)照組、模型組、鹿血晶（1000 μg/mL）組和氯吉蘭（15 μmol/L）組，按“2.1.2”項(xiàng)下方法處理細(xì)胞，收集細(xì)胞。加入含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的IP裂解液，于 ?80 ℃裂解，12 000 r/min離心，取上清液。采用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)量濃度，加入上樣緩沖液稀釋蛋白樣品，100 ℃沸水浴5 min使蛋白變性。蛋白樣品經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，轉(zhuǎn)至PVDF膜，于牛血清白蛋白中封閉，分別加入IκBα、p-IκBα、NF-κB p65、p-NF-κB p65、Bax、Bcl-2、Caspase-3、Caspase-9、ND1、CYTB、ATP6、5-HT2AR、Tph1、AADC、MAO-A、GAPDH抗體，4 ℃孵育過(guò)夜，TBST洗滌；加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體（1∶20 000）或HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG抗體（1∶80 000）抗體，室溫孵育，TBST洗滌后置ECL發(fā)光液中顯色，采用全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)觀察并拍照，Image J軟件分析條帶灰度值。

2.1.5 鹿血晶對(duì)順鉑誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞ATP和5-HT含量的影響 設(shè)置對(duì)照組、鹿血晶（1000 μg/mL）組、氯吉蘭（15 μmol/L）組、模型組、順鉑＋鹿血晶（1000 μg/mL）組和順鉑＋氯吉蘭（15 μmol/L）組，按“2.1.2”項(xiàng)下方法處理細(xì)胞，收集細(xì)胞，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)細(xì)胞ATP含量。

設(shè)置對(duì)照組、模型組、鹿血晶（1000 μg/mL）組和氯吉蘭（15 μmol/L）組，按“2.1.2”項(xiàng)下方法處理細(xì)胞，收集細(xì)胞，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)細(xì)胞5-HT含量。

2.1.6 鹿血晶對(duì)順鉑誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞內(nèi)ROS含量及定位的影響 設(shè)置對(duì)照組、模型組、鹿血晶（1000 μg/mL）組和氯吉蘭（15 μmol/L）組，按“2.1.2”項(xiàng)下方法處理細(xì)胞，棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，用ROS熒光探針DCFH-DA、線粒體熒光探針Mito-Tracker Red CMXRos染色，采用激光共聚焦顯微鏡（ROS：激發(fā)波長(zhǎng)488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)525 nm；線粒體：激發(fā)波長(zhǎng)568 nm，發(fā)射波長(zhǎng)579 nm）觀察細(xì)胞內(nèi)ROS及線粒體表達(dá)。

2.2 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)

2.2.1 動(dòng)物分組、造模與給藥 ICR小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組和鹿血晶（0.78 g/kg）[13]組。鹿血晶組ig藥物，對(duì)照組和模型組ig 0.5%羧甲基纖維素鈉（CMC-Na），2次/d，連續(xù)7 d；禁食不禁水12 h后，模型組和鹿血晶組ip順鉑（25 mg/kg）誘導(dǎo)腎損傷，對(duì)照組ip 0.9%氯化鈉溶液。造模后各給藥組ig藥物，2次/d，連續(xù)3 d。給藥結(jié)束后眼框取血，小鼠脫頸椎處死，取兩側(cè)腎臟。

2.2.2 鹿血晶對(duì)AKI小鼠腎組織病理變化的影響 取小鼠腎組織，于10%福爾馬林中固定，梯度乙醇脫水，經(jīng)無(wú)水乙醇和二甲苯處理使組織透明；石蠟包埋后切片（厚5 μm），進(jìn)行蘇木素-伊紅（HE）染色，于顯微鏡下觀察并拍照。

2.2.3 免疫組化法檢測(cè)鹿血晶對(duì)AKI小鼠腎組織5-HT2AR、Tph1、AADC和MAO-A蛋白表達(dá)的影響 取各組小鼠腎組織，石蠟包埋后切片（5 μm厚），進(jìn)行免疫組化染色：石蠟切片脫蠟封閉后，分別加入Tph1、AADC、5-HT2AR和MAO-A抗體，4 ℃孵育過(guò)夜；洗滌后滴加生物素標(biāo)價(jià)的IgG抗體，37 ℃靜置30 min；洗滌后加入HRP標(biāo)記的鏈霉素卵白素工作液，37 ℃孵育15 min；洗滌后滴加DAB顯色液避光顯色，蘇木精復(fù)染，中性樹(shù)脂封片，于顯微鏡下觀察并拍照。

2.2.4 Western blotting法檢測(cè)鹿血晶對(duì)AKI小鼠腎組織5-HT2AR、Tph1、AADC和MAO-A蛋白表達(dá)的影響 取各組小鼠腎組織，加入含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液，按“2.1.4”項(xiàng)下方法提取蛋白并檢測(cè)5-HT2AR、Tph1、AADC、MAO-A蛋白表達(dá)。

2.2.5 鹿血晶對(duì)AKI小鼠腎組織5-HT和ROS含量的影響 取各組小鼠腎組織，按照試劑盒說(shuō)明檢測(cè)5-HT和ROS含量。

2.3 統(tǒng)計(jì)分析

3 結(jié)果

3.1 鹿血晶對(duì)順鉑誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞活力的影響

MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示（圖1），20 μmol/L順鉑刺激HK-2細(xì)胞24 h，細(xì)胞活力仍可達(dá)到對(duì)照組的43%，可用于后續(xù)研究。而預(yù)先加入鹿血晶（160、400、1000 μg/mL）或MAO-A抑制劑氯吉蘭（15 μmol/L）處理1 h后再同時(shí)加入順鉑處理細(xì)胞24 h，不僅不會(huì)使細(xì)胞活力進(jìn)一步下降，反而可輕度提高細(xì)胞活力（細(xì)胞活力提高10%～20%）。因此，以上述劑量進(jìn)行后續(xù)研究。

與對(duì)照組比較：*P＜0.05 **P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01，下圖同

3.2 鹿血晶對(duì)順鉑誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞ROS、MDA、GSH水平、SOD活性及上清液中TNF-α、IL-1β水平的影響

如表1所示，與對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞內(nèi)ROS、MDA水平明顯升高（＜0.01），SOD活力、GSH水平明顯降低（＜0.01），上清液中TNF-α、IL-1β水平顯著升高（＜0.01）；與模型組比較，各給藥組細(xì)胞內(nèi)ROS、MDA水平明顯降低（＜0.01），SOD活力、GSH水平明顯升高（＜0.01），上清液中TNF-α、IL-1β水平顯著降低（＜0.01），且鹿血晶3個(gè)劑量組間也有明顯差異（＜0.05、0.01），成劑量相關(guān)性；鹿血晶（1000 μg/mL）組的作用效果與氯吉蘭組接近。表明鹿血晶及氯吉蘭均可明顯抑制順鉑誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞ROS生成、氧化應(yīng)激反應(yīng)及炎癥因子分泌。

表1 鹿血晶對(duì)順鉑誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞ROS、MDA、GSH水平、SOD活性及上清液中TNF-α、IL-1β水平的影響(, n = 4)

與對(duì)照組比較：**＜0.01；與模型組比較：##＜0.01；與鹿血晶（160 μg·mL?1）組比較：△△＜0.01；與鹿血晶（400 μg·mL?1）組比較：▲＜0.05▲▲＜0.01

**< 0.01control group;##< 0.01model group;△△< 0.01deer blood crystal (160 μg·mL?1) group;▲< 0.05▲▲< 0.01deer blood crystal (400 μg·mL?1) group

3.3 鹿血晶對(duì)順鉑誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞凋亡的影響

如圖2所示，與對(duì)照組相比，模型組細(xì)胞核的Hoechst 33342熒光藍(lán)染明顯變亮，提示順鉑刺激使HK-2細(xì)胞出現(xiàn)凋亡；給予鹿血晶和氯吉蘭后，細(xì)胞的Hoechst 33342熒光藍(lán)染亮度明顯降低，且鹿血晶的作用呈劑量相關(guān)性，而鹿血晶（1000 μg/mL）組的作用效果與氯吉蘭組接近。因此后續(xù)以1000 μg/mL鹿血晶研究其抑制順鉑誘導(dǎo)細(xì)胞損傷的作用機(jī)制。

3.4 鹿血晶對(duì)順鉑誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞IκBα、p-IκBα、NF-κB p65、p-NF-κB p65、Bax、Bcl-2、Caspase-3、Caspase-9蛋白表達(dá)的影響

如圖3所示，與對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞NF-κB p65、IκBα磷酸化水平顯著升高（＜0.01），Bax、Caspase-3、Caspase-9蛋白表達(dá)水平顯著升高（＜0.01），Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著降低（＜0.01），提示順鉑刺激使HK-2細(xì)胞NF-κB炎癥信號(hào)通路及細(xì)胞凋亡通路激活。與模型組比較，各給藥組NF-κB p65、IκBα磷酸化水平顯著降低（＜0.01），Bax、Caspase-3、Caspase-9蛋白表達(dá)水平顯著降低（＜0.01），Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著升高（＜0.05）。

圖2 鹿血晶對(duì)順鉑誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞凋亡的影響 (×400)

圖3 鹿血晶對(duì)順鉑誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞IκBα、p-IκBα、NF-κB p65、p-NF-κB p65、Bax、Bcl-2、Caspase-3、Caspase-9蛋白表達(dá)的影響(, n = 3)

3.5 鹿血晶對(duì)順鉑誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞線粒體呼吸鏈功能損傷的影響

如圖4所示，與對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞呼吸鏈蛋白ND1、CYTB及ATP6蛋白表達(dá)水平明顯降低（＜0.05、0.01），細(xì)胞內(nèi)ATP含量明顯降低（＜0.01），提示順鉑可明顯損傷HK-2細(xì)胞線粒體呼吸鏈功能、抑制ATP合成；與模型組比較，各給藥組均可顯著抑制順鉑對(duì)呼吸鏈功能的破壞作用（＜0.05、0.01），使ND1、CYTB、ATP6蛋白表達(dá)及細(xì)胞內(nèi)ATP含量恢復(fù)到接近對(duì)照組水平，且鹿血晶和氯吉蘭的作用效果接近。

圖4 鹿血晶對(duì)順鉑誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞ND1、CYTB、ATP6蛋白表達(dá)及ATP含量的影響(, n = 3)

3.6 鹿血晶對(duì)順鉑誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞5-HT系統(tǒng)激活及線粒體ROS生成的影響

如圖5所示，與對(duì)照組相比，模型組細(xì)胞內(nèi)5- HT2AR、Tph1、AADC及MAO-A蛋白表達(dá)水平明顯升高（＜0.01），5-HT含量升高（＜0.01）。如圖6所示，經(jīng)DCFH-DA熒光探針染色，還檢測(cè)到細(xì)胞內(nèi)ROS含量明顯升高；通過(guò)細(xì)胞內(nèi)ROS、線粒體熒光探針雙定位，發(fā)現(xiàn)順鉑誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞ROS產(chǎn)生的部位為線粒體，兩者定位重疊，提示順鉑刺激使HK-2細(xì)胞內(nèi)5-HT合成酶、5-HT2AR、MAO-A同時(shí)激活，使細(xì)胞內(nèi)5-HT含量及線粒體5-HT降解、ROS產(chǎn)生同時(shí)增多。

圖5 鹿血晶對(duì)順鉑誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞5-HT2AR、Tph1、AADC、MAO-A蛋白表達(dá)及細(xì)胞內(nèi)5-HT含量的影響(, n = 3)

與模型組比較，鹿血晶組細(xì)胞內(nèi)5-HT2AR、Tph1、AADC及MAO-A蛋白表達(dá)水平明顯降低（＜0.01），5-HT含量降低（＜0.01），但氯吉蘭使細(xì)胞內(nèi)5-HT含量進(jìn)一步升高（＜0.01）；鹿血晶及氯吉蘭組均降低細(xì)胞內(nèi)及線粒體內(nèi)ROS含量，且二者作用相似。提示，鹿血晶、氯吉蘭對(duì)順鉑誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞5-HT降解、線粒體ROS產(chǎn)生的抑制作用是相同的；但鹿血晶還可抑制5-HT合成酶及5-HT2AR的上調(diào)、抑制5-HT合成，而氯吉蘭不僅不能抑制5-HT合成使細(xì)胞內(nèi)5-HT含量降低，反而使細(xì)胞內(nèi)5-HT含量進(jìn)一步升高。

圖6 鹿血晶對(duì)順鉑誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞內(nèi)ROS含量及定位的影響(×1000)

3.7 鹿血晶對(duì)AKI小鼠腎組織病理變化的影響

腎組織切片HE染色（圖7）表明，與對(duì)照組相比，模型組小鼠腎小球周?chē)I小管（即近端腎小管）發(fā)生明顯病變，出現(xiàn)腎小管上皮細(xì)胞脫落、壞死、空泡化，管形破壞；與模型組比較，鹿血晶組小鼠近端腎小管破壞明顯減輕。

圖7 鹿血晶對(duì)AKI小鼠腎組織病理變化的影響 (×400)

3.8 鹿血晶對(duì)AKI小鼠腎組織5-HT系統(tǒng)表達(dá)的影響

如圖8所示，腎組織切片免疫組化檢測(cè)顯示，與對(duì)照組比較，模型組小鼠腎組織Tph1、AADC、5-HT2AR、MAO-A蛋白表達(dá)水平顯著（＜0.01），且蛋白表達(dá)量最高的細(xì)胞為近端腎小管上皮細(xì)胞，與腎組織的病變部位一致，腎組織5-HT、ROS含量也明顯升高（＜0.01）；與模型組比較，鹿血晶組腎組織Tph1、AADC、5-HT2AR、MAO-A蛋白表達(dá)水平明顯降低（＜0.01），5-HT和ROS含量明顯降低（＜0.01）。

A-免疫組化法檢測(cè)腎組織5-HT2AR、Tph1、AADC、MAO-A表達(dá) (×400) B-Western blotting法檢測(cè)腎組織5-HT2AR、Tph1、AADC、MAO-A蛋白表達(dá) (n＝4) C-腎組織5-HT、ROS含量 (n＝10)

4 討論

本研究揭示了鹿血晶對(duì)順鉑誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞損傷具有直接的保護(hù)作用，且這種保護(hù)作用具有劑量相關(guān)性，與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)的“鹿血晶可劑量相關(guān)性地抑制順鉑誘導(dǎo)的AKI”結(jié)果一致[7]。表明鹿血晶中確實(shí)存在活性成分，可直接作用于腎臟，保護(hù)腎臟免受順鉑等毒物對(duì)腎臟的損傷作用、保護(hù)腎功能。結(jié)果表明，鹿血晶可劑量相關(guān)性地抑制順鉑誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞ROS產(chǎn)生、氧化應(yīng)激、炎癥因子分泌、細(xì)胞凋亡；鹿血晶的這種作用與抑制順鉑誘導(dǎo)的NF-κB炎癥信號(hào)通路、細(xì)胞凋亡通路（Bax、Caspase3、Caspase9表達(dá)上調(diào)及Bcl-2表達(dá)下調(diào)）激活有關(guān)。鹿血晶還可保護(hù)線粒體，抑制順鉑對(duì)線粒體呼吸鏈功能的破壞（呼吸鏈蛋白ND1、CYTB和ATP6下調(diào)，ATP合成減少）。鹿血晶的以上作用與氯吉蘭的作用完全相同；而氯吉蘭的直接作用是抑制MAO-A對(duì)單胺類(lèi)的降解作用，使降解過(guò)程時(shí)產(chǎn)生的ROS減少[15-17]。順鉑誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞ROS產(chǎn)生部位就是線粒體，而MAO-A正是位于線粒體的外膜上。因此，可以推測(cè)，鹿血晶對(duì)腎小管上皮細(xì)胞的保護(hù)作用可能是通過(guò)抑制線粒體MAO-A催化的5-HT降解，從而抑制ROS生成、恢復(fù)呼吸鏈功能實(shí)現(xiàn)的。

研究表明，5-HT參與腎臟的病理狀態(tài)。近端腎小管細(xì)胞已被證明可高水平表達(dá)AADC[18]，5-HT高水平合成可導(dǎo)致慢性腎病并發(fā)尿毒癥[19]。在人系膜細(xì)胞，5-HT刺激5-HT2AR后產(chǎn)生大量ROS[20]，通過(guò)調(diào)節(jié)下游細(xì)胞因子的表達(dá)，引起組織炎癥、損傷和死亡[21]。本課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)，5-HT參與糖尿病腎損傷的發(fā)生[14]；并揭示出細(xì)胞5-HT降解系統(tǒng)調(diào)控ROS產(chǎn)生的機(jī)制[11,13,22]：由于5-HT合成增多、5-HT2AR及MAO-A表達(dá)上調(diào)，使線粒體MAO-A催化的5-HT降解增多，導(dǎo)致線粒體ROS生成增多、呼吸鏈?zhǔn)軗pATP合成減少；其中，5-HT2AR的作用是同時(shí)介導(dǎo)5-HT合成酶Tph1、AADC的表達(dá)及MAO-A的表達(dá)，從而調(diào)控線粒體5-HT降解。順鉑誘導(dǎo)AKI的機(jī)制也是如此[23]。本研究表明，鹿血晶能夠明顯抑制順鉑對(duì)HK-2細(xì)胞及小鼠腎臟Tph1、AADC、5-HT2AR、MAO-A表達(dá)的上調(diào)作用，抑制HK-2細(xì)胞及腎組織內(nèi)5-HT水平升高、5-HT降解。腎組織切片HE染色及Tph1、AADC、5-HT2AR、MAO-A免疫組化染色結(jié)果顯示，AKI小鼠腎損傷部位就是這些蛋白的高表達(dá)部位，位于腎小球周?chē)哪I小管上皮細(xì)胞，與文獻(xiàn)報(bào)道的“AKI腎損傷部位-近端腎小管”一致[10,23]。因此，順鉑誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞線粒體ROS產(chǎn)生增多、呼吸鏈功能損傷，從而導(dǎo)致細(xì)胞損傷，起因于其對(duì)細(xì)胞5-HT降解系統(tǒng)的激活。

綜上所述，推測(cè)鹿血晶保護(hù)腎臟、抑制順鉑誘導(dǎo)AKI的機(jī)制如下（圖9）：鹿血晶活性成分可直接作用于腎臟近端腎小管上皮細(xì)胞，抑制順鉑對(duì)細(xì)胞的損傷作用；其作用機(jī)制是抑制順鉑對(duì)細(xì)胞Tph1、AADC、5-HT2AR、MAO-A的上調(diào)作用，從而抑制細(xì)胞的5-HT合成及線粒體5-HT降解導(dǎo)致的ROS生成、呼吸鏈功能損傷，而細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激、炎癥、細(xì)胞凋亡等病變正是起因于線粒體ROS產(chǎn)生增多[11,13,23]。因此，鹿血晶保護(hù)腎功能、抑制順鉑誘導(dǎo)AKI，是通過(guò)抑制腎小管上皮細(xì)胞的5-HT降解系統(tǒng)激活實(shí)現(xiàn)的。

圖9 鹿血晶抑制順鉑誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞損傷的機(jī)制

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Deer blood crystal inhibits cisplatin-induced kidney injury by reducing synthesis and degradation of 5-HT in renal tubular epithelial cells

ZHANG Yi, GUAN Jing, XU Fan, LIANG Xiu-rui, ZHANG Yu-xin, JIN Jia-qi, FU Ji-hua

School of Basic Medicine and Clinical Pharmacy, China Pharmaceutical University, Nanjing 210009, China

To explore the mechanism of deer blood crystal (DBC) on protecting the kidney and inhibiting cisplatin-induced kidney injury.HK-2 cells were divided into control group, model group, DBC (160, 400, 1000 μg/mL) groups and monoamine oxidase A (MAO-A) inhibitor clorgyline (15 μmol/L) group, drug were added to pretreat for 1 h, and then the cells were exposed to cisplatin (20 μmol/L) for 24 h to induce cell damage. Male ICR mice were randomly divided into control group, model group and DBC (0.78 g/kg) group, after pretreatment with DBC for 7 d, kidney injury was induced by ip cisplatin (25 mg/kg) in model and DBC group; Furthermore, mice were still treated for 3 d and then killed. Malondialdehyde (MDA), glutathione (GSH), adenosine triphosphate (ATP) levels, superoxide dismutase (SOD) activity in cells and tumor necrosis factor-α (TNF-α), interleukin-1β (IL-1β) levels in supernatant were measured, reactive oxygen species (ROS) and 5-hydroxytryptamine (5-HT) levels in cells and kidney tissue of mice were measured. ROS content, location and apoptosis of HK-2 cells were respectively distinguished by fluorescent probe DCFH-DA, Mito-Tracker Red CMXRos and fluorescent dye Hoechst 33342.Western blotting was used to analyze the protein expressions of B-cell lymphoma-2 (Bcl-2), Bcl-2-associated X protein (Bax), Caspase-3, Caspase-9, NADH dehydrogenase 1 (ND1), cytochrome B (CYTB), ATPase 6 (ATP6), nuclear factor-κB p65 (NF-κB p65), phosphorylated NF-κB p65 (p-NF-κB p65), inhibitor κBα (IκBα) and p-IκBα in cells, and tryptophan hydroxylase 1 (Tph1), aromatic cluster amino acid decarboxylase (AADC), 5-HT2Areceptor (5-HT2AR), MAO-A protein expressions in cells and kidney tissue of mice. Hematoxylin-eosin (HE) staining was used to detect the pathological damage of renal tissues; Immunohistochemistry was used to detect expressions of Tph1, AADC, 5-HT2AR, and MAO-A in renal tissues.Compared with model group, elevation of intracellular ROS, MDA levels and supernatant TNF-α, IL-1β levels were inhibited by DBC (< 0.05, 0.01), intracellular GSH, SOD levels were reduced (< 0.05, 0.01), and apoptosis in HK-2 cells were reduced. Effect of DBC (1000 μg/mL) group was similar to that of clorgyline group, and reversal effects of both on cisplatin-induced phosphorylation of NF-κB p65, activation of apoptosis (upregulation of Bax, Caspase-3, Caspase-9 expressions, and downregulation of Bcl-2 expression), and decline of respiratory chain function (downregulation of ND1, CYTB and ATP6 expressions, and reduction of ATP level) were also similar in HK-2 cells. Additionally, the upregulation of Tph1, AADC, 5-HT2AR, MAO-A expression, and increased 5-HT levels in HK-2 cells induced by cisplatin were significantly inhibited in DBC (1000 μg/mL) group (< 0.05, 0.01), while the level of 5-HT was even higher in clorgyline group (< 0.01). Fluorescence probe detection showed that mitochondria was the site of ROS production in HK-2 cells induced by cisplatin, and the inhibitory effect of DBC (1000 μg/mL) group and clorgyline group on ROS production was similar. HE staining showed that the damage site of renal tissue induced by cisplatin was mainly in the proximal renal tubular epithelial cells, and it was the site of the highest upregulation of Tph1, AADC, 5-HT2AR and MAO-A expressions induced by cisplatin as shown by immunohistochemistry. DBC could suppressed the upregulation of Tph1, AADC, 5-HT2AR and MAO-A protein expressions and the increase of 5-HT and ROS levels induced by cisplatin in renal tissue (< 0.01).The mechanism of inhibiting cisplatin-induced kidney injury by active components of DBC is probably to directly act on the renal proximal tubular epithelial cells, suppressing the upregulation of Tph1, AADC, 5-HT2AR and MAO-A expressions induced by cisplatin, thus inhibiting the synthesis of 5-HT and mitochondrial 5-HT degradation, inhibiting ROS production and protecting mitochondrial respiratory chain, so as to inhibit oxidative stress, inflammation and apoptosis.

deer blood crystal; renal proximal tubular epithelial cells; mitochondrion; synthesis of 5-hydroxytryptamine; degradation of 5-hydroxytryptamine; reactive oxygen species

R285.5

A

0253 - 2670(2021)24 - 7501 - 10

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.24.012

2021-08-03

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81570720）

張 怡（1996—），女，碩士，從事腎臟急性損傷的病理機(jī)制及相關(guān)藥理學(xué)研究。Tel: 15895908069 E-mail: zy578546102@qq.com

傅繼華（1962—），男，副教授，碩士生導(dǎo)師，從事肝腎損傷、代謝異常性疾病的發(fā)病機(jī)制研究及相關(guān)疾病治療的藥理學(xué)研究。Tel: 13951933013 E-mail: fjhfy_cpu@163.com; jihua_fu@cpu.edu.cn

[責(zé)任編輯 李亞楠]