益腎通絡(luò)方下調(diào)ADAM17介導(dǎo)的EGFR表達(dá)干預(yù)膜性腎病腎小管上皮細(xì)胞凋亡研究

陳素枝，李永章，楊鳳文，檀 淼，宋 蕾，檀金川*

益腎通絡(luò)方下調(diào)ADAM17介導(dǎo)的EGFR表達(dá)干預(yù)膜性腎病腎小管上皮細(xì)胞凋亡研究

陳素枝1，李永章1，楊鳳文1，檀 淼2，宋 蕾3，檀金川1*

1. 河北省中醫(yī)院，河北 石家莊 050011 2. 河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院，河北 石家莊 050011 3. 天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 301617

探討解整合素金屬蛋白酶17（a disintegrin and metalloproteinase 17，ADAM17）介導(dǎo)的表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）激活與膜性腎病（membranous nephropathy，MN）腎小管上皮細(xì)胞凋亡的關(guān)系及益腎通絡(luò)方的干預(yù)作用。尾iv陽(yáng)離子牛血清白蛋白（cationic bovine serum albumin，C-BSA）構(gòu)建MN大鼠模型，給予益腎通絡(luò)方干預(yù)4周。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后觀察大鼠腎臟病理變化和腎小管上皮細(xì)胞凋亡情況；采用Western blotting和qRT-PCR法檢測(cè)腎組織ADAM17、肝素結(jié)合性表皮生長(zhǎng)因子（heparin-binding epidermal growth factor，HB-EGF）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）以及磷酸化表皮生長(zhǎng)因子受體（phosphorylated epidermal growth factor receptor，p-EGFR）蛋白及mRNA表達(dá)情況。與對(duì)照組比較，模型組大鼠腎臟病理改變嚴(yán)重，腎小管上皮細(xì)胞凋亡增多（＜0.01），腎組織ADAM17、p-EGFR、HB-EGF、TNF-α蛋白及mRNA表達(dá)顯著升高（＜0.01）。與模型組相比，益腎通絡(luò)方組大鼠腎臟病理有所改善，腎小管細(xì)胞凋亡減少（＜0.01），腎組織ADAM17、EGFR、HB-EGF、TNF-α蛋白及mRNA表達(dá)顯著降低（＜0.01）。MN大鼠腎組織ADAM17表達(dá)增多，釋放活化HB-EGFR、TNF-α增多，進(jìn)而激活相應(yīng)受體EGFR，EGFR活化進(jìn)一步誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞凋亡及腎臟纖維化。益腎通絡(luò)方可以通過(guò)降低MN大鼠腎組織剪切酶ADAM17表達(dá)，減少HB-EGFR、TNF-α的脫落活化，從而減少EGFR激活，以達(dá)到減少腎小管上皮細(xì)胞凋亡、延緩腎臟纖維化的作用。

膜性腎?。唤庹纤亟饘俚鞍酌?7/表皮生長(zhǎng)因子受體；腎小管細(xì)胞；凋亡；益腎通絡(luò)方

膜性腎病（membranous nephropathy，MN）是成人腎小球腎炎最常見(jiàn)的病理類型之一，也是成人特發(fā)性腎病綜合征的最常見(jiàn)原因。大量蛋白尿是MN的特征之一，疾病嚴(yán)重程度和預(yù)后從自發(fā)緩解到發(fā)展為嚴(yán)重腎病綜合征以及進(jìn)展至終末期腎臟病各不相同[1]。關(guān)于MN目前較多關(guān)注的是足細(xì)胞的凋亡，很少有人關(guān)注腎小管細(xì)胞損傷。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，MN中除足細(xì)胞凋亡外，還存在大量腎小管上皮細(xì)胞的凋亡。蛋白尿是一種有充分證據(jù)證明的腎功能逐漸喪失的預(yù)測(cè)因子，被認(rèn)為是腎臟損害和功能喪失的原因，是導(dǎo)致腎病進(jìn)展的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。細(xì)胞凋亡被認(rèn)為是腎小球硬化過(guò)程中實(shí)質(zhì)細(xì)胞減少的機(jī)制之一。蛋白尿?qū)δI小管細(xì)胞的毒性作用是引起腎小管細(xì)胞凋亡、腎小管間質(zhì)炎癥和纖維化的主要原因[2-3]。

蛋白尿可以通過(guò)活化補(bǔ)體、誘導(dǎo)細(xì)胞因子釋放、誘導(dǎo)小管上皮細(xì)胞自噬、激活凋亡相關(guān)途徑等不同機(jī)制誘導(dǎo)腎小管細(xì)胞損傷[4]。解整合素金屬蛋白酶17（a disintegrin and metalloproteinase 17，ADAM17）是釋放多種膜錨定底物的主要脫落酶，主要用于釋放膜表面生長(zhǎng)因子或細(xì)胞因子，進(jìn)而極大地調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的活性以及通過(guò)細(xì)胞因子受體的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[5]。研究表明，ADAM17具有促炎和促纖維化作用[6]，ADAM17剪切并釋放腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）及肝素結(jié)合性表皮生長(zhǎng)因子（heparin-binding epidermal growth factor，HB-EGF），進(jìn)而反式激活表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR），介導(dǎo)腎臟損傷[5]。

益腎通絡(luò)方是河北省中醫(yī)院治療MN的有效處方，療效突出[7]，課題組前期探討其作用機(jī)制時(shí)發(fā)現(xiàn)益腎通絡(luò)方不僅可以抑制腎小球足細(xì)胞損傷，還可以減少腎小管上皮細(xì)胞凋亡[8-9]。故本研究將觀察ADAM17介導(dǎo)的EGFR的激活參與腎小管上皮細(xì)胞凋亡的機(jī)制及益腎通絡(luò)方的干預(yù)作用，進(jìn)一步揭示益腎通絡(luò)方治療MN的作用機(jī)制，為MN的治療提供思路和方法。

1 材料

1.1 動(dòng)物

清潔級(jí)雄性SD大鼠50只，8周齡，體質(zhì)量（180±20）g，由河北醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物許可證號(hào)SYXK（冀）2008-0026，動(dòng)物合格證書(shū)編號(hào)1509116。大鼠在河北中醫(yī)學(xué)院SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)中心飼養(yǎng)，自由進(jìn)食飲水。本動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)河北中醫(yī)學(xué)院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)DWLL2020046）。

1.2 藥品與試劑

益腎通絡(luò)方配方顆粒購(gòu)自廣東一方制藥有限公司，由黃芪（批號(hào)5063231）20 g、炒白術(shù)（批號(hào)505207T）15 g、黨參（批號(hào)5060421）15 g、仙靈脾（批號(hào)411420T）15 g、當(dāng)歸（批號(hào)5061851）15 g、莪術(shù)（批號(hào)5061671）12 g、水蛭（批號(hào)504432T）9 g、地龍（批號(hào)5062171）12 g、絞股藍(lán)（批號(hào)407347T）15 g組成，經(jīng)課題組前期研究其含毛蕊異黃酮葡萄糖苷≥0.05%、黃芪甲苷≥0.12%、阿魏酸≥0.15%、甘氨酸≥6.0%、丙氨酸≥2.5%、脯氨酸≥3.0%、水蛭胺B≥0.02%、水蛭胺C≥0.04%、黨參炔苷≥0.008%、肌苷≥0.37%、丹酚酸B≥2.8%、茯苓酸B≥0.01%、茯苓酸A≥0.008%；鹽酸貝那普利（批號(hào)FA20150902，10 mg/片）購(gòu)自深圳信立泰藥業(yè)股份有限公司；陽(yáng)離子牛血清白蛋白（cationic bovine serum albumin，C-BSA，批號(hào)A7906）購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；弗式不完全佐劑（批號(hào)BJ-012-0392）美國(guó)Sigma公司；山羊抗大鼠IgG抗體、FITC標(biāo)記的兔抗山羊IgG抗體（批號(hào)分別為20147-1、111-095-003）購(gòu)自美國(guó)KPL公司；TUNEL試劑盒（批號(hào)ab206386）、兔抗大鼠ADAM17抗體（批號(hào)ab28233）、p-EGFR抗體（批號(hào)EP774Y）、HB-EGF抗體（批號(hào)ab218019）、TNF-α抗體（批號(hào)ab205587）購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；ADAM17、EGFR、HB-EGF、TNF-α引物購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；TRNzol總RNA提取試劑（批號(hào)DP405-02）購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；PrimeScript? RT reagent Kit with gDNA Eraser（批號(hào)RR047B）、SYBR?Premix Ex Taq? Ⅱ（Tli RNaseH Plus）ROX plus（批號(hào)RR82LR）；DL2000 DNA Marker（批號(hào)3427Q）購(gòu)自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司。

1.3 儀器

ND-1000型核酸定量?jī)x、分光光度計(jì)（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）；BX51T-PHD-J11型顯微鏡（日本Olympus公司）；TP 1020型包埋機(jī)、RM2016型切片機(jī)（德國(guó)Leica公司）；渦旋振蕩儀（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司）；qRT-PCR儀（美國(guó)Applied Biosystems公司）；Tanon 1600凝膠成像系統(tǒng)（上海天能科技有限公司）。

2 方法

2.1 模型的制備、分組及給藥

SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，隨機(jī)分為對(duì)照組12只和造模組38只，參照Border法[10]制備MN模型：1 mg C-BSA溶于0.5 mL 0.9%氯化鈉溶液，并與等體積弗氏不完全佐劑充分乳化，分別于大鼠雙前肢腋下及雙腹股溝處sc 1 mL乳化液進(jìn)行預(yù)免疫，隔日1次，每周3次，預(yù)免疫1周；大鼠尾iv乳化劑（16 mg/kg）進(jìn)行正式免疫，隔日1次，每周3次，連續(xù)4周。對(duì)照組大鼠尾iv等體積0.9%氯化鈉溶液。造模結(jié)束后隨機(jī)取造模組大鼠2只行腎臟病理檢查，確認(rèn)造模成功。造模期間造模組大鼠死亡1只，將剩余35只造模組大鼠隨機(jī)分為模型組11只、鹽酸貝那普利（10 mg/kg，相當(dāng)于臨床等效劑量）組12只、益腎通絡(luò)方（13.22 g/kg，相當(dāng)于臨床等效劑量）[8]組12只。各給藥組ig藥物（10 mL/kg），對(duì)照組和模型組ig等體積蒸餾水，1次/d，連續(xù)4周。

2.2 益腎通絡(luò)方對(duì)MN大鼠腎組織IgG免疫沉積的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，大鼠ip 10%水合氯醛麻醉，取米粒樣大小的腎皮質(zhì)，于2.5%戊二醛固定液中固定，梯度乙醇脫水后包埋、固化，采用超薄切片機(jī)切片（厚70 nm），加入FITC標(biāo)記的兔抗山羊IgG抗體孵育，于顯微鏡下觀察IgG熒光沉積情況并拍照。

2.3 益腎通絡(luò)方對(duì)MN大鼠腎組織病理變化的影響

取各組大鼠腎皮質(zhì)（2 mm×2 mm×10 mm），于10%福爾馬林中固定，分別行PAS、Masson染色，于顯微鏡下觀察腎組織病理變化。

2.4 益腎通絡(luò)方對(duì)膜性腎病大鼠腎組織足細(xì)胞和腎小管上皮細(xì)胞凋亡的影響

取各組大鼠腎組織，按TUNEL試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)足細(xì)胞和腎小管上皮細(xì)胞凋亡情況。

2.5 益腎通絡(luò)方對(duì)膜性腎病大鼠腎組織ADAM17、EGFR、HB-EGF和TNF-α mRNA表達(dá)的影響

取各組大鼠部分腎皮質(zhì)，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)提取總RNA并合成cDNA，進(jìn)行qRT-PCR分析。引物序列：上游引物5’-ACATGCTCAGGG- AACAGGTG-3’，下游引物5’-CTGACAGTCTGTC- CTCAAAACG-3’，115 bp；上游引物5’-GGC- TCCCAGTACCTACTCAAC-3’，下游引物5’-GTA- TTCTTTCTCCTCAGCACCA-3’，173 bp；上游引物5’-CACTGGTTCAGGATGGACG-3’，下游引物5’-CCCCTTTGTCAAGAAGTAGCT-3’，185 bp；上游引物5’-CCACCTCCATCACCA- CTACC-3’，下游引物5’-CAGAGCCACCAGCAC- CAT-3’，126 bp；上游引物5’-CCTTCCGT- GTTCCTACCCC-3’，下游引物5’-GCCCAGGATGC- CCTTTAGTG-3’，131 bp。

2.6 益腎通絡(luò)方對(duì)膜性腎病大鼠腎組織ADAM17、EGFR、HB-EGF和TNF-α蛋白表達(dá)的影響

取各組大鼠部分腎皮質(zhì)，于10%中性甲醛固定液中固定，脫水、二甲苯透明后切片（厚4 μm），常規(guī)脫蠟至水，抗原修復(fù)，加入3% H2O2清除過(guò)氧化物酶活性，滴加50 μL山羊血清封閉，滴加ADAM17、EGFR、HB-EGF和TNF-α抗體孵育，滴加山羊抗大鼠IgG抗體，加入DAB染液顯色，蘇木素復(fù)染3 min，封片，于顯微鏡下觀察各組大鼠腎組織ADAM17、EGFR、HB-EGF和TNF-α表達(dá)情況。

2.7 統(tǒng)計(jì)方法

3 結(jié)果

3.1 益腎通絡(luò)方對(duì)MN大鼠腎組織IgG免疫沉積的影響

如圖1所示，對(duì)照組大鼠腎小球基底膜未見(jiàn)IgG熒光沉積，模型組大鼠腎小球基底膜可見(jiàn)大量IgG熒光沉積，益腎通絡(luò)方和鹽酸貝那普利組腎小球基底膜可見(jiàn)少量IgG熒光沉積。

圖1 益腎通絡(luò)方對(duì)MN大鼠腎組織IgG免疫沉積的影響

3.2 益腎通絡(luò)方對(duì)MN大鼠腎組織病理變化的影響

如圖2所示，經(jīng)PAS和Masson染色發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組大鼠腎小球基底膜正常，無(wú)增厚，無(wú)釘突形成，腎小管上皮細(xì)胞無(wú)空泡變性；腎小球結(jié)構(gòu)未見(jiàn)異常，無(wú)嗜復(fù)紅蛋白沉積，未見(jiàn)纖維化改變。模型組大鼠腎組織小球基底膜增厚，腎小管上皮細(xì)胞可見(jiàn)空泡變性，腎組織大量嗜復(fù)紅蛋白沉積，腎間質(zhì)纖維化改變明顯。益腎通絡(luò)方和鹽酸貝那普利組大鼠腎小球光鏡下結(jié)構(gòu)有不同程度減輕。

3.3 益腎通絡(luò)方對(duì)MN大鼠腎小管上皮細(xì)胞凋亡的影響

通過(guò)TUNEL法檢測(cè)腎小管上皮細(xì)胞凋亡情況，細(xì)胞核呈棕褐色為凋亡細(xì)胞。如圖3和表1所示，對(duì)照組大鼠腎小管上皮未見(jiàn)凋亡細(xì)胞；模型組大鼠腎小管上皮可見(jiàn)大量凋亡細(xì)胞，腎小管上皮細(xì)胞凋亡率明顯高于對(duì)照組（＜0.01）；益腎通絡(luò)方和鹽酸貝那普利組大鼠腎小管上皮細(xì)胞凋亡率較模型組明顯降低（＜0.01）。

3.4 益腎通絡(luò)方對(duì)膜性腎病大鼠腎組織ADAM17、EGFR、HB-EGF和TNF-α mRNA表達(dá)的影響

如表2所示，與對(duì)照組相比，模型組大鼠腎組織、、和mRNA表達(dá)明顯升高（＜0.01）；與模型組相比，各給藥組腎組織、、和mRNA表達(dá)明顯降低（＜0.01）。

圖2 益腎通絡(luò)方對(duì)MN大鼠腎組織病理變化的影響 (×400)

圖3 益腎通絡(luò)方對(duì)MN大鼠腎小管上皮細(xì)胞凋亡的影響

表1 益腎通絡(luò)方對(duì)MN大鼠腎小管上皮細(xì)胞凋亡的影響()

與對(duì)照組比較：**＜0.01；與模型組比較：##＜0.01，表2同

**< 0.01control group;##< 0.01model group, same as table 2

表2 益腎通絡(luò)方對(duì)膜性腎病大鼠腎組織ADAM17、EGFR、HB-EGF和TNF-α mRNA表達(dá)的影響()

3.5 益腎通絡(luò)方對(duì)膜性腎病大鼠腎組織ADAM17、EGFR、HB-EGF和TNF-α蛋白表達(dá)的影響

如圖4所示，ADAM17在對(duì)照組大鼠腎臟近曲小管、腎小球內(nèi)皮微弱表達(dá)，在模型組大鼠腎臟近端小管上皮細(xì)胞ADAM17明顯增強(qiáng)，益腎通絡(luò)方干預(yù)后ADAM17表達(dá)下降。TNF-α主要在胞質(zhì)中表達(dá)，在對(duì)照組微弱表達(dá)，在模型組呈高表達(dá)，益腎通絡(luò)方干預(yù)組TNF-α表達(dá)較模型組下降。腎小管上皮細(xì)胞是HB-EGF的主要來(lái)源，正常情況下HB-EGF在近曲小管少量表達(dá)；EGFR在正常腎小管上皮細(xì)胞少量表達(dá)。對(duì)照組大鼠腎小管可見(jiàn)少量HB-EGF、p-EGFR表達(dá)；模型組大鼠腎組織HB-EGF和p-EGFR表達(dá)較對(duì)照組明顯增強(qiáng)，p-EGFR在腎小管細(xì)胞表達(dá)明顯，HB-EGF除在近曲小管表達(dá)外，在遠(yuǎn)曲小管和集合管也有表達(dá)；各給藥組HB-EGF、p-EGFR表達(dá)較模型組有不同程度減弱。

圖4 益腎通絡(luò)方對(duì)膜性腎病大鼠腎組織ADAM17、EGFR、HB-EGF和TNF-α蛋白表達(dá)的影響 (×400)

4 討論

絡(luò)脈根據(jù)其體內(nèi)分布分為陽(yáng)絡(luò)和陰絡(luò)，陰絡(luò)又根據(jù)其分布的臟腑不同而進(jìn)一步分為心絡(luò)、肝絡(luò)、腎絡(luò)等。腎絡(luò)因絡(luò)體細(xì)窄而具有血行緩慢、易虛易滯的特點(diǎn)。絡(luò)脈是邪氣侵犯人體的途徑，MN發(fā)病時(shí)邪氣犯絡(luò)，正邪相爭(zhēng)產(chǎn)生濕濁瘀毒等病理產(chǎn)物留伏于腎絡(luò)，絡(luò)脈細(xì)小，易入難出，易積成形，日久痹阻腎絡(luò)，致腎絡(luò)瘀阻。本課題組從中醫(yī)“絡(luò)病”理論出發(fā)，結(jié)合MN的發(fā)病特點(diǎn)提出“邪伏腎絡(luò)、腎絡(luò)瘀阻”為MN的核心病機(jī)，在此病機(jī)理論指導(dǎo)下提出“疏通腎絡(luò)”為治療關(guān)鍵，創(chuàng)立益腎通絡(luò)方。

方中黃芪、黨參、炒白術(shù)健脾益氣，補(bǔ)氣升提，脾健精微得升，水濕得運(yùn)，升清降濁同時(shí)利濕消腫；仙靈脾溫腎陽(yáng)，固腎氣，腎陽(yáng)得溫能行其溫陽(yáng)化氣利水之功，腎氣得固能行其封藏固攝之本，使精微得固，水濕得化。絞股藍(lán)袪濁化痰，使有形之邪得除，脾陽(yáng)得振，氣機(jī)得復(fù)，絡(luò)脈得通。四藥配伍應(yīng)用，扶人體之本虛，袪留伏之濁邪。莪術(shù)、當(dāng)歸破血行氣、逐瘀消癥，祛腎絡(luò)有形之瘀滯；地龍、水蛭入絡(luò)搜剔、松透病根，通經(jīng)活絡(luò)，絡(luò)脈暢通，邪有出路。諸藥合用健脾氣、補(bǔ)腎氣、袪痰邪、化瘀濁、通腎絡(luò)，扶正不留邪，祛邪不傷正。本課題組前期研究證實(shí)，益腎通絡(luò)方可以明顯改善MN患者臨床癥狀，減輕MN大鼠腎臟病理?yè)p傷。

ADAM在質(zhì)膜上裂解多種跨膜蛋白，這一過(guò)程稱為胞外域脫落。ADAM17，也稱為TNF-α轉(zhuǎn)化酶，是用于釋放多種膜錨定底物的主要脫落酶，已有研究證實(shí)ADAM17具有促炎和促纖維化作用，表明它可能是慢性腎臟?。╟hronic kidney disease，CKD）進(jìn)展的重要介質(zhì)。ADAM17釋放的膜錨定底物包括TNF-α和EGFR配體[11]，其中2種主要的底物TNF-α和HB-EGF是腎臟損害的重要介體[5]。TNF-α是一種炎性細(xì)胞因子，是腎臟損傷的主要驅(qū)動(dòng)力，可促進(jìn)炎癥、細(xì)胞凋亡和腎小球屏障損害[12]。HB-EGF可誘導(dǎo)腎小球纖連蛋白的產(chǎn)生，介導(dǎo)腎小球硬化和腎間質(zhì)纖維化[13]。

腎臟ADAM17激活導(dǎo)致促炎和促纖維化因子TNF-α、HB-EGF釋放，它們的胞外域脫落與病理因素密切相關(guān)，包括炎癥、間質(zhì)纖維化和腎損傷[5-6]。胞外域脫落后，這些配體與受體結(jié)合，從而導(dǎo)致下游信號(hào)傳導(dǎo)。HB-EGF是EGFR轉(zhuǎn)錄激活的關(guān)鍵介體，HB-EGF釋放后通過(guò)自分泌或旁分泌的方式激活EGFR。另外，脫落活化的TNF-α通過(guò)與其受體TNFR結(jié)合刺激c-Src磷酸化，磷酸化的c-Src再反式激活EGFR[14]，TNF-α通路的串?dāng)_會(huì)強(qiáng)烈增強(qiáng)EGFR激活的效果，進(jìn)一步加重EGFR激活誘發(fā)的損傷作用。持續(xù)性EGFR激活足以引發(fā)腎小管功能障礙和腎間質(zhì)纖維化[15]（圖5）。

蛋白尿是腎小管損傷的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，腎小管細(xì)胞長(zhǎng)時(shí)間暴露于白蛋白會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，細(xì)胞凋亡促進(jìn)了纖維化進(jìn)程[16]。益腎通絡(luò)方是經(jīng)研究證實(shí)的治療MN療效確切的中藥組方，既往動(dòng)物實(shí)驗(yàn)量效關(guān)系研究證實(shí)中等劑量（臨床等效劑量）的益腎通絡(luò)方足以達(dá)到最佳治療效果，故本研究以益腎通絡(luò)方中劑量進(jìn)行進(jìn)一步研究。研究發(fā)現(xiàn)蛋白尿促進(jìn)了腎小管細(xì)胞凋亡的發(fā)生，同時(shí)腎組織ADAM17活性增加，進(jìn)而脫落釋放的TNF-α、HB-EGF增多，活化的TNF-α、HB-EGF進(jìn)一步激活EGFR，EGFR被持續(xù)激活，進(jìn)一步觸發(fā)促炎和促纖維化因子的合成和釋放，導(dǎo)致細(xì)胞損傷、凋亡和纖維化。近端小管細(xì)胞中EGFR的持續(xù)活化是CKD進(jìn)行性腎臟纖維化的標(biāo)志，ADAM17從受損的近端小管細(xì)胞中釋放活性可溶性EGFR配體胞外域，EGFR配體通過(guò)誘導(dǎo)近端小管中EGFR的重新激活來(lái)誘導(dǎo)持續(xù)的EGFR激活[17]。與以往研究相似[18]，有腎小管間質(zhì)纖維化的梗阻性腎病、慢性腎小球腎炎和糖尿病腎病患者腎小管和間質(zhì)ADAM17表達(dá)顯著增加，EGFR活化的增加，并且所有患者腎組織樣本中纖維化標(biāo)志物的表達(dá)量與ADAM17呈顯著正相關(guān)。益腎通絡(luò)方干預(yù)后腎小管細(xì)胞凋亡減少，腎臟纖維化減輕，同時(shí)ADAM17及其底物TNF-α、HB-EGF表達(dá)減少，并且p-EGFR也相應(yīng)下降，表明益腎通絡(luò)方對(duì)腎小管細(xì)胞凋亡的干預(yù)作用可能與抑制上述信號(hào)分子有關(guān)。

圖5 ADAM17介導(dǎo)EGFR激活誘導(dǎo)腎小管細(xì)胞凋亡

本研究表明，ADAM17通過(guò)EGFR信號(hào)傳導(dǎo)途徑在纖維化和炎性腎臟疾病中具有重要作用，并證實(shí)了EGFR配體HB-EGF和TNF-α對(duì)EGFR激活的重要意義。ADAM17介導(dǎo)的HB-EGF/TNF-α-EGFR途徑共同作用以介導(dǎo)損傷后的腎纖維化，并確定ADAM17及其依賴性途徑是預(yù)防或治療CKD腎纖維化的可能新靶標(biāo)。保護(hù)腎小管細(xì)胞免受蛋白尿相關(guān)的細(xì)胞毒性可能是對(duì)其他療法抵抗的腎病患者的下一個(gè)治療靶點(diǎn)。強(qiáng)調(diào)CKD中關(guān)注足細(xì)胞損傷同時(shí)也要注意腎小管細(xì)胞損傷，保護(hù)足細(xì)胞和腎小管細(xì)胞兩者結(jié)合可能使患者有更大的獲益。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Yishen Tongluo interferes with renal tubular epithelial cell apoptosis in membranous nephropathy by down-regulating ADAM17-mediated EGFR expression

CHEN Su-zhi1, LI Yong-zhang1, YANG Feng-wen1, TAN Miao2, SONG Lei3, TAN Jin-chuan1

1. Hebei Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine, Shijiazhuang 050011, China 2. The Fourth Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang 050011, China 3. Tianjin University of Traditional Chinese Medicine, Tianjin 301617, China

To explore the relationship between a disintegrin and metalloproteinase 17 (ADAM17)-mediated epidermal growth factor receptor (EGFR) activation and membranous nephropathy (MN) renal tubular epithelial cell apoptosis and the intervention effect of Yishen Tongluo Recipe (益腎通絡(luò)方).MN rats model was constructed by tail iv cationic bovine serum albumin (C-BSA), Yishen Tongluo Recipe was given for 4 weeks. After the experiment, the pathological changes of kidney and apoptosis of renal tubular epithelial cells in rats were observed. Western blotting and qRT-PCR were used to detect protein and mRNA expressions of ADAM17, heparin-binding epidermal growth factor (HB-EGF), tumor necrosis factor-α (TNF-α) and phosphorylation epidermal growth factor receptor (p-EGFR).Compared with control group, the pathological changes in kidneys of rats in model group were severe, the apoptosis of renal tubular epithelial cells were increased (< 0.01), protein and mRNA expressions of ADAM17, p-EGFR, HB-EGF and TNF-α in renal tissue were significantly increased (< 0.01). Compared with model group, the kidney pathology of rats was improved after the intervention of Yishen Tongluo Recipe, the apoptosis of renal tubular cells was reduced (< 0.01), protein and mRNA expressions of ADAM17, p-EGFR, HB-EGF and TNF-α were decreased in renal tissue (< 0.01).ADAM17 expression in kidney tissue of MN rats is increased, and more HB-EGFR and TNF-α are released and activated, then activate the corresponding receptor EGFR, the activated EGFR further induce apoptosis of renal tubular epithelial cells and renal fibrosis. Yishen Tongluo Recipe can reduce the shedding and activation of HB-EGFR and TNF-α by reducing the expression of cleaving enzyme ADAM17 in kidney tissue of MN rats, thereby reducing the activation of EGFR, so as to reduce the apoptosis of renal tubular epithelial cells and delay renal fibrosis.

membranous nephropathy; ADAM17/EGFR; renal tubular cells; apoptosis; Yishen Tongluo Recipe

R285.5

A

0253 - 2670(2021)24 - 7520 - 07

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.24.014

2021-04-08

河北省自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目（H2020423049）；河北省中醫(yī)藥管理局科研計(jì)劃項(xiàng)目（2021008）

陳素枝（1989—），女，主治醫(yī)師，醫(yī)學(xué)博士，從事中西醫(yī)治療慢性腎臟病的研究。Tel: 18830657300 E-mail: 781506436@qq.com

檀金川（1964—），主任醫(yī)師，醫(yī)學(xué)博士，從事中西醫(yī)治療慢性腎臟病的研究。Tel: 13831187910 E-mail: 781506436@qq.com

[責(zé)任編輯 李亞楠]