黃獨(dú)赤霉素受體基因DbGID1s克隆及生物信息學(xué)分析

唐文芳 徐升勝 龍雯虹

摘要：【目的】克隆黃獨(dú)赤霉素受體（GID1）基因DbGID1s，并對其進(jìn)行生物學(xué)信息分析，為深入探究DbGID1s蛋白在黃獨(dú)生長發(fā)育中的作用機(jī)制提供理論參考?！痉椒ā坎捎肦T-PCR技術(shù)克隆DbGID1s基因，利用生物信息學(xué)軟件對其理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)域、磷酸化位點(diǎn)及系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化進(jìn)行預(yù)測分析?！窘Y(jié)果】克隆獲得4個(gè)DbGID1s基因序列，命名為DbGID1A、DbGID1B1、DbGID1B2和DbGID1C，GenBank登錄號(hào)為MT648372、MT648374、MT648375和MT648373，長度分別為862、1273、1081和1164 bp，編碼292、340、289和360個(gè)氨基酸殘基。4個(gè)DbGID1s蛋白的分子量為32079.17～40301.83 Da，理論等電點(diǎn)（pI）為6.05～8.62，為不穩(wěn)定的外在膜親水性蛋白，不存在信號(hào)肽序列，其磷酸化位點(diǎn)主要以絲氨酸（Ser，S）為主，且4個(gè)蛋白的磷酸位點(diǎn)均有重合位點(diǎn)和突變位點(diǎn)，不僅具有α/β折疊水解酶超級(jí)家族羧酸脂肪酶水解活性區(qū)域，還具有激素脂肪酶（HSL）的保守結(jié)構(gòu)域（HGG和GXSXG）和催化聯(lián)合位點(diǎn)（S、D和H）。DbGID1s蛋白與其他植物GID1蛋白序列具有較高的氨基酸序列相似性，其中與山藥的相似性達(dá)90%以上?！窘Y(jié)論】DbGID1s基因具有多種植物GID1 基因的基本特征，其編碼的蛋白具有GID1蛋白典型的結(jié)構(gòu)域，其可能參與赤霉素（GA）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，調(diào)節(jié)黃獨(dú)的生長發(fā)育。

關(guān)鍵詞： 黃獨(dú);赤霉素受體（GID1）;基因克隆;生物信息學(xué)分析

中圖分類號(hào)： S567.239 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：2095-1191（2021）08-2053-08

Cloning and bioinformatics analysis of gibberellin insensitive dwarf1 gene DbGID1s in ?Dioscorea bulbiferas

TANG Wen-fang， XU Sheng-sheng， LONG Wen-hong*

（College of Landscape and Horticulture，Yunnan Agricultural University，Kunming ?650201，China）

Abstract：【Objective】The aim of this study was to clone gibberellin insensitive dwarf1（GID1） gene DbGID1s in Dio-scorea bulbifera，conduct bioinformatics analysis，and to provide a theoretical reference for further exploring the mechanism of DbGID1s protein in the growth and development of D. bulbifera. 【Method】DbGID1s were cloned by RT-PCR method; the physical and chemical properties， domains， phosphorylation sites and phylogenetic evolution of these genes were pridicted with bioinformatics softwares. 【Result】Four sequences of gene DbGID1A were obtained， namely DbGID1A （GenBank accession number：MT648372），DbGID1B1 （GenBank accession number：MT648374），DbGID1B2（GenBank accession number：MT648375） and DbGID1C （GenBank accession number：MT648373） . The lengths of four nucleic acid sequences were 862，1273，1081 and 1164 bp，respectively， ?and encoding 292，340，289 and 360 amino acids residues，respectively. The molecular weights of the four DbGID1s proteins were 32079.17-40301.83 Da， and their theoretical isoelectric points（pI） varied from 6.05 to 8.62. They were unstable，hydrophilic proteins and located on external membrane. No signal peptide was found in the four DbGID1s proteins. Their phosphorylation sites were mainly serine （Ser， S）， and the phosphorylation sites of the four proteins had coincidence sites and mutation sites. The four proteins not only had the hydrolytic activite area of α/β folding hydrolase superfamily carboxylic acid lipase， but also had conserved domains （HGG and GXSXG） and catalytic joint sites（S， D and H） of hormone lipase （HSL）. The similarity of proteins between D. bulbifera and other species was high，and the homology between D. bulbifera and yam was over 90%. 【Conclusion】The DbGID1s gene in D. bulbifera has the basic characteristics of GID1 genes in many plants and the encoded proteins have the typical domain of GID1 protein， so it is possible that DbGID1s genes participate in gibberellin signal transduction and regulate the growth and development of organs of D. bulbifera.

1. 4 生物信息學(xué)分析

利用NCBI進(jìn)行同源比對;對4個(gè)基因序列進(jìn)行多重比對分析;NCBI ORFfinder在線分析4個(gè)基因開放閱讀框（ORF）編碼的氨基酸序列;利用NCBI的CCD（Conserved domain）在線分析4個(gè)基因編碼蛋白的保守結(jié)構(gòu)域，利用ExPASy的ProtParam在線分析氨基酸序列;運(yùn)用ProtScale預(yù)測蛋白的親/疏水性;使用TMHMM Serverv 2.0分析蛋白的跨膜區(qū);使用SignalP 4.1對蛋白的信號(hào)肽進(jìn)行預(yù)測分析;利用SOPMA和SWISS-MODEL預(yù)測分析蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu);NetPhos 3.1在線預(yù)測蛋白的磷酸化位點(diǎn);下載與DbGID1s基因序列相似性較高的其他植物基因序列，并對其CDS序列進(jìn)行多重比對，利用Clustal X和MAGA 7.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹（孫偉博等，2018）。

2 結(jié)果與分析

2. 1 總RNA提取和cDNA合成結(jié)果

由圖1-A可知，利用植物總RNA提取試劑盒提取的黃獨(dú)嫩葉總RNA條帶清晰，且完整性較好。利用微量分光光度計(jì)測定總RNA樣品A260和A280值，計(jì)算RNA純度（A260/A280）平均值為1.98，表明提取的RNA樣品可用于后續(xù)試驗(yàn)。利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成的cDNA第一鏈條帶較清晰（圖1-B），可用于后續(xù)試驗(yàn)。

2. 2 DbGID1s基因克隆結(jié)果

以cDNA為模板，利用設(shè)計(jì)的4對引物PCR擴(kuò)增出4個(gè)序列（圖2）。經(jīng)純化和測序分析，發(fā)現(xiàn)4個(gè)序列長度分別為862、1273、1081和1164 bp。

2. 3 DbGID1s基因序列分析結(jié)果

利用NCBI的BLASTx對擴(kuò)增出的4個(gè)序列進(jìn)行比對分析，確定4個(gè)序列均為DbGID1s基因，其多重比對結(jié)果圖3所示。4個(gè)DbGID1s基因序列間的相似性為48.06%，表明4個(gè)基因序列為GID1基因家族的不同成員，分別命名為DbGID1A、DbGID1B1、DbGID1B2和DbGID1C，GenBank登錄號(hào)依次為MT648372、MT648374、MT648375和MT648373，分別編碼292、340、289和360個(gè)氨基酸殘基。NCBI的CCD預(yù)測結(jié)果顯示，DbGID1s蛋白屬于水解酶超級(jí)家族羧酸脂肪酶家族，具有該家族水解活性區(qū)域。

2. 4 DbGID1s蛋白的生物信息學(xué)分析結(jié)果

2. 4. 1 理化性質(zhì) 由表2可知，4個(gè)DbGID1s蛋白的分子量為32079.17～40301.83 Da，理論等電點(diǎn)（pI）為6.05～8.62，負(fù)電荷殘基（Asp+Glu）總數(shù)為30～38，正電荷殘基（Arg+Lys）總數(shù)為26～38;DbGID1A和DbGID1C蛋白為不穩(wěn)定的堿性蛋白，DbGID1B1和DbGID1B2蛋白為不穩(wěn)定的酸性蛋白;DbGID1A、DbGID1B1、DbGID1B2和DbGID1C總體平均親水性GRAVY值分別為-0.295、 -0.099、-0.200和-0.209，表明DbGID1s蛋白為親水性蛋白;DbGID1s蛋白均位于膜外，為外在膜蛋白，且不存在信號(hào)肽序列。

2. 4. 2 二、三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果 由表3可知，4個(gè)DbGID1s蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)均具有α-螺旋、β-折疊、延伸鏈、無規(guī)則卷曲，其中均以α-螺旋和無規(guī)則卷曲為主要元件。由圖4可知，DbGID1A、DbGID1B1和DbGID1C蛋白與建模殘基序列（2zsh.1.A）的相似性分別為73.36%（286aa）、64.97%（331aa）和70.55%（347aa），而DbGID1B2蛋白與建模殘基序列（3ebl.1.A）的相似性為71.06%（234aa）。DbGID1A蛋白的三級(jí)核心結(jié)構(gòu)由8條β-折疊和9個(gè)α-螺旋組成，DbGID1B1蛋白的三級(jí)核心結(jié)構(gòu)由8條β-折疊和10個(gè)α-螺旋組成，DbGID1B2蛋白的三級(jí)核心結(jié)構(gòu)由8條β-折疊和7個(gè)α-螺旋組成，DbGID1C蛋白的三級(jí)核心結(jié)構(gòu)由8條β折疊和11個(gè)α-螺旋組成?？梢?，DbGID1家族的2個(gè)建模具有相同的β-折疊。此外，由于2zsh.1.A具有GA3 GID1-DELLA晶體結(jié)構(gòu)，3ebl.1.A具有水稻GID1與GA4復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)，因此，DbGID1A、DbGID1B1和DbGID1C蛋白具有GA3 GID1-DELLA晶體結(jié)構(gòu)，DbGID1B1蛋白具有水稻GID1與GA4復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)。結(jié)合基因序列的CCD預(yù)測結(jié)果和蛋白預(yù)測結(jié)果可得出4個(gè)DbGID1s蛋白屬于α/β折疊水解酶超級(jí)家族羧酸脂肪酶家族。

2. 4. 3 結(jié)構(gòu)域預(yù)測結(jié)果 將DbGID1s蛋白與6個(gè)物種的同源蛋白進(jìn)行氨基酸序列多重比對，結(jié)果如圖5-A所示。DbGID1s蛋白與其他物種GID1蛋白具有較高的氨基酸序列相似性，且其具有保守序列，如激素酶感酯酶（Hormone sensitive lipase，HSL）的HGG和GXSXG活性區(qū)域，及HSL家族催化位點(diǎn)的保守氨基酸即絲氨酸（Ser，S）和天冬氨酸（Asp，D），但DbGID1s蛋白的HSL家族催化位點(diǎn)即組氨酸（His，H）被異亮氨酸（Ile，I）取代。

2. 4. 4 磷酸化位點(diǎn)預(yù)測結(jié)果 將4個(gè)DbGID1s蛋白進(jìn)行多重比較，結(jié)果（圖5-B）發(fā)現(xiàn)其同源性較高。利用NetPhos在線預(yù)測DbGID1s蛋白中的絲氨酸（Ser，S）、蘇氨酸（Thr，T）和酪氨酸（Tyr，Y）磷酸化位點(diǎn)，結(jié)果（圖5-B）顯示，DbGID1A、DbGID1B1、DbGID1B2和DbGID1C蛋白磷酸化位點(diǎn)分別為23、21、34和31個(gè)，其中，絲氨酸位點(diǎn)最多，分別為16、14、22和16個(gè);蘇氨酸位點(diǎn)分別為3、4、6和8個(gè);酪氨酸位點(diǎn)分別為4、3、6和7個(gè)。可見，DbGID1s蛋白的磷酸化位點(diǎn)主要以絲氨酸為主，且4個(gè)蛋白的磷酸位點(diǎn)均有重合位點(diǎn)和突變位點(diǎn)。

2. 4. 5 系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化分析結(jié)果 利用最大近似法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，結(jié)果如圖6所示。4個(gè)DbGID1s蛋白與山藥GID1蛋白的親緣關(guān)系最近，氨基酸序列相似性達(dá)90%以上。其中，DbGID1A蛋白與山藥DpGID1A蛋白相似性最高，處于同一小分支，與其他的GID1蛋白（除小立碗蘚GID1以外）并列;其余3個(gè)DbGID1s蛋白與山藥GID1B1均處于同一個(gè)分支，其中，DbGID1B1與山藥GID1B1的氨基酸序列相似性最高。推測DbGID1A基因與另外3個(gè)基因的分化可能早于雙子葉植物與單子葉植物的分化。

3 討論

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)特異性信號(hào)肽具有促進(jìn)植物膜蛋白表達(dá)的作用（Boehm et al.，2000）。本研究生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示，DbGID1s不存在信號(hào)肽序列和跨膜結(jié)構(gòu)域，說明DbGID1s為非分泌性蛋白，可直接在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用;DbGID1s蛋白不僅不穩(wěn)定，而且不耐熱，其表達(dá)、純化及保存應(yīng)在低溫下進(jìn)行;DbGID1s為親水蛋白，較易溶于水溶液，可依據(jù)等電點(diǎn)配置適合的酸堿緩沖液，有利于表達(dá)模型的創(chuàng)建及細(xì)胞試驗(yàn)等方面的應(yīng)用。此外，磷酸化是蛋白質(zhì)翻譯后修飾之一，可有效調(diào)控蛋白活力和功能，并在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中起重要作用。蛋白的磷酸化位點(diǎn)（S、T、Y）在GA信號(hào)傳導(dǎo)中發(fā)揮非常重要作用，分析磷酸化位點(diǎn)的變異規(guī)律有助于在合理歸類的基礎(chǔ)上探究蛋白質(zhì)翻譯后修飾調(diào)控的機(jī)制（梁前進(jìn)等，2012）。本研究通過磷酸化位點(diǎn)預(yù)測發(fā)現(xiàn)DbGID1s蛋白的氨基酸序列含有多個(gè)磷酸化位點(diǎn)，為研究GA在黃獨(dú)體內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)提供理論依據(jù)。

據(jù)前人研究報(bào)道，GID1蛋白是一類含HGG和GXSXG保守結(jié)構(gòu)域的激素敏感脂肪酶受體，在植物生長發(fā)育過程中起重要調(diào)控作用（Shimada et al.，2008;Sun，2010）。HSL蛋白具有特殊的活性結(jié)構(gòu)域（HGG和GXSXG），不僅維持蛋白功能，還維持GA的穩(wěn)態(tài)并調(diào)節(jié)GA與其他植物激素之間的相互作用（Aleman et al.，2008）;HSL家族蛋白還具有3種保守氨基酸（S、D和H）的催化聯(lián)合位點(diǎn)，其對蛋白功能至關(guān)重要（Ueguchi-Tanaka et al.，2005）。由于GID1蛋白具有HSL蛋白的保守結(jié)構(gòu)域和催化聯(lián)合位點(diǎn)，故GID1蛋白具有HSL蛋白的生物學(xué)功能，可維持GA穩(wěn)態(tài)，并調(diào)節(jié)GA與其他植物激素之間的相互作用（Ileperuma et al.，2007）。DbGID1s蛋白屬于α/β折疊水解酶超級(jí)家族，與HSL家族蛋白結(jié)構(gòu)相似，推測DbGID1s蛋白具有HSL蛋白的功能。宋松泉等（2020）研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥GID1a具有調(diào)控種子休眠的功能，且在種子萌發(fā)過程中，GA的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有可能受GA受體基因類型決定。本研究發(fā)現(xiàn)，DbGID1s蛋白的結(jié)構(gòu)域與擬南芥GID1a的結(jié)構(gòu)域較一致（圖5），故推測DbGID1s蛋白具有調(diào)控黃獨(dú)組織休眠的功能;DbGID1s蛋白存在2種三級(jí)結(jié)構(gòu)建模（圖3），故推測黃獨(dú)塊莖組織萌發(fā)中可能存在2種GA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。今后應(yīng)深入探究DbGID1s蛋白在2種GA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的作用機(jī)制，并深入解析塊莖組織休眠和萌發(fā)機(jī)制。

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（責(zé)任編輯 陳 燕）

收稿日期：2020-08-13

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31460322）

通訊作者：龍雯虹（1972-），https：//orcid.org/0000-0001-6919-6038，博士，副教授，主要從事蔬菜育種、資源評價(jià)與利用研究工作，E-mail：lwh57@sina.com

第一作者：唐文芳（1995-），https：//orcid.org/0000-0002-8752-2324，研究方向?yàn)槭卟速Y源評價(jià)與利用，E-mail：T2676630889@126.com