半乳糖凝集素-1對(duì)高氧誘導(dǎo)急性肺損傷新生鼠的保護(hù)作用及機(jī)制研究

李萌萌，王 寧

(西安大興醫(yī)院兒科，陜西 西安 710016)

急性肺損傷(Acute lung injury，ALI)指由各種直接或間接致傷因素引起的肺泡組織損傷，可導(dǎo)致急性低氧性呼吸功能不全，嚴(yán)重者可發(fā)展為急性呼吸窘迫綜合征(Acute respiratory distress syndrome，ARDS)，并最終導(dǎo)致患者多器官功能衰竭甚至死亡[1-2]。其發(fā)病機(jī)制尚不明確，目前較為公認(rèn)的機(jī)制為各種因素誘導(dǎo)肺內(nèi)大量炎癥因子激活和釋放，從而導(dǎo)致肺泡上皮細(xì)胞和毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞受損，肺內(nèi)皮細(xì)胞通透性增加，引發(fā)肺水腫，進(jìn)而影響肺換氣效能[3]。目前臨床對(duì)ALI的治療方案主要通過(guò)機(jī)械通氣以維持氧供，并給予表面活性劑、糖皮質(zhì)激素、抗生素及抗氧化劑等對(duì)癥治療，并無(wú)特效藥物[4]。半乳糖凝集素-1(Galectin-1，Gal-1)是凝集素超級(jí)家族中的重要成員，在心、腦、肺、腎、淋巴結(jié)等多種組織器官，以及內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、骨髓基質(zhì)細(xì)胞等不同類型細(xì)胞中均廣泛表達(dá)，在細(xì)胞黏附、細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)、腫瘤轉(zhuǎn)移等眾多生理病理過(guò)程中均發(fā)揮重要作用[5-6]。研究[7-8]發(fā)現(xiàn)，Gal-1呈現(xiàn)獨(dú)特的抗炎和抗氧化應(yīng)激作用，因此本研究將Gal-1用于高氧誘導(dǎo)的ALI大鼠的治療，觀察其對(duì)肺損傷大鼠肺組織的保護(hù)作用，并探究其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 足月新生Wistar大鼠30只，由南京青龍山動(dòng)物繁殖場(chǎng)提供，許可證號(hào)為SCXK(蘇)2019-0906，飼養(yǎng)于恒溫(21～26 ℃)、恒濕(45%～65%)的潔凈動(dòng)物房?jī)?nèi)，間隔12 h日夜循環(huán)，給予自由進(jìn)食、飲水。

1.2 主要試劑 Gal-1(批號(hào)：1152-GA/CF)購(gòu)自美國(guó)R&D公司；4%多聚甲醛溶液(批號(hào)：180813)購(gòu)自康迪斯化工(湖北)有限公司；活性氧(ROS)檢測(cè)試劑盒(批號(hào)：190725)購(gòu)自武漢富鑫遠(yuǎn)科技有限公司；BCA蛋白檢測(cè)試劑盒(批號(hào)：A72430FA9)購(gòu)自上海吉至生化科技有限公司；總RNA提取試劑盒(批號(hào)：WXBC8980V)購(gòu)自上海吉至生化科技有限公司；TRIzol試劑(批號(hào)：50175111)購(gòu)自美國(guó)賽默飛世爾科技公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(批號(hào)：00217889)購(gòu)自美國(guó)Fermentas公司；核因子E2相關(guān)因子2(Nrf2)、 血紅素氧合酶-1(HO-1)、醌氧化還原酶-1(NQO-1)、 磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶(pAMPK)、腺苷酸激活蛋白激酶(AMPK)等試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒(批號(hào)：E-EL-0033c)購(gòu)自武漢伊萊瑞特生物科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 造模、分組及給藥方案：將30只足月新生Wistar大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、高氧組和高氧+Gal-1組，每組10只。對(duì)照組大鼠自由呼吸常壓空氣。高氧組和高氧+Gal-1組大鼠置于玻璃材質(zhì)高氧箱中，底部鋪入鈉石灰以吸收箱內(nèi)CO2，保持CO2濃度<0.5%，持續(xù)向箱內(nèi)通入醫(yī)用氧氣，用測(cè)氧儀每日檢測(cè)氧濃度3次，確保其中氧濃度≥85%。高氧+Gal-1組大鼠在置于高氧箱前1 h腹腔注射3 μg Gal-1溶液。各組大鼠均在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始12 h以后處死，進(jìn)行取樣分析。

1.3.2 組織學(xué)觀察：處死大鼠后，取部分左肺組織置于4%多聚甲醛溶液中室溫放置48 h，脫水、包埋、制作石蠟切片后進(jìn)行蘇木精-伊紅(HE)染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察組織形態(tài)。

1.3.3 肺干濕比(W/D)測(cè)量：以4 ℃ PBS緩沖液緩慢沖洗肺循環(huán)，分離左肺后迅速稱重，記錄濕肺重量。將濕肺置于80 ℃烘箱中烘干72 h后再次稱重，記錄干肺重量。最后，計(jì)算W/D值。

1.3.4 支氣管肺泡灌洗液(BALF)采集：處死大鼠后，通過(guò)氣管向肺內(nèi)緩慢注入4 ℃ PBS緩沖液1 ml，再緩慢抽出，反復(fù)3次，最后一次抽出的液體即為BALF，在4 ℃下以1500 r/min離心10 min，取上清-80 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.5 BALF中炎癥因子測(cè)定：采用ELISA檢測(cè)BALF中腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)和白介素-6(IL-6)的表達(dá)水平。

1.3.6 ROS、超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)測(cè)定：取部分左肺組織，稱重后加入PBS緩沖液制備成10%勻漿，4000 r/min離心10 min。取上清，采用熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)ROS表達(dá)水平，采用黃嘌呤氧化酶(XOD)法檢測(cè)SOD濃度，采用硫代巴比妥酸(TBA)法檢測(cè)MDA濃度。所有操作均嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.3.7 Nrf2、 HO-1、NQO-1 mRNA檢測(cè)：采用TRIzol試劑提取肺組織RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA文庫(kù)，以β-actin為內(nèi)參，計(jì)算各個(gè)基因的相對(duì)表達(dá)水平。引物序列見(jiàn)表1。

表1 各基因引物序列

1.3.8 Nrf2、AMPK蛋白表達(dá)檢測(cè)：取部分肺組織，PBS洗滌3次，剪碎后過(guò)200目鋼篩研磨。收集研磨后的肺組織加入裂解液，提取組織中總蛋白，按試劑盒說(shuō)明書(shū)采用Western blot測(cè)定各蛋白表達(dá)水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用t檢驗(yàn)或方差分析，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 三組大鼠肺組織病理學(xué)形態(tài)比較 對(duì)照組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)規(guī)則完整，肺泡大小一致、間隔均勻，無(wú)水腫肺泡，無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。高氧組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)紊亂，肺泡管腔增大，肺間質(zhì)呈現(xiàn)充血或出血樣改變，有大量纖維滲出或炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。高氧+Gal-1組可見(jiàn)少量纖維滲出或炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡損傷程度介于對(duì)照組和高氧組之間。

2.2 三組大鼠肺W/D值比較 見(jiàn)圖1。與對(duì)照組相比，高氧組肺W/D值明顯升高(P<0.05)。而高氧+Gal-1組大鼠因使用Gal-1預(yù)處理，肺W/D值低于高氧組(P<0.05)。

2.3 三組大鼠炎癥因子表達(dá)水平比較 見(jiàn)圖1。高氧組大鼠BALF中TNF-α、IL-1β和IL-6的表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組，而經(jīng)Gal-1預(yù)處理的高氧+Gal-1組大鼠TNF-α、IL-1β和IL-6的表達(dá)水平則顯著低于高氧組(均P<0.05)。

注：與對(duì)照組相比，*P<0.05；與高氧組相比，#P<0.05

2.4 三組大鼠ROS、SOD、MDA表達(dá)水平比較 見(jiàn)表2。高氧組大鼠肺組織中ROS和MDA的表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組，SOD的表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組(均P<0.05)。用Gal-1預(yù)處理的高氧+Gal-1組大鼠ROS和MDA的表達(dá)水平顯著低于高氧組，SOD的表達(dá)水平顯著高于高氧組(均P<0.05)。

表2 三組大鼠ROS、SOD、MDA表達(dá)水平比較

2.5 三組大鼠Nrf2、 HO-1、NQO-1 mRNA表達(dá)水平比較 見(jiàn)圖2。與對(duì)照組和高氧組相比，高氧+Gal-1組大鼠肺組織中Nrf2 mRNA的表達(dá)水平顯著升高(均P<0.05)。另外，高氧+Gal-1組Nrf2下游基因HO-1和NQO-1的表達(dá)水平也顯著高于對(duì)照組和高氧組(均P<0.05)。

2.6 三組大鼠pAMPK/AMPK和Nfr2蛋白表達(dá)水平比較 見(jiàn)圖3。高氧+ Gal-1組pAMPK/AMPK表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組和高氧組(均P<0.05)。高氧+Gal-1組Nfr2蛋白的表達(dá)水平顯著高于高氧組(P<0.05)；而在AMPK抑制劑Compound C(Com C)存在的情況下，高氧+Gal-1+Com C組Nfr2蛋白的表達(dá)水平顯著低于高氧+Gal-1組(P<0.05)。

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與高氧組比較，#P<0.05；與高氧+Gal-1組比較，△P<0.05

3 討 論

ALI及其嚴(yán)重形式ARDS均為臨床常見(jiàn)危重疾病，患者肺泡上皮細(xì)胞及毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞受損，導(dǎo)致彌漫性肺間質(zhì)及肺泡水腫，表現(xiàn)為低氧合、低肺順應(yīng)性、高生理死腔和通氣/血流比失調(diào)等的病理生理特征[9]，患者住院時(shí)間長(zhǎng)、病死率高。半乳糖凝集素在機(jī)體的先天性和適應(yīng)性免疫應(yīng)答中均起到關(guān)鍵作用[10]。Correa等[11]研究表明，外源性Gal-1可通過(guò)抑制硝基酪氨酸的表達(dá)來(lái)減輕腎臟的氧化應(yīng)激，從而減弱由缺血再灌注導(dǎo)致的腎臟損傷。Abebayehu等[12]研究顯示，Gal-1可通過(guò)促使巨噬細(xì)胞向M2表型分化，從而對(duì)抗ALI的發(fā)生與發(fā)展。本研究中，Gal-1預(yù)處理的大鼠肺部組織結(jié)構(gòu)與高氧組相比較為規(guī)則完整，纖維滲出或炎性細(xì)胞浸潤(rùn)均較少，肺泡損傷程度更輕；同時(shí)，高氧+Gal-1組大鼠肺泡W/D值顯著低于高氧組，表明Gal-1可有效改善高氧誘導(dǎo)的ALI。

炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激在ALI的發(fā)生與發(fā)展中起重要作用。高氧暴露下機(jī)體產(chǎn)生大量 ROS，后者具有高度氧化活性，可氧化酶、核酸、結(jié)構(gòu)蛋白等，從而導(dǎo)致肺泡毛細(xì)血管膜的破壞和上皮細(xì)胞的死亡，進(jìn)而造成肺泡水腫和血氧交換受阻[13]。SOD對(duì)于防止氧化應(yīng)激至關(guān)重要，其可通過(guò)抗氧化和抗自由基的功能有效抵御氧自由基對(duì)機(jī)體的損傷[14]。MDA在機(jī)體內(nèi)的表達(dá)水平可體現(xiàn)體內(nèi)氧自由基的水平，進(jìn)而反映機(jī)體氧化應(yīng)激的損傷程度[15]。本研究中，經(jīng)Gal-1預(yù)處理的高氧+Gal-1組大鼠BALF中的TNF-α、IL-1β、IL-6、ROS和MDA的表達(dá)水平顯著低于高氧組，SOD的表達(dá)水平顯著高于高氧組，提示Gal-1可減輕高氧誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激，從而起到改善ALI的作用。

Nrf2是廣泛存在于動(dòng)物體內(nèi)的防御氧化應(yīng)激的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，可與抗氧化反應(yīng)元件(ARE)相結(jié)合而啟動(dòng)器下游抗氧化基因，如HO-1和NQO-1等，從而抵御各種原因?qū)е碌募?xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激狀態(tài)[16]。Lei等[17]和Chen等[18]研究均顯示，增強(qiáng)Nrf2的活化可有效減輕小鼠ALI的損傷程度。本研究中，Gal-1預(yù)處理有效增強(qiáng)了ALI大鼠Nrf2表達(dá)，并同時(shí)顯著提高了Nrf2下游基因HO-1和NQO-1表達(dá)，提示Gal-1可通過(guò)Nfr2通路改善ALI大鼠的氧化應(yīng)激狀態(tài)。

AMPK是由三條肽鏈組成的絲/蘇氨酸蛋白激酶，是人體能量代謝的重要調(diào)控劑，與促進(jìn)分解代謝、抑制合成代謝、改善內(nèi)皮功能、減輕炎癥反應(yīng)和抑制氧化還原反應(yīng)等多項(xiàng)功能密切相關(guān)[19]。已有研究[20]表明，AMPK可通過(guò)磷酸化等方式激活Nrf2，使其活化并生成下游抗氧化基因如HO-1、NQO-1等，以發(fā)揮抗氧化應(yīng)激的作用。本研究結(jié)果顯示，高氧+Gal-1組pAMPK/AMPK高于對(duì)照組和高氧組，提示Gal-1預(yù)處理可顯著增加肺組織中AMPK的磷酸化；而采用AMPK抑制劑Com C預(yù)處理后發(fā)現(xiàn)，高氧+Gal-1+Com C組大鼠Nrf2蛋白的表達(dá)水平顯著低于高氧+Gal-1組，證實(shí)了AMPK與Nrf2之間的關(guān)聯(lián)。

綜上所述，Gal-1可通過(guò)激活A(yù)MPK磷酸化增強(qiáng)Nfr2通路，抑制炎癥反應(yīng)和減少氧化應(yīng)激，從而改善高氧誘導(dǎo)的ALI。Gal-1可能成為治療ALI的候選藥物。