維生素K2對去卵巢大鼠股骨干骨折愈合及骨密度影響的實驗研究

劉烈東，張鵬貴，白曉兵

(1.榆林市第一醫(yī)院骨科，陜西 榆林 719000；2.榆林市第一醫(yī)院手足顯微外科，陜西 榆林 719000)

骨折是骨科臨床上常見疾病之一。隨著社會經(jīng)濟及交通運輸業(yè)的日益發(fā)展，各類骨折疾病的發(fā)病率正呈逐年上升趨勢，已成為嚴重影響人類生命安全的重要疾病之一[1-2]。骨折患者的恢復(fù)周期普遍較長，大部分患者需實施內(nèi)固定治療，同時需要借助石膏及夾板外固定輔助治療，以期實現(xiàn)骨折愈合[3-4]。盡管如此，仍有部分骨折存在延長愈合甚至不愈合情況，從而在一定程度上增加了患者的身心痛苦，對其家庭及社會造成較大的經(jīng)濟負擔。因此，通過多種途徑促進骨折愈合，減少或避免骨折不愈合、延遲愈合情況的發(fā)生，具有極其重要的意義。維生素K2屬于天然營養(yǎng)物之一，不少研究[5-6]證實其對骨具有雙向調(diào)控的作用，目前已成為骨折藥物研究熱點。然而，關(guān)于維生素K2對去卵巢股骨干骨折模型大鼠骨折愈合的影響研究報道并不多見。鑒于此，本研究觀察通過維生素K2對去卵巢股骨干骨折模型大鼠骨折愈合及骨密度的影響，為維生素K2應(yīng)用于股骨骨折治療中提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 雌性SD大鼠90只；周齡11～12周，平均(11.34±0.22)周；體重280～330 g，平均(308.16±8.27)g。所有大鼠均購自四川省中醫(yī)藥科學(xué)院實驗動物中心，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(川)2013-100。所有大鼠采用統(tǒng)一飼料分籠飼養(yǎng)，自由活動，不限制飲水。隨機將其分為假手術(shù)組、骨折組及干預(yù)組，每組30只。

1.2 主要試劑與儀器 青霉素(批號：23797)購自瑞陽制藥有限公司；水合氯醛(批號：30037517)購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司；甲醛溶液(批號：02014)購自恩施州中心醫(yī)院病理實驗室；DAB顯色試劑盒、HE染色試劑盒以及BMP-2抗體(批號：21576、21583、20492)均購自武漢博士德生物科技有限公司；酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)試劑盒(批號：EK2118)購自武漢博士德生物科技有限公司；維生素K2(批號：020098)購自上海西寶生物技術(shù)有限公司。高速冷凍離心機購自上海安亭科學(xué)儀器廠；電子天平購自梅特勒-托利多儀器有限公司；-80 ℃低溫冰箱購自山東省青島市海爾集團電冰箱廠；雙能X線骨密度測量儀購自美國Norland-XR36公司；計算機放射成像系統(tǒng)購自日本Konic公司。

1.3 去卵巢股骨干骨折模型制備

1.3.1 去卵巢處理：三組大鼠均實施卵巢切除。按照3 ml/kg的劑量對大鼠腹腔注射10%水合氯醛完成麻醉。選擇大鼠背部正中線中下1/3處做長2 cm縱行切口。分別從雙側(cè)進行皮下軟組織的鈍性分離，選擇脊柱旁開5 mm處對肌肉組織實施鈍性分離，充分暴露卵巢脂肪包被組織。稍稍提起卵巢，選擇輸卵管卵巢交接部位借助絲線實施結(jié)扎。對雙側(cè)卵巢進行徹底摘除，逐層縫合。

1.3.2 股骨干骨折模型建立：骨折組與干預(yù)組均建立股骨干骨折模型。按照3 ml/kg的劑量對大鼠腹腔注射10 %水合氯醛完成麻醉，常規(guī)消毒處理后，選擇右大腿中段外側(cè)做長2 cm縱行切口。順著股外側(cè)肌間隙實施鈍性分離直至股骨干，固定股骨并選擇股骨干中1/3段借助線鋸鋸斷成橫行骨折。隨后以直徑1.5 mm克氏針逆行插入骨折近端，并自后側(cè)股骨大粗隆穿出，復(fù)位骨折后將其順行插入骨折遠端髓腔，剪除多余克氏針。確定骨折固定牢固后，對切口予以生理鹽水多次沖洗，采用絲線逐層縫合。碘伏消毒后回籠飼養(yǎng)，術(shù)后連續(xù)予以青霉素抗感染3 d。

1.4 干預(yù)方式 干預(yù)組予以維生素K2灌胃，劑量為30 mg/kg，1 次/d。假手術(shù)組與骨折組均予以等量0.9%氯化鈉溶液干預(yù)，所有大鼠均連續(xù)干預(yù)5周。

1.5 觀察指標

1.5.1 骨密度：干預(yù)5周后處死大鼠，取右側(cè)股骨進行CR攝片，明確骨痂連續(xù)性及骨折愈合情況。隨后拔除股骨標本內(nèi)的克氏針，將股骨按照長度分成三等份，采用雙能X線骨密度測量儀測量股骨全長骨密度(tBMD)、中1/3段骨密度(mBMD)和遠1/3段骨密度(dBMD)。

1.5.2 骨代謝指標：包括血清骨鈣素(BGLAP)、堿性磷酸酶(ALP)以及抗酒石醋酸酸性磷酸酶(TRACP)。采用ELISA法進行檢測，具體操作嚴格遵循試劑盒說明書。

1.5.3 血清血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)：采用真空采血針采集干預(yù)5周后的大鼠尾靜脈血2 ml，以1500 r/min離心15 min，取上層血清，保存在-80 ℃冰箱中備用。采用ELISA法進行檢測，具體操作嚴格遵循試劑盒說明書。

1.5.4 骨形成蛋白-2(BMP-2)：采集大鼠骨組織標本，進行常規(guī)石蠟切片，切片厚度以4 μm為宜，烤片30 min。隨后脫蠟、抗原修復(fù)，添加封閉液，室溫下靜置10 min，去除多余水分，以PBS稀釋至1∶100，室溫條件下孵育60 min。以PBS沖洗2 min，重復(fù)3次。采用DAB顯色試劑盒顯色7 min，再次以水沖洗。采用蘇木素復(fù)染1 min，1%鹽酸酒精分化10 s，水洗3次，梯度脫水，以中性樹膠封片，于顯微鏡下觀察骨組織BMP-2表達情況。采用IPP 6.0圖像分析軟件統(tǒng)計分析。

2 結(jié) 果

2.1 三組大鼠術(shù)后8周骨折愈合狀況 見圖1。X線檢查發(fā)現(xiàn)，骨折組大鼠不完全愈合，即形成較小的骨痂組織，且重建并不完整，尚未發(fā)現(xiàn)明顯的骨愈合；干預(yù)組存在明顯的骨痂組織形成、重塑以及骨愈合。

圖1 骨折組(左)與干預(yù)組(右)大鼠術(shù)后8周X線圖像

2.2 三組大鼠右股骨骨密度比較 見表1。骨折組大鼠右股骨tBMD、mBMD及dBMD均低于假手術(shù)組，而干預(yù)組大鼠上述各項指標水平均高于骨折組(均P<0.05)。

表1 三組大鼠右股骨骨密度比較(g/cm2)

2.3 三組大鼠BGLAP、ALP及TRACP水平比較 見表2。骨折組大鼠BGLAP、ALP及TRACP水平均明顯高于假手術(shù)組，而干預(yù)組大鼠上述各項指標水平均明顯低于骨折組(均P<0.05)。

表2 三組大鼠BGLAP、ALP以及TRACP水平比較(μg/ml)

2.4 三組大鼠血清VEGF、BMP-2表達水平比較 見表3。骨折組大鼠血清VEGF、BMP-2表達水平均明顯低于假手術(shù)組，而干預(yù)組大鼠VEGF、BMP-2表達水平均高于骨折組(均P<0.05)。

表3 三組大鼠血清VEGF、BMP-2表達水平比較(pg/ml)

3 討 論

股骨干骨折作為骨科臨床常見骨折類型之一，其發(fā)病率在全身骨折中占比可達6%，且該比例呈日益增加趨勢，已受到國內(nèi)外廣泛關(guān)注[7-9]。相關(guān)研究[10-12]指出，骨質(zhì)疏松癥主要表現(xiàn)特征為低骨量以及骨組織微細結(jié)構(gòu)破壞，屬于股骨干骨折的重要病因之一。尤其是在絕經(jīng)后的女性中，缺乏雌激素是導(dǎo)致骨質(zhì)受損的另一重要因素，從而極易引發(fā)骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生，增加了骨折的風險。由此可見，如何有效治療骨質(zhì)疏松性骨質(zhì)對骨科醫(yī)生而言是一項極大的挑戰(zhàn)。骨折后的骨愈合屬于修復(fù)過程，涉及炎癥、成骨、愈傷組織形成以及重塑等，相關(guān)動物實驗證明卵巢切除動物中的雌激素受體表達失調(diào)會對骨愈合產(chǎn)生負面影響，繼而引起愈合延遲或不愈合。雙側(cè)卵巢切除大鼠普遍存在雌激素衰退，骨轉(zhuǎn)換水平增強，破骨細胞活性提高，促使骨吸收遠超骨形成，最終引起骨質(zhì)量下降，其發(fā)病機制與人類絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松高度一致，是目前臨床上應(yīng)用較為廣泛的骨質(zhì)疏松動物模型。

維生素K具有調(diào)節(jié)骨代謝及促進骨鈣素羧化的作用，且有一定增加骨密度的作用，可降低骨折的發(fā)生風險，目前已受到國內(nèi)外廣泛關(guān)注[13-14]。本研究發(fā)現(xiàn)，維生素K2干預(yù)在促進去卵巢股骨干骨折模型大鼠骨折愈合及骨密度改善方面效果明顯?？紤]原因可能是維生素K2具備抑制白細胞介素-1、白細胞介素-6以及前列腺素等合成的作用，從而有效抑制破骨細胞中的組織蛋白酶K表達，繼而起到抑制破骨細胞骨吸收性活性的目的，最終達到促進骨形成的作用。與此同時，骨鈣蛋白屬于骨組織中含量豐富的一種特異性蛋白，于成骨細胞內(nèi)合成并通過維生素谷氨酸γ-羧化后分泌至骨基質(zhì)內(nèi)，并和基質(zhì)內(nèi)的Ⅰ型膠原相結(jié)合形成網(wǎng)格支架，進一步為鈣鹽的沉積提供重要基礎(chǔ)，而維生素K2通過對骨鈣蛋白的羧化促進骨的礦化成熟[15-16]。

BGLAP可與骨中羥基磷灰石以及鈣緊密結(jié)合，是目前臨床上公認的骨形成標志物，由于其在骨形成過程中介導(dǎo)了成骨細胞的活化，所以可有效反映機體骨丟失率。ALP本質(zhì)為水解酶，主要作用是從一系列類型的分子中清除磷酸基團，如核苷酸、生物堿以及蛋白質(zhì)等，其在活躍的骨形成過程中異常增加。TRACP則是一種糖基化單體金屬蛋白酶，也是一種骨吸收標志物，可在磷酸化狀態(tài)下和破骨細胞相結(jié)合，促進骨橋蛋白去磷酸化，同時促使破骨細胞遷移并出現(xiàn)再吸收。本研究發(fā)現(xiàn)，維生素K2干預(yù)可明顯改善去卵巢股骨干骨折模型大鼠BGLAP、ALP以及TRACP水平。其原因可能是維生素K2具有激活異質(zhì)物(SXR)受體作用，同時可有效調(diào)控成骨細胞的骨標志物基因表達促進骨形成。研究[17-18]表明，維生素K2可通過SXR影響TSK基因的表達，繼而刺激細胞外基質(zhì)膠原發(fā)生聚集，為骨形成創(chuàng)造有利條件。

VEGF屬于二聚體糖蛋白，參與骨折修復(fù)的整個過程。既往相關(guān)研究[19-20]表明，VEGF在骨折斷端可發(fā)揮促進血管內(nèi)皮細胞分裂、再生的作用，進一步通過多種途徑和血管內(nèi)皮細胞特異性結(jié)合，為骨折斷端的特異性環(huán)境提供骨生長因子所需的相關(guān)代謝物質(zhì)，從而改善骨再生的微環(huán)境。BMP是一種糖蛋白，屬于轉(zhuǎn)化生長因子家族成員，可在早期刺激骨間充質(zhì)干細胞朝成骨細胞方向分化、增殖，并會促進其他家族因子朝成骨細胞方向增殖，共同促進骨組織的成熟[21-22]。本研究發(fā)現(xiàn)，維生素K2可有效上調(diào)血清VEGF、BMP-2表達水平，這可能是維生素K2促進骨折愈合的重要機制之一。

綜上所述，維生素K2可促進去卵巢股骨干骨折模型大鼠的骨折愈合并增加骨密度。