線粒體動態(tài)蛋白在卵巢癌中的表達及臨床意義

高 燕，楊 紅，劉淑娟，葛俊麗，賀艷麗，張紅菊，張曉紅

(空軍軍醫(yī)大學西京醫(yī)院婦產(chǎn)科，陜西 西安 710032)

卵巢癌為女性生殖系統(tǒng)腫瘤中病死率較高的惡性腫瘤，其早期確診率較低，多數(shù)患者確診時已至晚期，明顯增加了治療難度。雖然隨著醫(yī)療技術(shù)的進步，卵巢癌患者的預(yù)后有所改善，但是由于卵巢癌轉(zhuǎn)移率居高不下，患者預(yù)后往往不佳。目前臨床中主要通過影像學和癌胚抗原125檢測等方法對卵巢癌進行診斷，但是在早期診斷中的應(yīng)用價值較低，且對患者預(yù)后評估的價值有限[1]。探索新型靈敏的生物標志物對促進卵巢癌的早期篩查、病情及預(yù)后評估具有積極的臨床意義。線粒體功能正常是保證細胞生理活動正常進行的基礎(chǔ)。目前認為線粒體主要通過分裂與融合參與細胞凋亡、能量代謝等調(diào)控過程，而線粒體分裂活性異常與多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展均相關(guān)[2]。線粒體動態(tài)蛋白(Mitochondrial dynamic protein of 51 kDa，MiD51)在線粒體分裂調(diào)控中起重要作用，研究[3]發(fā)現(xiàn)肺癌組織中MiD51表達上調(diào)，并可有助于肺癌細胞增殖，下調(diào)MiD51則可促使肺癌細胞凋亡。但是目前關(guān)于MiD51在卵巢癌中表達情況尚未明確，因此本研究以卵巢癌患者為研究對象，觀察MiD51在卵巢癌中的表達，并分析其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017年1-12月我院收治的行手術(shù)治療的卵巢癌患者80例作為卵巢癌組，其中年齡37～72歲，平均(54.82±10.20)歲；漿液性腺癌52例，非漿液性腺癌28例；國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(FIGO)分期中，Ⅱ期23例，Ⅲ期31例，Ⅳ期26例；低分化38例，中高分化42例；腫瘤直徑2～8 cm，平均(5.05±1.58)cm。選取同期因子宮內(nèi)膜癌等疾病切除卵巢的患者40例作為對照組，年齡36～70歲，平均(54.24±9.01)歲。兩組患者年齡比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。病例納入標準：卵巢癌組均經(jīng)術(shù)后病理檢查確診為卵巢癌，術(shù)前未行放化療、激素等相關(guān)治療；對照組卵巢組織中未見腫瘤細胞；患者資料完整，研究知情同意并接受隨訪。排除標準：伴其他惡性腫瘤、免疫系統(tǒng)疾病、血液系統(tǒng)疾病、肝腎等臟器功能明顯不全、感染性疾病、心血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病。本研究經(jīng)本院醫(yī)學倫理委員后批準后開展。

1.2 研究方法

1.2.1 MiD51表達檢測：使用免疫組化SP法測量兩組卵巢組織中MiD51表達。將兩組石蠟標本切成厚度為4 μm的切片，脫蠟、梯度乙醇脫水、H2O2處理后孵育10 min。行抗原修復(fù)、封閉后加入兔抗人MiD51抗體(批號：ab89944；英國Abcam公司)，稀釋比設(shè)置為1∶300，4 ℃下孵育過夜。滴加二抗，37 ℃下孵育30 min，依次顯色、復(fù)染、脫水、封片，置于400倍顯微鏡下觀察。其中陽性對照為已知MiD51陽性切片，陰性對照為PBS。

1.2.2 結(jié)果判斷[4]：MiD51主要定位于細胞質(zhì)中，陽性表達為細胞質(zhì)內(nèi)可見棕褐色顆粒。由經(jīng)驗豐富的病理科醫(yī)師對結(jié)果進行判讀：每張切片中隨機選擇10個視野，根據(jù)陽性細胞占比與著色情況之和計分。其中，陽性細胞占比≤5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，75%以上為4分；未見著色為0分，著淺黃色為1分，著棕黃色為2分，著棕褐色為3分。總分≤1分視為陰性，≥2分視為陽性。

1.3 觀察指標 ①比較兩組卵巢組織中MiD51的表達情況。②比較不同臨床特征卵巢癌患者MiD51表達情況，分析MiD51表達與卵巢癌患者臨床特征的相關(guān)性。臨床特征包括年齡、絕經(jīng)、病理類型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化類型、FIGO分期、腫瘤直徑、腹水、肌層浸潤深度，其中年齡、腫瘤直徑均根據(jù)平均值確定臨界值(55歲和5 cm)。③對卵巢癌患者進行電話或門診隨訪，比較MiD51陽性表達與陰性表達患者的總生存期(OS)和無進展生存期(PFS)。隨訪終止事件為患者死亡或至隨訪終止時間(2021年4月)。本研究中，OS為患者手術(shù)到末次隨訪或死亡的時間，PFS為患者手術(shù)至疾病復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的時間。④比較不同臨床特征卵巢癌患者3年生存率，將可能影響卵巢癌患者生存的因素納入COX回歸中，分析影響卵巢癌患者生存的危險因素。臨床特征包括年齡、絕經(jīng)、病理類型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化類型、FIGO分期、腫瘤直徑、腹水、肌層浸潤深度、殘留病灶直徑、化療療程、MiD51陽性。

2 結(jié) 果

2.1 兩組患者卵巢組織中MiD51表達情況比較 見圖1。卵巢癌組MiD51陽性表達率為61.25%(49/80)，對照組MiD51表達陽性率為17.5%(7/40)，卵巢癌組MiD51陽性表達率明顯高于對照組(χ2=20.508，P<0.05)。

2.2 不同臨床特征卵巢癌患者MiD51表達情況比較 見表1。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、低分化卵巢癌患者MiD51陽性表達率明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、中高分化患者(均P<0.05)。MiD51陽性表達與卵巢癌患者年齡、絕經(jīng)、病理類型、FIGO分期、腫瘤直徑、腹水、肌層浸潤深度無相關(guān)性(均P>0.05)。

2.3 MiD51陽性表達與陰性表達患者OS、PFS比較 80例卵巢癌患者的隨訪時間為9～50個月，中位隨訪時間為38個月。MiD51陽性表達患者OS為(30.41±1.93)個月，95%置信區(qū)間(CI)為(26.83～33.99)個月；PFS為(18.69±2.10)個月，95%CI為(14.58～22.79)個月。MiD51陰性表達患者OS為(44.79±1.40)個月，95%CI為(42.06～47.53)個月；PFS為(26.70±2.44)個月， 95%CI為(21.92～31.47)。經(jīng)Log-Rank檢驗，MiD51陽性表達患者OS和PFS均明顯低于MiD51陰性表達患者(χ2=16.721、10.130，均P<0.05)。

A：MiD51呈陽性表達；B：MiD51呈陰性表達

表1 不同臨床特征卵巢癌患者MiD51表達情況比較[例(%)]

2.4 影響卵巢癌患者生存的危險因素單因素分析 見表2。80例卵巢癌患者中，3年生存率為58.75%(47/80)。殘留病灶直徑≥1 cm和MiD51陽性卵巢癌患者3年生存率明顯低于殘留病灶直徑<1 cm和MiD51陰性患者(均P<0.05)。年齡、絕經(jīng)、病理類型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化類型、FIGO分期、肌層浸潤深度、腹水、化療療程均與卵巢癌患者3年生存率無相關(guān)性(均P>0.05)。

2.5 影響卵巢癌患者生存的危險因素COX回歸分析 將殘留病灶直徑≥1 cm(是=1，否=0)和MiD51陽性(是=1，否=0)作為自變量進行COX回歸分析，結(jié)果表明殘留病灶直徑≥1 cm(OR=2.651，95%CI=1.361～5.162)和MiD51陽性(OR=3.393，95%CI=1.577～7.299)均為影響卵巢癌患者生存的獨立危險因素(均P<0.05)。

表2 影響卵巢癌患者生存的危險因素單因素分析[例(%)]

3 討 論

卵巢癌在婦科惡性腫瘤中的發(fā)生率僅低于宮頸癌和子宮內(nèi)膜癌，其病死率較高，患者明確診斷時往往已至晚期，且常合并遠處轉(zhuǎn)移，使手術(shù)療效有限，患者預(yù)后較差[5]。尋找敏感性標志物以實現(xiàn)對卵巢癌的早期防治至關(guān)重要。目前認為，卵巢癌的發(fā)生涉及激素、免疫、遺傳等多種因素，但其發(fā)生的分子機制尚未明確[6]。線粒體可參與細胞氧化還原等多種生理機制的調(diào)控，其中分裂與融合之間的平衡為線粒體生理功能發(fā)揮的重要保障。目前認為，腫瘤組織中線粒體分裂活性明顯提高，可通過細胞代謝、凋亡等多種生理機制參與腫瘤的進展[7]。MiD51為線粒體動態(tài)蛋白，主要在線粒體外膜上表達，研究[8]發(fā)現(xiàn)其可明顯提高肝癌細胞的遷移能力，促進肝癌的進展。但是目前關(guān)于其與卵巢癌的相關(guān)性尚未明確。

目前認為，線粒體在細胞中的分裂和融合在調(diào)控線粒體分布、形態(tài)等的同時，其功能異常還可參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，其中MiD51異常活化可促使腫瘤細胞中線粒體的碎片化，并可通過調(diào)控細胞分裂的G1/S期促進腫瘤細胞的增殖以及對凋亡信號的抑制[9]。本研究發(fā)現(xiàn)，MiD51在卵巢癌組織中的表達上調(diào)，提示MiD51可能參與卵巢癌的發(fā)生與發(fā)展，這可能與MiD51可通過與動力相關(guān)蛋白1(DRP1)的相互作用并將其招募到線粒體外膜中參與線粒體分裂調(diào)控相關(guān)[10]。研究[11-14]發(fā)現(xiàn)，裂變蛋白1(Fis1)、MiD51等均可參與DRP1的募集和線粒體裂變，且在無Fis1的情況下MiD51也可起到招募DRP1并增強DRP1表達的作用，提示MiD51可能通過對DRP1的作用參與線粒體分裂的調(diào)控；非小細胞肺癌細胞中DRP1表達明顯高于非癌組織，且通過抑制肺癌細胞中的線粒體分裂可明顯抑制癌細胞生長，表明肺癌的發(fā)生、發(fā)展與線粒體分裂具有明顯的相關(guān)性；甲狀腺鱗癌細胞中DRP1表達明顯升高，提示線粒體動力學的異?？赡芘c甲狀腺鱗癌的發(fā)生明顯相關(guān)，并可促進甲狀腺鱗癌細胞的侵襲性；通過使用DRP1抑制劑Mdivi-1可有效抑制腫瘤細胞的增殖，并可促使腫瘤細胞凋亡，進一步表明線粒體凋亡可能參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。

線粒體分裂活性的增加可使線粒體在細胞核周圍片段化，進而形成有利于腫瘤細胞增殖的微環(huán)境，其中通過下調(diào)DRP1的表達可明顯降低腫瘤細胞的增殖能力，促使腫瘤細胞的凋亡[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，MiD51表達與卵巢癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。研究[16-17]發(fā)現(xiàn)，MiD51在肝癌轉(zhuǎn)移灶中的表達水平明顯高于原發(fā)灶，且下調(diào)MiD51表達可明顯降低肝癌細胞的侵襲和遷移能力，提示MiD51可能參與肝癌細胞遷移；乳腺癌組織中DRP1表達上調(diào)可促使線粒體在板狀偽足區(qū)域中的分布，進而增強乳腺癌細胞遷移性，提示MiD51表達與卵巢癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的相關(guān)性可能是通過對DRP1的調(diào)控促使板狀偽足形成，進而促進癌細胞的遷移，但是具體機制仍需深入研究。

線粒體分裂的過度活化能夠促使惡性腫瘤中肌成纖維細胞能量代謝發(fā)生異常，進而有利于腫瘤新生血管的生成和增殖[18]。有研究[19]發(fā)現(xiàn)，線粒體分裂與腫瘤不良預(yù)后相關(guān)，這與本研究結(jié)果基本一致。本研究發(fā)現(xiàn)，MiD51陽性表達患者OS和PFS均明顯低于MiD51陰性表達患者，且為影響卵巢癌患者生存期的獨立危險因素。研究[20-22]發(fā)現(xiàn)，MiD51表達與乳腺癌患者的腫瘤直徑和分級呈正相關(guān)，與非小細胞肺癌患者的生存率呈負相關(guān)；線粒體分裂與腫瘤耐藥明顯相關(guān)，線粒體動力學功能障礙在順鉑誘導的細胞凋亡中起關(guān)鍵作用，Mdivi-1可增強癌細胞中順鉑誘導的細胞凋亡，增強對化療的敏感性；DRP1在乳腺癌中的表達明顯上調(diào)，且其表達與患者不良生存顯著相關(guān)，DRP1與B細胞、CD8+T細胞、CD4+T細胞、巨噬細胞、中性粒細胞和樹突細胞的浸潤水平呈正相關(guān)，提示DRP1可通過免疫浸潤影響乳腺癌患者的預(yù)后。因此，MiD51可能是通過與DRP1的相互作用對卵巢癌患者的預(yù)后產(chǎn)生一定的影響，但是具體機制仍需深入研究。

綜上所述，MiD51在卵巢癌組織中高表達，并與患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度以及生存期相關(guān)，可作為卵巢癌診斷和患者預(yù)后評估的相關(guān)依據(jù)。