海拔高度對2型糖尿病患者循環(huán)內(nèi)皮祖細胞及低氧誘導因子的影響*

陸潤蘭， 李 萍， 李 兵， 邢 媛， 張媛媛， 陳斌澤， 胡秦妮， 楊志華， 高保東，哈小琴， 高彩燕△

(1. 蘭州市中醫(yī)醫(yī)院， 蘭州 730050; 2. 聯(lián)勤保障部隊第九四〇醫(yī)院， 甘肅省干細胞與基因藥物重點實驗室， 蘭州 730050)

2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)是一種以高血糖和胰島素抵抗為主要特征的慢性代謝性疾病。研究顯示，高原地區(qū)2型糖尿病患者血液學指標發(fā)生改變，易發(fā)生血管病變[1]。循環(huán)內(nèi)皮祖細胞(endothelial progenitor cells, EPCs)作為血管內(nèi)皮細胞的原始細胞對血管的修復以及個體的整個生命周期都起著至關重要的作用。研究顯示，T2DM患者隨著血管并發(fā)癥的加重，循環(huán)EPCs數(shù)量降低，功能發(fā)生異常[2]。而且隨著海拔的升高，HIF-1α表達增加，循環(huán)EPCs數(shù)量降低[3]。但目前仍不清楚不同海拔下T2DM患者外周血循環(huán)EPCs的數(shù)量變化和HIF-1α的表達情況。據(jù)此，本文將對不同海拔下T2DM及并發(fā)癥患者外周血EPCs和HIF-1α的變化進行分析，從而為高海拔地區(qū)T2DM患者血管并發(fā)癥的治療提供依據(jù)。

1 對象與方法

1.1 對象

選取長居海拔386 m的陜西省咸陽市某醫(yī)院的2型糖尿病患者25名，健康者20名，作為低海拔組；選取長居海拔1 520 m的甘肅省蘭州市某醫(yī)院的2型糖尿病患者29名，健康者20名，作為高海拔組。納入排除標準：2型糖尿病患者以2003年世界衛(wèi)生組織 T2DM診斷標準為依據(jù)，排除糖尿病合并心腦血管疾病、肝臟、腎臟、呼吸系統(tǒng)疾病，以及近期手術、炎癥、腫瘤、外傷、潰瘍病等影響EPCs的患者；健康對照組分別來自該院同期健康體檢無任何異常者。

1.2 體格檢查

對納入對象均測量血壓、身高、體重、腰圍和臀圍，并計算體質指數(shù)(body mass index, BMI)和腰臀比(waist to hip ratio, WHR)。

1.3 實驗室檢測

(1)生化指標檢測 采集受試者5 ml靜脈血，進行臨床常規(guī)生化檢測。

(2)循環(huán)EPCs的檢測 取受試者200 μl抗凝全血，加入異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate, FITC)標記的人CD45單克隆抗體，堿性磷酸酶(alkaline phosphotase，AP)標記的人CD34單克隆抗體和藻紅蛋白(R-Phycoerythrin, PE)標記的人 VEGFR-2(KDR)單克隆抗體各5 μl，再加入別藻藍蛋白(Allophycocyanin, APC)標記的IgG和PE標記的IgG單克隆抗體來做同型對照熒光補償。25℃避光孵育30 min。后加入7 ml紅細胞裂解液，避光分解20 min，裂解完全后以1 500 r/min轉速離心5 min，棄去上清，加磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline, PBS)液洗滌2次(每次2 ml)，全部轉入BD流式管中離心5 min，棄上清，加入500 μl PBS制成單細胞懸液。最后在流式細胞儀上檢測每個樣本中CD45，CD34和VEGFR-2(KDR)雙陽性的細胞即為EPCs，并以1×106單位進行計數(shù)。

(3)HIF-1α的濃度檢測 血清中HIF-1α濃度采用ELISA方法檢測，嚴格按照試劑盒操作說明書進行。

1.4 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 基本信息

兩地共納入糖尿病者54人，健康者40人，男女各半，均為漢族，年齡為(59.5±9.9)歲。其中T2DM患者按照有無血管并發(fā)癥分為T2DM無血管并發(fā)癥組，T2DM大血管并發(fā)癥組以及T2DM微血管并發(fā)癥組。不同海拔地區(qū)研究對象基本信息詳見表1。

Tab. 1 General situation of included objects in different altitude groups[n(%)]

2.2 不同海拔下T2DM組和健康組檢測指標分析

如表2，3所示，無論高、低海拔地區(qū)，糖尿病組較健康組的BMI、WHR、GLU、HbAlc、TG均升高，而LDL降低，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；EPCs數(shù)量也較健康組減少(P<0.01)，提示糖尿病患者較健康者脂含量和糖含量較高，血管損傷修復的能力不如健康者；HIF-1α水平高海拔組較低海拔組明顯增高(P<0.05)，低海拔糖尿病患者和健康者之間的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，這說明高海拔下機體缺氧程度高于低海拔，而高海拔T2DM缺氧較健康者更為嚴重。

Tab. 2 Analysis of the detection indexes and the number of EPCs in type 2 diabetes and healthy groups in low altitude areas

Tab. 3 Analysis of the detection indexes and EPCs of type 2 diabetes and healthy groups in high altitude areas

2.3 不同海拔下血糖控制好壞狀況對T2DM組循環(huán)EPCs的數(shù)量的影響

如表4所示。血糖控制良好者空腹血糖較血糖控制較差者低(P<0.05)；循環(huán)EPCs數(shù)量較高(P<0.05)。提示血糖控制良好者較控制較差者，體內(nèi)糖毒性引起血管損傷的程度更低，血管的修復能力更強。因此嚴格的控制血糖對于血管的修復具有重要意義。

Tab. 4 The effects of high and low altitude blood glucose control on the number of circulating EPCs in T2DM patients

2.4 不同海拔下各T2DM血管并發(fā)癥組和健康組循環(huán)EPCs的數(shù)量變化情況

如圖1所示，低海拔組的健康者、T2DM無血管病變者、T2DM大血管病變者和T2DM微血管病變者循環(huán)EPCs數(shù)量均高于高海拔組，且差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，這提示高海拔缺氧環(huán)境下，EPCs的動員能力或細胞的存活能力下降；其循環(huán)EPCs數(shù)量由高至低依次為健康組、T2DM無血管并發(fā)癥者、T2DM微血管并發(fā)癥者，T2DM大血管并發(fā)癥者與T2DM微血管并發(fā)癥者無差別，即除T2DM大小血管病患者之間循環(huán)EPCs數(shù)量差異無統(tǒng)計學意義外(P>0.05)，其他各組之間兩兩比較均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。此結果同樣提示隨糖尿病并發(fā)癥的加重體內(nèi)可動員的EPCs數(shù)量或存活的數(shù)量逐漸降低，對于血管的修復能力也逐漸降低。因此EPCs的數(shù)量與海拔和疾病的嚴重程度密切相關。

Fig. 1 Changes in the number of Log(EPCs) between groups ofhigh and low altitude groupsA: Healthy group; B: T2DM without avascular disease group; C: T2DM macrovascular disease group; D: T2DM microvascular disease group*P<0.05 vs low altitude group

3 討論

T2DM的大小血管并發(fā)癥因起病隱匿，發(fā)生率高，而患者知曉率，診斷率和治療率低，危害性大等特點，使得血管并發(fā)癥致殘或致死的發(fā)生率亦在逐年上升[4]。研究顯示，糖尿病患者的胰島素抵抗和高血脂高血糖狀態(tài)對EPCs的增殖、分化、歸巢及整合入血管的所有功能均有損害[5]。因此對于EPCs的測定可在一定程度上反應糖尿病并發(fā)癥的進展情況。EPCs目前的測定方法較多，本文采用流式細胞儀進行數(shù)量的測定，能夠更加靈敏和特異性的量化循環(huán)EPCs的數(shù)量。

本研究結果顯示糖尿病組較健康組循環(huán)EPCs數(shù)量減少，且與并發(fā)癥的嚴重程度成正相關。這可能與以下幾種機制相關。第一，糖尿病患者長期處于高糖狀態(tài)，從而誘發(fā)(advanced glycation end products，AGEs)的產(chǎn)生增加，抑制了EPCs的數(shù)量，影響其功能[6]。第二，高糖會使內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)的活性降低，從而使NO的分泌減少，影響血管功能和EPCs的生成。相關的研究已證實高糖狀態(tài)會抑制PI3K/Akt/eNOS通路的表達，從而影響NO的合成來影響EPCs的動員[7],而且NO還能通過多種途徑來影響EPCs的動員，影響血管的生成。而在其通路調(diào)節(jié)的任何一個環(huán)節(jié)都有可能影響著EPCs的數(shù)量和功能[8]。第三，高糖引起氧化應激增強，活性氧產(chǎn)生增加，加速EPCs的衰老[9]，且會增加EPCs的自噬和凋亡，使細胞數(shù)量減少[10]。但糖尿病患者因自噬導致EPCs數(shù)量減少的具體通路還未完全探明，還需進一步證實。

此外，本研究也發(fā)現(xiàn)高海拔地區(qū)較低海拔地區(qū)而言，研究對象血循環(huán)EPCs減少。這為高海拔地區(qū)糖尿病患者進行EPCs移植進行治療成為可能。因隨海拔的升高，機體缺氧加重，氧化應激增強，出現(xiàn)血紅素加氧酶表達降低，引起EPCs衰老和功能障礙[11]。在急性缺氧的情況下，EPCs會大量移植到外周血，組織血運重建；在慢性缺氧的情況下，HIF-1α會代償性的高表達刺激下游因子血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)，基質細胞衍生因子(stromal cell derived factor-1，SDF-1)，血管生成素1/2(angiopoietin1/2，ANGPT1/2)等多種血管生成因子的表達，來促進組織對缺氧的反應，修復血管內(nèi)皮損傷[12]，而被激活的ANGPT又進一步增強EPCs的增殖和遷移，從而導致排列良好的內(nèi)皮細胞結構和細胞間連接的血管增大，促進血液灌注[13]。Zhou[14]的研究也證實HIF-1α還可直接參與低氧誘導的EPCs增殖，遷移和分化。而且Zan[15]也提出了HIF-1α調(diào)控EPCs的兩種途徑，一方面HIF-1α通過SDF-1 / CXCR4軸促進EPCs動員和歸巢，來增加外周血中的EPCs數(shù)量，助力新血管形成。另一方面，它可以通過刺激VEGF，成纖維細胞生長因子(fibroblast growth factor，F(xiàn)GF)、基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMPs)等的表達來改善EPC的血管生成功能，而此時遷移能力與外周血中的細胞數(shù)量是相反的，這就可以很好地解釋為什么高海拔或者并發(fā)癥嚴重的時候，HIF-1α表達增強而EPCs的數(shù)量降低了。因為進入失代償階段后，HIF-1α表達不斷增強，刺激著EPCs的遷移，但EPCs動員減少或存活下降，沒有有效的歸巢，受損的血管得不到很好的修復，使其血管病變加重[16]。

此外本研究還發(fā)現(xiàn)血糖控制良好的患者較血糖控制較差的相比循環(huán)EPCs數(shù)量較高，這與Churdchomjan等人[17]的研究結果相一致，這也在一定程度上說明只要很好地控制血糖將在并發(fā)癥的預防和預后中起到重要作用。但這只是從橫斷面水平研究的結果，仍需要進行隊列研究來證明控制血糖控制良好是否能夠改善外周EPCs進而預防血管并發(fā)癥。

總之，本研究結果提示T2DM患者與健康者相比循環(huán)EPCs數(shù)量減少且與疾病程度相關；高海拔地區(qū)較低海拔地區(qū)人群循環(huán)EPCs數(shù)量顯著減少，HIF-1α高度表達。這將為高海拔地區(qū)T2DM患者進行EPCs移植，緩解糖尿病并發(fā)癥提供依據(jù)。