lncRNA PVT1沉默對高糖誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細胞增殖、凋亡及氧化應(yīng)激的影響*

劉 波， 顧 燕， 羅建華， 范元碩， 馮志宇

(1. 貴州省人民醫(yī)院 內(nèi)分泌科， 貴陽 550002； 2. 貴州省人民醫(yī)院 腫瘤科， 貴陽 550002)

糖尿病是全球廣泛存在的一種代謝性疾病，主要特征是由于胰島功能異常導(dǎo)致血糖濃度升高，加速機體消耗性損傷[1]。糖尿病血管病變是糖尿病的主要并發(fā)癥之一，主要包括糖尿病微血管病[2]，糖尿病視網(wǎng)膜病變[3]、糖尿病性腎病、糖尿病性壞疽[4]，糖尿病性腦血管病[5]和心血管疾病[6]。其中內(nèi)皮細胞(endothelial cells，ECs)是血管系統(tǒng)的重要組成部分，內(nèi)皮細胞功能異常是糖尿病性并發(fā)癥的關(guān)鍵因素[7]。

內(nèi)皮細胞是血管的重要組成部分，異常的增殖和遷移都會導(dǎo)致血管病變的發(fā)生，進一步影響機體功能，比如視網(wǎng)膜病變，動脈粥樣硬化等[8]。有研究證實，持續(xù)性高糖會誘發(fā)產(chǎn)生機體代謝紊亂，進而影響內(nèi)皮細胞損傷，加速血管病變發(fā)生。有研究報道紫草素可以激活Nrf2/HO-1信號通路下調(diào)細胞中氧化應(yīng)激，減緩高糖誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細胞凋亡，發(fā)揮保護作用[9]。此外郭巍巍[10]等研究發(fā)現(xiàn)，IL-35可通過調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細胞氧自由基的水平而對抗高糖誘導(dǎo)的細胞凋亡[10]。但是高糖誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞功能異常的確切機制尚沒有明確。

長鏈非編碼RNA(long non-coding RNAs, lncRNAs)是長度大于200個核苷酸的非編碼RNA[11]。lncRNA在細胞增殖，分化，凋亡等方面發(fā)揮關(guān)鍵作用。在心血管疾病領(lǐng)域，有研究發(fā)現(xiàn)lncRNA影響內(nèi)皮細胞功能直接影響心血管疾病的進展。在糖尿病大鼠中，lncRNAMALAT1的下調(diào)可抑制心肌細胞凋亡，抑制視網(wǎng)膜內(nèi)皮細胞的增殖和遷移，減緩視網(wǎng)膜血管損傷炎癥反應(yīng)[12]。有研究表明，lncRNAH19調(diào)控人臍靜脈內(nèi)皮細胞的增殖和凋亡[13]。在卵巢癌發(fā)展過程中l(wèi)ncRNA PVT1(plasmacytoma variant translocation 1)過表達可以抑制細胞凋亡[14]。雖然已有研究證實lncRNA可以調(diào)控血管內(nèi)皮細胞功能發(fā)揮作用，但是lncRNA PVT1是否也可以調(diào)控內(nèi)皮細胞，影響高糖誘導(dǎo)的細胞增殖，凋亡和氧化應(yīng)激仍需要闡明。本研究主要探討了抑制lncRNAPVT1的表達對高糖誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞的增殖，凋亡和氧化應(yīng)激的影響，旨在為糖尿病性血管疾病的治療提供確切的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVECs)的培養(yǎng)及分組

HUVECs購自美國ATCC公司。復(fù)蘇凍存的HUVECs細胞，加入含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，在37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。選取生長狀態(tài)較好的細胞用0.25%胰蛋白酶消化1 min后，加培養(yǎng)基終止。用PBS輕輕吹打，制成細胞懸液。待細胞長滿瓶底75%，按照1∶2傳代，指標檢測實驗采用第4～6代細胞。實驗中主要分為四組：對照組(5.5 mmol/L D-葡萄糖培養(yǎng)基)，高糖組(30 mmol/L D-葡萄糖培養(yǎng)基)，高糖+siNC組(高糖組中細胞轉(zhuǎn)染陰性對照組)，高糖+siPVT1組(高糖組中細胞轉(zhuǎn)染siPVT1)。

1.2 細胞轉(zhuǎn)染及實時定量PCR(RT-PCR)檢測

選取生長狀態(tài)良好的細胞，待細胞生長至80%左右時，運用LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒轉(zhuǎn)染siPVT1及siNC(陰性對照組)，分別用無血清培養(yǎng)基稀釋適量lipofectamine2000合成的RNA/質(zhì)粒，輕輕混勻，靜置5 min。棄掉培養(yǎng)基，添加有血清的培養(yǎng)基，分別于轉(zhuǎn)染24 h，48 h后收集細胞，根據(jù)試劑盒說明書提取總RNA，測濃度后-80℃保存?zhèn)溆?。采用SYBR Green 法檢測PVT1的相對表達水平。引物序列由上海通用生物公司合成提供。siPVT1上游：5’-GCUUCUCCUGUUGCUGATT-3’，下游：5’-UAGCAGCAACAGGAGAAGCTT-3’；siNC上游：5’-GCUACGAUCUGCCCAAGAUTT-3’，下游：5’-AUCUUAGGCAGAUCGUCGCTT-3’。

1.3 MTT檢測細胞增殖活力

分別選擇對數(shù)生長期的細胞，胰蛋白酶消化制成細胞懸液，調(diào)整細胞濃度為1×105cells/ml接種于96孔板中，每孔180 μl，設(shè)置3個復(fù)孔。37℃培養(yǎng)24 h，48 h后，吸取棄掉培養(yǎng)基。每孔加入20 μl MTT(終濃度為5 mg/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)6 h后加入150 μl DMSO溶解，輕輕震蕩，直到結(jié)晶全部溶解，用酶標儀在570 nm波長處檢測各孔吸光度，吸光度越大，細胞數(shù)越多，表明細胞增殖能力越強。

1.4 流式細胞術(shù)檢測細胞ROS水平

培養(yǎng)HUVECs 24 h后，加入終濃度為10 μmol/L的H2DCFDA，置于CO2恒溫培養(yǎng)箱中，37℃培養(yǎng)20 min后棄掉培養(yǎng)液。PBS洗輕輕吹洗3 次，加入0.01%EDTA的胰蛋白酶消化細胞，制成細胞懸液備用。利用FACScan流式細胞儀檢測細胞的ROS水平。

1.5 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡水平

收集處理好的細胞，1×PBS洗3次后加入800 μl PBS制成懸液，置于1.5 ml EP管中，避光條件下分別加入5 μl Annexin V及5 μl PI，輕輕混勻，室溫條件避光反應(yīng)20 min，上流式細胞儀檢測凋亡率，凋亡率=壞死細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100%

1.6 蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測細胞凋亡相關(guān)蛋白的表達水平

收集細胞，1×PBS洗3次，加入RIPA裂解液提取蛋白，冰上裂解細胞30 min后，4℃低溫高速離心，12 000 r/min，離心10 min，取上清備用。采用BCA試劑盒測定蛋白濃度，添加上樣緩沖液，稀釋為均一濃度，99℃金屬浴加熱5 min變性。10%SDS-PAGE膠電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)模，5%脫脂牛奶室溫封閉3 h，加入稀釋后的一抗(Bax，1∶1 000；Bcl-2，1∶1 000；cleaved-caspase-3， 1∶1 000； GAPDH，1∶900)，4℃過夜孵育。1×TBST洗脫3 次，每次8 min，室溫孵育HRP標記的二抗(抗兔，1∶10 000稀釋)1 h，1×TBST洗脫3 次，每次8 min，ECL法暗室顯影，應(yīng)用凝膠成像分析儀測定蛋白條帶灰度值，其中GAPDH為內(nèi)參。

1.7 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)染后siPVT1后HUVECs細胞中PVT1的表達水平

實時定量PCR結(jié)果顯示，和control+siNC組(0.78±0.19)比較，轉(zhuǎn)染組中PVT1(0.37±0.07)的表達水平明顯下調(diào)(P<0.01)，結(jié)果表明siPVT1轉(zhuǎn)染成功。

2.2 siPVT1對高糖誘導(dǎo)的HUVECs細胞增殖能力的影響

MTT結(jié)果顯示(表1)，和對照組比較培養(yǎng)24 h和48 h后高糖組中HUVECs細胞增殖活力顯著降低(P<0.05)。轉(zhuǎn)染siPVT1后，與HG+siNC組比較，培養(yǎng)24 h和48 h后，HG+siPVT1組中HUVECs細胞增殖活力顯著增加(P<0.05)。結(jié)果表明，siPVT1可以增加高糖誘導(dǎo)HUVECs細胞增殖活力。

Tab. 1 The effects of siPVT1 on hyperglycemia-induced proliferation activity of HUVECs cells n=3)

2.3 siPVT1對高糖誘導(dǎo)的HUVECs細胞氧化應(yīng)激和凋亡的影響

流式細胞術(shù)結(jié)果顯示(表2, 圖1)，與對照組比較，高糖誘導(dǎo)的HUVECs細胞氧化應(yīng)激和凋亡率均顯著增加(P<0.05，P<0.01)。與轉(zhuǎn)染組比較，HG+siPVT1組中細胞氧化應(yīng)激水平顯著減少，凋亡率也顯著降低(P<0.05)。結(jié)果表明，siPVT1可以減少高糖誘導(dǎo)的HUVECs細胞的氧化應(yīng)激，抑制細胞凋亡。

Tab. 2 The effects of siPVT1 on oxidative stress and apoptosis induced by hyperglycemia in HUVECs cells (%， n=3)

Fig. 1 Comparison of apoptosis in HUVECs in each group

2.4 siPVT1對高糖誘導(dǎo)的HUVECs凋亡相關(guān)蛋白的影響

采用Western blot檢測，結(jié)果顯示，與對照組比較，高糖組中Bax和cleaved-caspase-3表達水平均顯著上調(diào)，Bcl-2表達顯著下調(diào)(表3，圖2，P< 0.05)。與HG+siNC組比較，HG+siPVT1組中HUVECs細胞中Bax和cleaved-caspase-3表達顯著下調(diào)，Bcl-2表達顯著增加(P<0.05)。

Tab. 3 Protein expressions of Bax, Bcl-2 and cleaved-caspase-3 in HUVECs induced by hyperglycemia n=3)

Fig. 2 Comparison of the expressions of apoptosis-related proteins in HUVECs in each group

3 討論

隨著生活水平的提高，糖尿病是現(xiàn)代社會發(fā)病率極高的一種代謝性疾病，伴隨著并發(fā)癥發(fā)病率增加，死亡率也逐年增加，因此研究糖尿病并發(fā)癥的發(fā)病機制具有重要意義[15]。其中糖尿病血管病變是發(fā)病率最高的一類疾病，內(nèi)皮細胞在高糖環(huán)境下的功能障礙被認為是糖尿病性血管病變的關(guān)鍵影響機制[16]。有研究表明，高糖環(huán)境下內(nèi)皮細胞增殖能力下降，凋亡增加直接導(dǎo)致內(nèi)皮功能異常，間接加重血管炎癥發(fā)生[9]。此外有研究表明，內(nèi)皮細胞凋亡是早期血管病變的關(guān)鍵啟動步驟[17]。

lncRNA對于細胞功能的調(diào)控更加精細，已有的研究顯示，lncRNA參與了染色質(zhì)沉默、基因組印記等關(guān)鍵的生理過程[18，19]。此外lncRNA 與各種腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著密切的關(guān)系，參與調(diào)控血管生成，腫瘤細胞侵襲，凋亡等的發(fā)展。 lncRNA PVT1位于原癌基因 MYC下游，已被證明與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，具有癌基因的作用[20]。有研究發(fā)現(xiàn)， lncRNA-PVT1可以促進腫瘤細胞的增殖和侵襲，那么PVT1是否可以影響內(nèi)皮細胞的增殖和凋亡，參與血管病變的發(fā)展尚不十分清楚。因此本文主要采用轉(zhuǎn)染siPVT1至HUVECs細胞中探討抑制lncRNA PVT1對高糖誘導(dǎo)的HUVECs細胞增殖，氧化應(yīng)激和凋亡的影響。

本實驗中首先采用細胞轉(zhuǎn)染siPVT1和siNC，RT-PCR結(jié)果證實PVT1表達顯著降低，轉(zhuǎn)染成功。MTT法檢測siPVT1對高糖誘導(dǎo)的HUVECs細胞增殖能力的結(jié)果提示，siPVT1明顯促進高糖誘導(dǎo)的細胞增殖。流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡和氧化應(yīng)激的結(jié)果表明，lncRNA PVT1沉默可以顯著抑制細胞凋亡和氧化應(yīng)激。Bax是一種促凋亡蛋白，Bcl-2是抑制凋亡蛋白[21]。Western blot蛋白表達水平的結(jié)果顯示，siPVT1可以顯著下調(diào)高糖誘導(dǎo)條件HUVECs細胞中Bax和cleaved-caspase-3的表達，上調(diào)Bcl-2的表達水平。據(jù)此推測高糖誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細胞中會產(chǎn)生大量氧自由基，細胞啟動自我保護機制，加速抗氧化酶的合成和分泌。在氧化應(yīng)激大范圍發(fā)生時，Bax等促凋亡蛋白也會同時被激活，加速細胞凋亡，高糖持續(xù)刺激可以進一步加劇血管內(nèi)皮細胞內(nèi)氧化應(yīng)激及凋亡。本實驗提示，沉默PVT1的表達可以抑制高糖環(huán)境下內(nèi)皮細胞的凋亡和氧化應(yīng)激，促進增殖，減輕內(nèi)皮細胞損傷。有關(guān)siPVT1在高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞中抗氧化應(yīng)激和抗凋亡的分子機制尚有待進一步研究。

總之，由于內(nèi)皮細胞在持續(xù)高糖環(huán)境下發(fā)生的功能異常導(dǎo)致血管病變的發(fā)生，這提示我們將保護內(nèi)皮細胞作為治療策略，降低糖尿病并發(fā)癥，提高患者生活質(zhì)量。我們的研究提供了一種治療糖尿病血管病變的新策略，可以將PVT1作為潛在的靶基因，抑制內(nèi)皮細胞凋亡，保護內(nèi)皮細胞功能，這對未來尋找防治糖尿病并發(fā)血管病的措施具有重要指導(dǎo)意義。