薏苡葉和淫羊藿配伍對小鼠抗疲勞及耐缺氧的作用*

趙士博， 黃鎖義， 潘 智， 彭曉敏， 彭曉靖， 伍世娟， 韋德智， 陳新鵬

(1. 右江民族醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院， 廣西 百色 533000； 2. 右江民族醫(yī)學(xué)院廣西高校右江流域特色民族藥研究重點實驗室， 廣西 百色 533000； 3. 右江民族醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院， 廣西 百色 533000)

薏苡(Coix lachryma-jobi L.)為禾本科(Gramineae)薏苡屬(Coix L.)草本植物，別名薏仁、六谷子、珍珠米?，F(xiàn)代研究表明薏苡可預(yù)防高血脂、高血壓、中風(fēng)、抗癌、美膚養(yǎng)顏、降血糖、增強免疫等多種藥理作用[1]。因其極具營養(yǎng)滋補保健價值而備受青睞，廣西作為薏苡主產(chǎn)區(qū)，對薏苡的研究與開發(fā)尚不完全[2，3]。經(jīng)黃凱玲等[4]學(xué)者研究，薏苡葉提取物具有體外抗活性氧自由基作用進而可發(fā)揮體外抗氧化之功效，梁尋杰等經(jīng)研究證實薏苡葉具有抗缺氧耐疲勞作用[5]。淫羊藿是中國傳承千年的草藥，因其具備防治骨質(zhì)疏松、抗抑郁、抗哮喘及抗老年癡呆等功效，在方劑中多作為君藥使用?，F(xiàn)代藥理研究證實，淫羊藿主含淫羊藿苷、淫羊藿多糖[6-8]，張紅旭等[9]學(xué)者經(jīng)研究表明，淫羊藿多糖是抗疲勞耐缺氧的有效成分。綜上，兩種藥材均具有抗氧化抗疲勞耐缺氧的藥理作用。

薏苡葉與淫羊藿單味藥研究與應(yīng)用廣泛，明代大型方書《普濟方》諸痹門中首次將兩味中藥配伍用以治療腰腳寒痹，筋攣麻急，偶伴疼痛，行履不得。二者均歸腎經(jīng)，通過補腎陽提高其貯精納氣之功效，協(xié)調(diào)呼吸及其他運動。中醫(yī)觀點認為機體內(nèi)的精氣、血、津液缺失進而導(dǎo)致疲勞,通過辨證組方進行調(diào)治。在對中醫(yī)方劑與現(xiàn)代藥理學(xué)研究的基礎(chǔ)上，本研究以昆明種小鼠為實驗對象，探討薏苡葉和淫羊藿及其配伍抗疲勞耐缺氧效果及二者配伍是否具有復(fù)合作用。為薏苡葉和淫羊藿藥理作用的深入研究與開發(fā)及應(yīng)用提供理論依據(jù)，闡明薏苡葉和淫羊藿的作用效果和聯(lián)合應(yīng)用的療效，為臨床開發(fā)的抗缺氧耐疲勞類藥物提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 儀器與耗材

TWCL-T 5000磁力攪拌器，上海標(biāo)和儀器有限公司；DLSB-5低溫冷卻液循環(huán)泵，鄭州長城科工貿(mào)有限公司；JSC電子天平秤CN-BH，福州科迪電子技術(shù)有限公司；FA1204B電子天平，上海精科天美儀器有限公司；JMF-320G多級閃蒸器，河南智晶生物科技股份有限公司；清潔級實驗鼠維持飼料，江蘇省協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限責(zé)任公司出品。

1.2 實驗動物

SPF級昆明種小鼠，由廣西百色市右江民族醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供，許可證號:SCXK桂2012-0003。本實驗用鼠雌雄參半，體質(zhì)量18～22 g，周齡不詳。

1.3 藥材的鑒定與提取

干燥的壯藥材薏苡葉和淫羊藿采購于廣西百色市西林縣，粉粹后備用。經(jīng)右江民族醫(yī)學(xué)院科學(xué)實驗中心主任黃鎖義教授鑒定，確認為禾本科植物薏苡Coix lacryma-jobi L.的干燥葉和三枝九葉草Epimedium sagittatum(Sieb.et Zucc.)Maxim.的干燥葉。

參照梁尋杰等[10]的方法制備薏苡葉提取液，干燥薏苡葉500 g用10倍蒸餾水浸泡1 h，煮沸30 min，自然冷卻至室溫后過濾。然后濃縮至100%(1 ml含生藥1 g)，作為原藥液，置于4℃冰箱保存?zhèn)溆?，實驗前再配制成濃度? g·ml-1的藥液。

參照魯靜等[11]學(xué)者的提取方法，取淫羊藿藥材500 g，加入無水乙醇(4倍體積) ，90℃提取140 min，提取3次后過濾，加入無水乙醇(4倍體積)搖勻，4℃放置12 h后以4 000 r·min-1離心20 min，棄去上清液，沉淀用蒸餾水配置為濃度1 g·ml-1，4℃冷藏備用，實驗前配制成濃度為1.5 g·ml-1的藥液。

1.4 動物分組及給藥

240只SPF級昆明種小鼠，每個實驗60只，各組小鼠依性別1∶1分籠隨機分配，每組10只。5%苦味酸標(biāo)記，采用隨機數(shù)字表法分為6組:空白對照組、薏苡葉組、淫羊藿組、薏苡葉淫羊藿配伍低劑量組、薏苡葉淫羊藿配伍中劑量組和薏苡葉淫羊藿配伍高劑量組(以下簡稱低劑量組、中劑量組和高劑量組)，3個劑組分別以薏苡葉和淫羊藿1:1濃度比配置成1.5，4.5，7.5 g·kg-1·d-1三種濃度的藥液備用。

實驗動物經(jīng)1周適應(yīng)性喂養(yǎng)后測定體質(zhì)量。為保證灌胃劑量的準(zhǔn)確與實驗嚴謹性的保證，實驗期間每3 d測定一次小鼠體質(zhì)量。實驗中各組均按體質(zhì)量20 ml·kg-1給予對應(yīng)藥液，即劑量為20 g·kg-1，空白對照組即生理鹽水組，按等體積給予0.9%生理鹽水。所有實驗組每24 h灌胃一次，連續(xù)21 d。每次動物實驗均遵守動物實驗倫理要求。

1.5 小鼠負重游泳實驗

取小鼠60只，雌雄比例、分組、給藥及體質(zhì)量測定按計劃進行。末次灌胃30 min后在各組小鼠于尾部負重(小鼠體重7%)鐵絲，每桶2只放于塑料桶內(nèi)，水深28 cm(超過小鼠尾長和體長為宜)，水溫控制在(30±2)℃。撥動水面使小鼠不斷游動，記錄小鼠自入水至頭部6 s不能浮出水面的時間，即為小鼠力竭游泳時間。記錄好時間后，撈出小鼠。

1.6 小鼠爬桿實驗

取小鼠60只，雌雄比例、分組、給藥及體質(zhì)量測定按計劃進行。末次給藥30 min后進行爬桿實驗。將小鼠放到玻璃棒頂，使肌肉處于靜力緊張狀態(tài)，記錄小鼠由于肌肉疲勞從玻璃棒上跌落下來的時間，共測量3次取其均值作為爬桿時間。

1.7 小鼠耐常壓缺氧實驗

小鼠60只，按雌雄比例分組、給藥及體質(zhì)量測定按計劃進行。第21日灌胃30 min后將一只小鼠放入50 ml 廣口瓶中，瓶口用凡士林涂抹并蓋嚴，記錄并觀察小鼠呼吸停止時間，即為小鼠常壓耐缺氧時間。將小鼠剖腹，分離其肝臟稱重，記錄每組小鼠肝重。肝重系數(shù)計算如下。

肝重系數(shù) = 肝濕重(g)/體重(g)×100%。

1.8 小鼠斷頭缺氧實驗

小鼠60只，按雌雄比例分組、給藥及體質(zhì)量測定按計劃進行。末次給藥1 h后，于小鼠耳后2 mm逐只斷頸，記錄小鼠斷頭后呼吸時間(張口呼吸停止、舌頭外露為止停止計時)。

1.9 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 薏苡葉和淫羊藿及其配伍對小鼠力竭游泳時間及爬桿時間的影響

與空白對照組相比，薏苡葉組和淫羊藿組游泳時間與爬桿時間差異顯著(P<0.05);與薏苡葉組和淫羊藿組相比，低劑量效果較好(P<0.05);與低劑量組相比，中、高劑量組有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05，表1)。

Tab. 1 Effects of coix leaves and epimedium and their compatibility on exhaustive swimming time pole climbing time in mice n =10)

2.2 薏苡葉和淫羊藿及其配伍對常壓耐缺氧時間與斷頭張口呼吸時間的影響

與空白對照組相比，薏苡葉組與淫羊藿組在常壓缺氧與斷頭呼吸時間均得到明顯延長(P<0.05)，淫羊藿組肝重具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)；與薏苡葉組相比，低劑量組實驗效果均有差異(P<0.05)，與淫羊藿組相比，低劑量組常壓缺氧時間效果較好(P<0.05)：與低劑量組相比，中劑量組能夠顯著延長常壓缺氧與斷頭維持呼吸時間(P<0.05)、肝重系數(shù)明顯升高(P<0.01，表2)。

Tab. 2 Effects of coix leaves and epimedium and their compatibility on normal hypoxia tolerance time and respiratory time of broken head in mice n=10)

3 討論

疲勞是機體面臨疾病狀態(tài)的前驅(qū)表現(xiàn)，即機體失去其完成原來所具有的正常工作與活動能力，身體各項功能開始出現(xiàn)暫時性降低的過程。運動性疲勞則會使機體的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疲勞、免疫功能下降，機體抗過氧化能力降低、抑制神經(jīng)內(nèi)分泌功能及造血系統(tǒng)功能等[12]。由一系列生化改變致肌肉收縮力降低而出現(xiàn)的最直接且客觀的機體運動耐力的大幅度降低即為運動性疲勞。

諸多研究證實，自由基的清除是抗氧化劑發(fā)揮抗氧化作用的主要機制。薏苡葉作為常用食材薏苡的干燥葉，有較好的抗氧化活性。譚冰等[13]經(jīng)研究表明薏苡葉中可能含有黃酮類、酚類等化成分，薏苡多糖具有較強的抗氧化作用。經(jīng)華蔚等[14]學(xué)者通過氯仿提取薏苡葉中的有效成分并開展體外抗氧化作用的研究表明隨著薏苡葉氯仿提取物濃度的升高，O2-的清除效果增強[15]。鑒此，薏苡葉的抗疲勞耐缺氧作用的有效成分可能在機體對氧氣的在體內(nèi)的應(yīng)用與代謝過程起到催化作用，進而增強了機體耐受程度與缺氧狀態(tài)下的氧氣消耗水平。本研究結(jié)合沙愛龍與董壽堂兩位學(xué)者的抗疲勞耐缺氧藥理作用的研究發(fā)現(xiàn)，通過小鼠負重游泳實驗反應(yīng)藥物的抗疲勞效果簡單明了[16]。但實驗效果由于個體差異難以排除特異性，若通過游泳實驗先行篩選游泳時間相近的小鼠，剔除差異較大的個體，能夠提高實驗數(shù)據(jù)的普遍規(guī)律從而排除 實驗動物的個體差異對結(jié)果的干擾[17，18]。

淫羊藿總黃酮中的淫羊藿苷作為淫羊藿耐缺氧的有效成分，通過健全腦、肺水腫，抑制缺氧炎癥聯(lián)級反應(yīng)、減輕組織損傷，增強耐缺氧能力。其具有一定抗氧化性，且對自由基的清除也有一定作用[19]。路玲莉等[20]學(xué)者經(jīng)研究表明，淫羊藿苷可有效抑制缺氧/缺糖損傷誘導(dǎo)ROS的產(chǎn)生。本研究將薏苡葉與淫羊藿進行配伍，旨在探討二者在耐缺氧抗疲勞方面是否具有復(fù)合作用。薏苡葉和淫羊藿二者具有明顯的抗疲勞耐缺氧作用[21]，通過兩種單味藥與三個劑量組進行效果對比分析，配伍組表現(xiàn)出明顯的抗疲勞耐缺氧效果。二者在抗疲勞方面表現(xiàn)出明確的復(fù)合作用，而在耐缺氧作用方面僅在肝重系數(shù)和斷頭后呼吸方面表現(xiàn)出復(fù)合作用，對與常壓耐缺氧時間并未體現(xiàn)出復(fù)合作用。

機體在運動過程中不斷分解肝糖原進行能量供應(yīng)，因此肝糖原的水平可體現(xiàn)機體抗疲勞的能量儲備[22]。耐缺氧能力是間接反應(yīng)抗疲勞能力的重要指標(biāo)，小鼠常壓耐缺氧實驗和斷頭后張口喘氣實驗是目前研究藥物耐缺氧活性的常用指標(biāo)。基于此，結(jié)合肝中系數(shù)的變化與統(tǒng)計學(xué)差異，考慮薏苡葉和淫羊藿配伍提高了糖原在肝臟中的儲備量，通過提高能量物質(zhì)儲備與能量供給間接提升小鼠的力竭時間與存活時間，宏觀表現(xiàn)為抗缺氧耐疲勞藥理作用的體現(xiàn)。二者配伍的效果優(yōu)于單味藥的原因可能存在三種：首先考慮薏苡葉與淫羊藿兩味中藥之間可能存在相互促進作用，其次考慮二者的融合導(dǎo)致二者中的有效成分之間進行了化學(xué)反應(yīng)生成新物質(zhì)具有強效的抗缺氧耐疲勞作用；第三考慮二者的配伍是否存在某有效物質(zhì)的還原劑，促使其抗氧化效果的提升，基于此可合理推斷，提取液濃度的升高并沒有提高抗缺氧耐疲勞能力。

上述結(jié)果表明，中劑量組的抗疲勞耐缺氧效果優(yōu)于其他各組，且薏苡葉和淫羊藿的水提液對小鼠有較好的抗疲勞性和耐缺氧性，實驗組小鼠的肝重系數(shù)明顯大于空白對照組，其抗疲勞機制可能與肝糖原的生成與儲備有關(guān)，其耐缺氧機制可能與抑制缺氧損傷誘導(dǎo)ROS的生成有關(guān)。