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    Atrolnc-1在制動(dòng)誘導(dǎo)小鼠后肢肌萎縮中的作用研究*

    2021-12-10 01:51:50史華彩佘燕玲周珊瑤
    關(guān)鍵詞:小鼠

    史華彩, 陳 睿, 佘燕玲, 周珊瑤, 雷 斯, 郭 雋

    (廣東省第二人民醫(yī)院, 廣東省傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)與運(yùn)動(dòng)傷害康復(fù)研究所, 廣州 510317)

    肢體制動(dòng)是一種常用的治療手段,在臨床上常用夾板、石膏等限制患肢活動(dòng),防止骨折或其他創(chuàng)傷發(fā)生繼發(fā)性損傷,有利于康復(fù),但長(zhǎng)時(shí)間或者不合理的制動(dòng)會(huì)引起患肢肌肉周?chē)窠?jīng)傳導(dǎo)減慢、局部血供減少、關(guān)節(jié)活動(dòng)度下降等,從而導(dǎo)致肌肉萎縮。另外,肌肉萎縮也會(huì)影響患肢功能恢復(fù)、肌力、耐力,嚴(yán)重者會(huì)影響患者的日常生活,降低生活質(zhì)量,加重家庭甚至社會(huì)經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[1, 2]。因此尋找預(yù)防及治療骨骼肌萎縮的靶點(diǎn)具有重要的臨床意義。

    長(zhǎng)鏈非編碼RNA (long noncoding RNAs,lncRNAs)是一類(lèi)從不完全注釋基因上轉(zhuǎn)錄出來(lái)的,長(zhǎng)度大于200個(gè)核苷酸,幾乎無(wú)編碼能力的RNA[3,4],參與了骨骼肌纖維的形成和穩(wěn)態(tài)等過(guò)程[5,6]。Atrolnc-1是一種與肌萎縮相關(guān)的lncRNA,由Lijing Sun等在慢性腎病小鼠模型中發(fā)現(xiàn),并認(rèn)為Atrolnc-1與A20 binding inhibitor of NF-κB-1(ABIN-1)相互作用,激活NF-κB,促進(jìn)MuRF-1表達(dá)增強(qiáng)[7]。

    本研究主要探討Atrolnc-1在制動(dòng)誘導(dǎo)小鼠后肢肌萎縮中的作用,為其用于臨床治療長(zhǎng)期臥床、石膏固定、缺少運(yùn)動(dòng)等引起的肌萎縮提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

    6周齡雄性C57BL/6小鼠20只,SPF級(jí),體量18~22 g,購(gòu)買(mǎi)于中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,并飼養(yǎng)于廣州永諾生物科技有限公司。所有動(dòng)物適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后,隨機(jī)分為對(duì)照組(Control)和制動(dòng)組(Immobilization),每組10只。本研究對(duì)動(dòng)物的處理方法符合中華人民共和國(guó)科學(xué)技術(shù)部頒發(fā)的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見(jiàn)》。

    1.2 實(shí)驗(yàn)儀器和試劑

    電子秤,上海菁海儀器有限公司;全自動(dòng)樣品快速研磨儀,上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司;全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)掃描成像,上海天能科技有限公司;熒光定量PCR儀,美國(guó)ABI公司;電泳轉(zhuǎn)印系統(tǒng),北京凱元信瑞儀器有限公司。

    蘇木素和伊紅,廣州市凱秀貿(mào)易有限公司;VDAC抗體,美國(guó)CST公司;Atrogin-1(muscle atrophy F-box,Atrogin-1)抗體、MuRF-1(muscle ring finger protein-1,MuRF-1)抗體,英國(guó)Abcam公司;p-NF-κB抗體、Tubulin抗體、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔,美國(guó)Abclonal公司;細(xì)胞核蛋白與細(xì)胞漿蛋白抽提試劑盒,上海碧云天生物技術(shù)有限公司;增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法(ECL)試劑盒,德國(guó)Millipore公司。

    1.3 動(dòng)物制動(dòng)模型的建立

    對(duì)照組:常規(guī)飼養(yǎng),不作任何實(shí)驗(yàn)處理。制動(dòng)組:采用10 mg/ml戊巴比妥鈉0.2 ml腹腔注射麻醉后,將小鼠右側(cè)后肢裝入自制塑料制動(dòng)器,調(diào)節(jié)使之固定,密切注意觀察動(dòng)物肢體的末梢血液循環(huán)及制動(dòng)器固定情況,若發(fā)現(xiàn)有水腫或制動(dòng)器松脫,立即中止該動(dòng)物的實(shí)驗(yàn)。制動(dòng)組小鼠的飼養(yǎng)及環(huán)境條件同對(duì)照組。制動(dòng)2周后[8],將2組小鼠麻醉取材后處死,用于形態(tài)學(xué)觀察、實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time PCR,QRT-PCR)及蛋白免疫印跡(Western blot,WB)檢測(cè)。

    1.4 取材

    麻醉小鼠,于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)操作臺(tái)上仰臥位固定其四肢。取右后肢下段背側(cè),切開(kāi)皮膚,分離腓腸肌并切斷,完整取下,剔除筋膜,用PBS沖洗殘留的血液,并用滅菌紗布吸干,稱取濕重。將組織切成2份,一部分迅速投入液氮后保存在-80℃冰箱,另一部分置于10%中性福爾馬林固定液中固定。

    1.5 蘇木素-伊紅(HE) 染色

    取10%中性福爾馬林固定液中固定的樣本進(jìn)行組織修剪、常規(guī)脫水,石蠟包埋。將包埋好的蠟塊固定于切片機(jī)上,切成5 μm大小的薄片。用二甲苯脫蠟,再經(jīng)由高濃度到低濃度乙醇,最后入蒸餾水。用蘇木素染色5 min,再用1%鹽酸乙醇分化3 s。流水沖洗30 s后入蒸餾水片刻,再入70%和90%酒精中脫水各10 min。用0.5%伊紅染細(xì)胞漿3 min,蘇木素染核。滴上中性樹(shù)脂,蓋上蓋玻片封固。最后在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察。

    1.6 肌纖維橫截面積測(cè)定

    經(jīng)HE染色后,每個(gè)樣本取5張切片,于200倍放大倍數(shù)鏡下,各采集10張圖像,所得圖像用Image J軟件分析肌纖維橫截面積,并計(jì)算均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差。

    1.7 QRT-PCR檢測(cè)Atrogin-1、Atrolnc-1的表達(dá)水平

    用Trizol提取腓腸肌總RNA,核酸蛋白定量?jī)x檢測(cè)RNA的濃度。取總RNA 2 μl,按照Takara試劑盒說(shuō)明反轉(zhuǎn)錄為cDNA,隨后進(jìn)行熒光定量PCR。PCR反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性30 s,95℃變性5 s,60℃退火30 s,40個(gè)循環(huán)。檢測(cè)Atrogin-1、Atrolnc-1的表達(dá),記錄Ct值,以18 s為內(nèi)參,計(jì)算2-△△Ct。上下游引物序列見(jiàn)表1。

    Tab. 1 Sequences of PCR primers

    1.8 蛋白提取定量

    從-80℃冰箱取出組織置于無(wú)菌培養(yǎng)皿中,用眼科剪將肌肉剪碎至肉糜狀,分成兩份:一份加入裂解液于冰上裂解0.5 h,隨后用電動(dòng)勻漿器進(jìn)一步勻漿,使其完全裂解,12 000 r/min,4℃,15 min離心,上清液轉(zhuǎn)至Eppendorf管中,得到總蛋白;另一份行核質(zhì)分離,按照細(xì)胞核蛋白與細(xì)胞漿蛋白抽提試劑盒的步驟操作,最后得到細(xì)胞核蛋白和細(xì)胞漿蛋白。用BCA法蛋白定量,余下樣品加入相應(yīng)體積的6×SDS Loading Buffer,100℃煮沸5 min。

    1.9 Western blot檢測(cè)p-NF-κB、Atrogin-1、MuRF-1蛋白表達(dá)水平

    采用十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰氨凝膠(SDS-PAGF)進(jìn)行電泳,每個(gè)上樣孔中加入40 μg蛋白樣本。開(kāi)始電泳時(shí),電壓為80V,待樣品進(jìn)入分離膠后,增加電壓至120 V,電泳至溴酚藍(lán)抵達(dá)分離膠底部。拆膠,轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上,用200 mA恒流轉(zhuǎn)膜90 min,取膜,浸入5%脫脂牛奶封閉液中,室溫?fù)u床封閉1 h,然后加入p-NF-κB抗體(1∶1 000),Atrogin-1抗體(1∶1 000),MuRF-1抗體(1∶1 000),Tubulin抗體(1∶5 000) ,VDAC抗體(1∶1 000),于4℃孵育過(guò)夜。用TBST液洗膜3次,每次5 min。加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔(1∶5 000),室溫?fù)u床孵育1 h,洗膜。用ECL化學(xué)發(fā)光液顯色,全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)掃描成像。Image J分析蛋白條帶灰度值,以Tubulin、VDAC作為內(nèi)參[9],目的蛋白條帶灰度值與相應(yīng)內(nèi)參蛋白條帶灰度值之比表示相對(duì)蛋白表達(dá)水平。

    1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

    2 結(jié)果

    2.1 制動(dòng)對(duì)小鼠腓腸肌的影響

    兩組小鼠的體重?zé)o明顯差異(P>0.05)。與對(duì)照組比較,制動(dòng)組小鼠腓腸肌濕重減少,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);腓腸肌的濕重/體重千分比明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),提示小鼠制動(dòng)后,腓腸肌出現(xiàn)萎縮(表2)。

    Tab. 2 Comparison of body weight and gastrocnemius wet weight in each n=10)

    2.2 腓腸肌形態(tài)學(xué)改變及肌纖維橫截面積測(cè)定

    兩組腓腸肌經(jīng)HE染色后,光學(xué)顯微鏡下觀察形態(tài)學(xué)改變。結(jié)果顯示:對(duì)照組肌細(xì)胞呈圓形或橢圓形,邊緣規(guī)則,形態(tài)清晰,肌絲排列整齊有序,未見(jiàn)炎癥細(xì)胞、充血等。制動(dòng)組見(jiàn)骨骼肌纖維邊緣不規(guī)則,大量肌纖維縮小或溶解,結(jié)構(gòu)不清,肌纖維橫紋排列紊亂,間質(zhì)見(jiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),部分血管擴(kuò)張充血(圖1A)。

    肌纖維橫截面積測(cè)定結(jié)果顯示,對(duì)照組的肌纖維橫截面積為(3881±379.3)μm2,制動(dòng)組的肌纖維橫截面積為(2725±181.7)μm2,制動(dòng)后肌纖維橫截面積明顯縮小,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),提示小鼠腓腸肌萎縮(圖1B)。

    Fig. 1 Morphological changes of gastrocnemius and the cross-sectional area of muscle fiber (n=10)A: Morphological changes of gastrocnemius between control group and immobilization group(HE staining,original magnification ×200,scale bar=200 μm); B: The cross-sectional area of muscle fiber between control group and immobilization group(μm2)**P<0.01 vs control group

    2.3 制動(dòng)后Atrogin-1 mRNA及蛋白的變化情況

    結(jié)果顯示,QRT-PCR檢測(cè)Atrogin-1 mRNA表達(dá)明顯上升,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01,圖2A)。WB檢測(cè)Atrogin-1蛋白表達(dá)也升高(P<0.01)。提示小鼠制動(dòng)2周后,腓腸肌萎縮(圖2B、表3)。

    Tab. 3 The level of Atrogin-1 protein in each n=3)

    Fig. 2 The mRNA and protein levels of Atrogin-1 after immobilization(n=10)A: The level of Atrogin-1 mRNA; B: The level of Atrogin-1 protein**P<0.01 vs control group

    2.4 制動(dòng)后Atrolnc-1、p-NF-κB蛋白、MuRF-1蛋白的變化情況

    結(jié)果顯示,制動(dòng)2周后,Atrolnc-1的表達(dá)明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01,圖3A);胞漿p-NF-κB蛋白表達(dá)降低(P<0.01),但胞核p-NF-κB蛋白表達(dá)升高(P<0.01)(圖3B、C,表4),同時(shí)MuRF-1表達(dá)也升高(P<0.01)(圖3D,表4)。提示制動(dòng)誘導(dǎo)腓腸肌萎縮,其機(jī)制可能是Atrolnc-1激活NF-κB,促進(jìn)NF-κB磷酸化并入核,從而上調(diào)MuRF-1的表達(dá)。

    Fig. 3 The expressions of Atrolnc-1 and the protein level of p-NF-κB and MuRF-1 after immobilization(n=10)A: The level of Atrolnc-1; B: The level of p-NF-κB protein in cytoplasm; C: The level of p-NF-κB protein in nucleus; D: The level of MuRF-1 protein**P<0.01 vs control group

    Tab. 4 The levels of p-NF-κB and MuRF-1 protein in each group(%, n=3)

    3 討論

    制動(dòng)誘導(dǎo)的肌萎縮常發(fā)生在骨折、長(zhǎng)期臥床、缺少運(yùn)動(dòng)、神經(jīng)麻痹等條件下[10-12]。Atrogin-1和MuRF-1為肌肉萎縮的標(biāo)志性基因,在許多動(dòng)物模型(制動(dòng)、去神經(jīng)、禁食等)中,其表達(dá)均上調(diào)[8, 13, 14]。我們前期發(fā)現(xiàn),二氯化鈷模擬缺氧可誘導(dǎo)肌萎縮,Atrogin-1的表達(dá)量也升高[15]。本研究發(fā)現(xiàn),小鼠后肢制動(dòng)2周后,腓腸肌的濕重/體重千分比明顯降低,光學(xué)顯微鏡下可見(jiàn)大量肌纖維溶解,測(cè)量肌纖維橫截面積減小,Atrogin-1和MuRF-1表達(dá)均升高,提示制動(dòng)誘導(dǎo)肌萎縮。

    近年來(lái),隨著高通量測(cè)序及基因芯片技術(shù)的發(fā)展,研究人員發(fā)現(xiàn)了一些與骨骼肌發(fā)育相關(guān)的lncRNA,可通過(guò)不同的調(diào)控機(jī)制靶向關(guān)鍵因子,參與調(diào)控骨骼肌發(fā)育的各個(gè)環(huán)節(jié),包括骨骼肌細(xì)胞的增殖、分化、融合和萎縮等[7, 16-20]。最近文獻(xiàn)報(bào)道,Atrolnc-1的過(guò)度表達(dá)導(dǎo)致慢性腎病小鼠肌纖維萎縮。在本研究中,QRT-PCR檢測(cè)到制動(dòng)后小鼠腓腸肌Atrolnc-1表達(dá)升高,提示Atrolnc-1可能參與調(diào)控制動(dòng)誘導(dǎo)的肌萎縮。

    文獻(xiàn)報(bào)道,過(guò)表達(dá)Atrolnc-1 48h后,C2C12細(xì)胞核中NF-κB(p65)明顯增加[7]。本研究中,制動(dòng)誘導(dǎo)小鼠腓腸肌萎縮后,Atrolnc-1表達(dá)升高,胞漿p-NF-κB蛋白表達(dá)降低,但胞核p-NF-κB蛋白表達(dá)升高。這些結(jié)果提示在制動(dòng)誘導(dǎo)肌萎縮的模型中,Atrolnc-1的表達(dá)升高可能激活了NF-κB,并促進(jìn)其入核。據(jù)劉亞南報(bào)道,在心肌梗死大鼠模型中,間歇運(yùn)動(dòng)降低TNF-a水平,升高HSP70的表達(dá),抑制NF-κB磷酸化水平的同時(shí)MuRF-1表達(dá)降低,從而保護(hù)心肌[21]。最近有文獻(xiàn)報(bào)道,將CRISPR/dCas9介導(dǎo)的協(xié)同激活介質(zhì)轉(zhuǎn)錄激活系統(tǒng)用于過(guò)表達(dá)ABIN-1的C2C12細(xì)胞系,發(fā)現(xiàn)ABIN-1過(guò)表達(dá)抑制MuRF-1表達(dá)[7]。因此,入核的NF-κB可以促進(jìn)MuRF-1的轉(zhuǎn)錄。MuRF-1屬于泛素蛋白連接酶,與骨骼肌蛋白質(zhì)的分解代謝密切相關(guān)[22]。本研究也檢測(cè)到胞核p-NF-κB蛋白表達(dá)升高的同時(shí),MuRF-1表達(dá)也上調(diào)。因此,我們推測(cè)制動(dòng)誘導(dǎo)肌萎縮的機(jī)制可能是Atrolnc-1激活NF-κB,促進(jìn)NF-κB磷酸化并入核,使MuRF-1的表達(dá)增強(qiáng),并引起肌肉蛋白的降解,從而導(dǎo)致肌萎縮。

    綜上所述,Atrolnc-1可在一定程度上促進(jìn)制動(dòng)誘導(dǎo)的肌萎縮,可能通過(guò)促進(jìn)NF-κB磷酸化并入核,增加MuRF-1的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)。因此,Atrolnc-1可能是肢體制動(dòng)或其他疾病引起肌萎縮的潛在治療靶點(diǎn),為肌萎縮的治療和康復(fù)提供了一個(gè)新的方向。

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