丁苯酞對(duì)哮喘小鼠氣道黏液高分泌及IL-13、TNF-α的影響*

龐亞蓉， 杜 玥， 王志旺， 席建宏， 李濟(jì)陽， 韋凌霞， 丁茂鵬， 程小麗

(甘肅中醫(yī)藥大學(xué), 蘭州 730000)

支氣管哮喘(簡稱哮喘)是以氣道慢性炎癥為特征的異質(zhì)性疾病，黏液高分泌是哮喘的基本病理特點(diǎn)[1]，而目前臨床上尚未見確切有效的抑制黏液高分泌的藥物[2]?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》謂當(dāng)歸“主咳逆上氣”而臨床用于治療哮喘，丁苯酞是當(dāng)歸苯酞類成分之一。丁苯酞首次發(fā)現(xiàn)于芹菜，目前主要用于治療缺血性腦卒中[3]。前期研究表明，丁苯酞具有抗炎、鎮(zhèn)咳和祛痰作用[4]，而進(jìn)一步研究顯示丁苯酞對(duì)豚鼠哮喘有明顯的治療作用[5]。本次研究采用卵清白蛋白復(fù)制過敏性哮喘小鼠模型，研究丁苯酞對(duì)哮喘氣道黏液高分泌及IL-13、TNF-α的影響，為其臨床治療哮喘提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

上海源葉生物科技有限公司生產(chǎn)的丁苯酞(Butylphthalide, NBP)，批號(hào)：20180216，丁苯酞含量98.6%(HPLC法)，使用前以0.5%聚山梨酯-80為乳化劑配置成乳劑；國藥集團(tuán)容生制藥有限公司生產(chǎn)的地塞米松磷酸鈉注射液(Dexamethasone, DEX)，國藥準(zhǔn)字：H41020036，批號(hào)：18011902；Sigma公司生產(chǎn)的卵清白蛋白(Ovalbumin, OVA)，批號(hào)：SLBF0342V(Grade V)。南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的IL-13、TNF-α及Muc5ac試劑盒(ELISA)，批號(hào)：20180402、20180401、20180305；北京博奧森生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的Muc5ac免疫組化試劑盒，批號(hào)：180405W。

1.2 儀器

美國CH Technologies公司生產(chǎn)的全身暴露/鼻部暴露吸入染毒系統(tǒng)(GYD-CHT)，德國Sartorius集團(tuán)生產(chǎn)的電子天平(BS1103)，成都泰盟科技有限公司生產(chǎn)的醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)(BI-2000)，日本Olympus生產(chǎn)的光學(xué)顯微鏡(CH-212)，北京普利生儀器有限公司生產(chǎn)的全自動(dòng)血液流變儀(LBY-N6COMPACT)。

1.3 動(dòng)物

中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所提供的SPF級(jí)雌性BALB/c小鼠(62000600000082)，體質(zhì)量16～20 g，飼養(yǎng)于甘肅中醫(yī)藥大學(xué)科研實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(00000115)。

1.4 致敏、激發(fā)與給藥

取BALB/c小鼠隨機(jī)分為6組(n=12)，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。參考文獻(xiàn)與預(yù)實(shí)驗(yàn)[6]，實(shí)驗(yàn)第1日開始致敏，模型對(duì)照組(Asthma)、陽性對(duì)照組(DEX 1.0 mg/kg)以及丁苯酞各干預(yù)組(NBP-H 100 mg/kg、NBP-M 50 mg/kg、NBP-L 25 mg/kg)小鼠ip致敏液(為20 μg OVA與2 mg氫氧化鋁的生理鹽水混懸液)每只200 μl，空白對(duì)照組(Control)以生理鹽水替代；第8日、15日同法再次致敏。實(shí)驗(yàn)第22日開始激發(fā)，將小鼠置于染毒系統(tǒng)中，讓其吸入超聲霧化的1% OVA激發(fā)液30 min，3次/周，連續(xù)5周，空白對(duì)照組以生理鹽水替代；各組激發(fā)前30 min按上述劑量灌胃給藥20 ml/kg，其中空白對(duì)照組與模型對(duì)照組灌胃等量0.5%聚山梨酯-80，1次/日，連續(xù)5周。

1.5 觀測哮喘行為學(xué)

實(shí)驗(yàn)第54日，霧化吸入2% OVA激發(fā)液120 s后，觀察10 min內(nèi)小鼠哮喘行為學(xué)指標(biāo)，參考文獻(xiàn)[7]方法對(duì)小鼠打噴嚏、抓鼻及哮喘發(fā)作癥狀進(jìn)行半定量分析。

1.6 提取并分析BALF

實(shí)驗(yàn)第57日，1%戊巴比妥鈉麻醉小鼠后，手術(shù)暴露氣管，將右支氣管結(jié)扎，用生理鹽水灌洗左支氣管及肺泡，將所得支氣管肺泡灌洗液(BALF)3 000 r/min離心10 min，取BALF上清液測定其粘度并檢測Muc5ac、IL-13及TNF-α的含量。

1.7 分析肺組織杯狀細(xì)胞增生與黏蛋白表達(dá)

于固定位置取右肺組織，通過多聚甲醛固定、石蠟包埋、切片，依次經(jīng)碘酸、Schiff、蘇木素染色(PAS染色)，200倍光鏡下觀察杯狀細(xì)胞增生及黏蛋白表達(dá)并進(jìn)行半定量分析。在每只小鼠肺組織中找出5個(gè)完整的細(xì)支氣管(直徑150～200 μm)，數(shù)出每個(gè)細(xì)支氣管上皮區(qū)域內(nèi)PAS染色陽性細(xì)胞數(shù)(即杯狀細(xì)胞數(shù))，測定細(xì)支氣管的最大直徑與最小直徑，按橢圓形計(jì)算細(xì)支氣管的周長，用細(xì)支氣管單位周長杯狀細(xì)胞數(shù)(杯狀細(xì)胞數(shù)/細(xì)支氣管的周長)來衡量杯狀細(xì)胞的增生程度[8]。另取肺組織切片，經(jīng)免疫組化染色，觀察Muc5ac的表達(dá)特點(diǎn)，采用BI-2000型醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)對(duì)其進(jìn)行半定量分析。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 丁苯酞對(duì)小鼠哮喘行為學(xué)的影響

造模后期，小鼠激發(fā)后出現(xiàn)明顯的打噴嚏、抓鼻子，部分動(dòng)物出現(xiàn)呼吸急促、煩躁不安甚至呼吸困難等哮喘癥狀。對(duì)上述呼吸道癥狀進(jìn)行定量分析，結(jié)果顯示，和空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組小鼠打噴嚏、抓鼻次數(shù)顯著增加，哮喘發(fā)作的癥狀顯著加重(P<0.01，表1)；采用不同劑量丁苯酞干預(yù)后，上述哮喘行為學(xué)評(píng)分明顯下降，和模型對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

Tab. 1 Effects of NBP on asthma behaviors in mice n=12)

2.2 丁苯酞對(duì)哮喘小鼠氣道上皮杯狀細(xì)胞及其黏液分泌的影響

肺組織經(jīng)PAS染色后，氣道杯狀細(xì)胞及酸性黏蛋白被染成紫藍(lán)色顆粒狀?？瞻讓?duì)照組小鼠肺組織鏡下染色較淺，氣道上皮杯狀細(xì)胞偶見，黏液不明顯(圖1A)；模型對(duì)照組小鼠肺組織染色明顯加深，氣道上皮有大量杯狀細(xì)胞，杯狀細(xì)胞及氣道內(nèi)充滿黏液(圖1B)；經(jīng)丁苯酞干預(yù)后，小鼠肺組織染色不同程度變淺，氣道上皮杯狀細(xì)胞減少，氣道內(nèi)黏液量下降(圖1D～1F)。對(duì)氣道上皮中杯狀細(xì)胞進(jìn)行定量分析(表2)，表2結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組小鼠氣道上皮杯狀細(xì)胞數(shù)顯著增加；丁苯酞不同劑量組小鼠氣道上皮杯狀細(xì)胞數(shù)明顯減少，與模型對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

Fig. 1 Effects of NBP on goblet cell and mucus secretion in airway of asthmatic mice (PAS staining ×200)A: Control group; B: Asthma group; C: DEX group; D: NBP-H group; E: NBP-M group; F: NBP-L group

2.3 丁苯酞對(duì)哮喘小鼠氣道Muc5ac表達(dá)的影響

在400倍鏡下，氣道上皮及氣道內(nèi)壁被染成灰黑色團(tuán)塊狀者為黏蛋白5ac(Muc5ac)?？瞻讓?duì)照組小鼠氣道上皮及氣道內(nèi)Muc5ac不明顯(圖2A)；模型對(duì)照組小鼠肺組織、尤其是氣道上皮及氣道內(nèi)Muc5ac明顯增加(圖2B)，經(jīng)丁苯酞干預(yù)后Muc5ac表達(dá)減少(圖2D～2F)。對(duì)Muc5ac進(jìn)行半定量分析結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組小鼠肺組織Muc5ac表達(dá)的平均光密度值顯著增加(P< 0.01，表2)；經(jīng)丁苯酞干預(yù)后，氣道Muc5ac表達(dá)明顯減少，與模型對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.01)。

Fig. 2 Effects of NBP on Muc5ac in airway of asthmatic mice (Immunostaining ×400)A: Control group; B: Asthma group; C: DEX group; D: NBP-H group; E: NBP-M group; F: NBP-L group

Tab. 2 Effects of NBP on goblet cell and Muc5ac in asthmatic lung tissues of mice n=12)

2.4 丁苯酞對(duì)哮喘小鼠BALF粘度的影響

與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組小鼠支氣管肺泡灌洗液(BALF)的粘度顯著升高(P<0.01, 表3)；與模型對(duì)照組比較，經(jīng)丁苯酞干預(yù)后，BALF在低切、中切及高切狀態(tài)下粘度呈不同程度的降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05, 0.01)。

Tab. 3 Effects of NBP on viscosity of BALF in asthmatic mice n=12)

2.5 丁苯酞對(duì)哮喘小鼠BALF中Muc5ac、IL-13及TNF-α的影響

與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組小鼠支氣管肺泡灌洗液(BALF)中Muc5ac、IL-13及TNF-α顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，表4)；在不同劑量丁苯酞的作用下上述指標(biāo)明顯下降，與模型對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

Tab. 4 Effects of NBP on Muc5ac, IL-13 and TNF-α in BALF of asthmatic mice n=12)

3 討論

1978年楊峻山首次從芹菜籽中分離出左旋丁苯酞，隨后發(fā)現(xiàn)丁苯酞廣泛存在于多種植物中，是當(dāng)歸、川穹、藁本等中藥中苯酞類成分之一。目前大量研究顯示丁苯酞對(duì)腦卒中有明顯的保護(hù)作用，已成為治療輕、中度急性缺血性腦卒中的常用藥[9]?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》記載當(dāng)歸具有“主咳逆上氣”之功，臨床用于治療痰、咳、喘等呼吸系統(tǒng)疾病，而作為當(dāng)歸成分之一的丁苯酞對(duì)腦卒中后腦組織炎癥反應(yīng)有明顯的抑制作用[10]；同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)丁苯酞對(duì)哮喘豚鼠模型有治療作用[5]。本次研究采用卵清白蛋白(OVA)復(fù)制哮喘動(dòng)物模型，隨著激發(fā)次數(shù)的增加，模型對(duì)照組小鼠出現(xiàn)打噴嚏、抓鼻及撓癢等行為，部分小鼠表現(xiàn)出哮喘發(fā)作的癥狀。在實(shí)驗(yàn)后期對(duì)小鼠的上述哮喘行為學(xué)進(jìn)行半定量分析，結(jié)果顯示丁苯酞可明顯降低小鼠上述哮喘行為學(xué)評(píng)分，緩解哮喘上呼吸道癥狀。

支氣管哮喘(簡稱哮喘)是呼吸道慢性炎癥性疾病，氣道黏液高分泌是哮喘的基本特征之一。氣道黏液是由多種成分組成的水凝膠，對(duì)呼吸道氣體進(jìn)行加濕、加熱并吸附氣道異物，最后在氣道纖毛的推動(dòng)下以痰的形式吐出[11]。氣道黏液高分泌是哮喘的基本病理特征，也是多種呼吸系統(tǒng)疾病發(fā)病甚至死亡的原因之一[12]。氣道炎癥改變了粘膜微環(huán)境而引發(fā)黏液高分泌，而過度分泌的氣道黏液攜帶大量炎癥活性物質(zhì)并形成凝膠型粘液栓，堵塞細(xì)支氣管而引起哮喘急性發(fā)作甚至致死[13]。氣道黏液中黏蛋白的含量不高(約2%)，但是黏液粘彈性的主要來源，目前氣道黏液中的黏蛋白已發(fā)現(xiàn)20余種，而由氣道杯狀細(xì)胞分泌的黏蛋白5ac(Muc5ac)是哮喘、特別是哮喘持續(xù)狀態(tài)患者痰液中的主要黏性成分[14]。本研究采用OVA復(fù)制哮喘動(dòng)物模型，實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)哮喘小鼠氣道上皮杯狀細(xì)胞明顯增加，Muc5ac呈高表達(dá)態(tài)勢，BALF中Muc5ac的含量明顯增加，導(dǎo)致氣道黏液的粘度升高；在丁苯酞的干預(yù)下，氣道杯狀細(xì)胞數(shù)及Muc5ac的分泌明顯下降，氣道黏液的粘度下降。

目前研究顯示，白介素-13(IL-13)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)與哮喘氣道杯狀細(xì)胞增生及黏蛋白高表達(dá)有密切的關(guān)系。在IL-13缺乏的條件下，其它活性因子都不能誘導(dǎo)氣道黏蛋白的分泌，只有完全阻斷IL-13才能抑制氣道黏蛋白的分泌[15]；TNF-α與TNF受體相關(guān)因子2(TRAF2)結(jié)合后才能介導(dǎo)Muc5ac基因的表達(dá)[16]。本研究中發(fā)現(xiàn)，丁苯酞可降低BALF中IL-13、TNF-α的水平，提示丁苯酞抑制杯狀細(xì)胞化生及Muc5ac高表達(dá)可能與抑制IL-13、TNF-α有關(guān)。