橘皮素與乳清蛋白的合用對短跑運動員冬訓(xùn)期間血清睪酮、皮質(zhì)醇水平的影響*

劉 猛， 莫仕圍， 秦春莉， 呂冰強(qiáng)， 周志欽， 高炳宏△

(1. 上海體育學(xué)院體育教育訓(xùn)練學(xué)院， 上海 200438； 2. 深圳大學(xué)體育部 體育與健康科學(xué)研究中心， 深圳 518061； 3. 西南大學(xué)，重慶 400700； 4. 重慶市體育科學(xué)研究所， 重慶 400010)

冬訓(xùn)是運動員年度訓(xùn)練的關(guān)鍵組成部分，具有運動強(qiáng)度高、持續(xù)時間久等特點。長期高強(qiáng)度運動會降低體內(nèi)睪酮含量和升高皮質(zhì)醇水平,進(jìn)而抑制蛋白合成、延長疲勞恢復(fù)周期，最終導(dǎo)致運動能力下降和傷病風(fēng)險增加[1-3]。因此，如何維持冬訓(xùn)期運動員體內(nèi)睪酮水平并同時抑制機(jī)體過度分泌皮質(zhì)醇，是體育科學(xué)研究的熱點與重點。營養(yǎng)補(bǔ)劑有助維持或提升睪酮水平、抑制皮質(zhì)醇過度分泌，是提升冬訓(xùn)效果的有效方法之一[2]。天然果蔬補(bǔ)劑，如，橘皮素補(bǔ)劑，作為一種新型營養(yǎng)補(bǔ)劑，具有綠色天然、無違禁物質(zhì)且毒副作用低等優(yōu)點，已受到眾多運動員和科研人員的青睞。

橘皮素是柑橘屬多甲氧基黃酮單體，主要提取于柑橘類水果的皮莖，具有抗炎、抗氧化、抗癌及預(yù)防心血管疾病等功能[4]。與其它黃烷酮單體相比，橘皮素口服安全性好，吸收利用率高，更適用于運動員群體。本團(tuán)隊曾率先對橘皮素在運動領(lǐng)域的應(yīng)用做了探索性研究[5,6]，發(fā)現(xiàn)：橘皮素能顯著提升昆明鼠的運動耐力，增強(qiáng)抗氧化酶活性，有效減少了力竭運動誘發(fā)的氧化應(yīng)激損傷；舉重運動員在冬訓(xùn)期補(bǔ)充橘皮素4周后，主觀疲勞感明顯消除，血清睪酮水平升高，血清皮質(zhì)醇水平顯著下降。因此，橘皮素對運動員身體機(jī)能的提升和疲勞的消除可能會產(chǎn)生積極影響。

橘皮素因活性功能多樣已備受關(guān)注[4]。最新研究[7]發(fā)現(xiàn)，橙皮苷——橘皮素主要提取原料——可抑制新冠病毒S蛋白受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域與ACE2(新冠病毒人類受體)相互作用，可能對抑制新冠病毒致病性起重要作用。但是，橘皮素在運動領(lǐng)域的應(yīng)用研究仍處于探索階段，尚有諸多問題亟待解決。本團(tuán)隊前期的試驗研究[6]，因條件限制，未能嚴(yán)格控制運動員的飲食、訓(xùn)練等；加之樣本量較少(n=10),且缺少對照組，不能充分證明血清睪酮、皮質(zhì)醇等生化指標(biāo)的積極變化全部源于橘皮素干預(yù)?；诖耍狙芯刻接?周補(bǔ)充橘皮素對短跑運動員冬訓(xùn)期間血清睪酮、皮質(zhì)醇及超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、促腎上腺皮質(zhì)激素(adrenocorticotropic hormone，ACTH)等生化指標(biāo)和身體成分指標(biāo)的影響。本研究有助深入認(rèn)識橘皮素對運動員身體機(jī)能的影響，為橘皮素補(bǔ)劑應(yīng)用于運動領(lǐng)域，助力東京夏奧會和北京冬奧會備戰(zhàn)，提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 受試者

選取重慶市24名專業(yè)短跑運動員(男女各12)為受試對象，運動等級均為國家二級及以上水平。研究期間，所有運動員均由同一教練組負(fù)責(zé)，訓(xùn)練方案(內(nèi)容、強(qiáng)度和負(fù)荷等)基本相同，且全程由同1名研究人員監(jiān)督完成。本研究采用配對、隨機(jī)分組的試驗設(shè)計。按照性別、形態(tài)及運動等級將受試者逐一配對后，隨機(jī)分為對照組和試驗組。對照組服用安慰劑(分離乳清蛋白粉，純度95%，Cansure Inc.，美國；興奮劑檢測編號：2019FD279)，每天20 g。試驗組服用本團(tuán)隊自研產(chǎn)品——“清果人”橘皮素補(bǔ)劑(生產(chǎn)許可編號：SC10611310113704；興奮劑檢測編號：2019FD234)，每天20 g，其中包括19.8 g分離乳清蛋白粉(純度95%，Cansure Inc.，美國)和200 mg橘皮素(純度99.79%)。

受試者均經(jīng)過系統(tǒng)的醫(yī)學(xué)檢查，排除患有抑郁癥、心血管疾病、庫欣綜合征或近五年曾患重大疾病者。受試者詳細(xì)了解研究內(nèi)容、流程及潛在風(fēng)險后，簽署知情同意書。本研究嚴(yán)格遵守《赫爾辛基宣言》且已獲上海體育學(xué)院學(xué)術(shù)與倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 數(shù)據(jù)采集與處理

本研究于2019年運動員冬訓(xùn)期間開展，為期4周(日期：21/10-17/11)。研究人員在每周的第一天(T1、T2、T3、T4)及試驗結(jié)束后次日(T5)采集受試者空腹靜脈血4 ml(圖1)。受試者在每日上午7:30-8:30進(jìn)入實驗室領(lǐng)取并現(xiàn)場服用橘皮素補(bǔ)劑或安慰劑，其中，采血當(dāng)天，受試者在采血后3～5 min內(nèi)服用補(bǔ)劑或安慰劑，全程由研究人員監(jiān)督完成。血樣采集后30 min內(nèi)，利用高速離心機(jī)(蜀科TG16，中國)分離出血清樣本(2 000 r/min,15 min)，并存儲于-80℃冰箱(博科BDF-86V158，中國)。全部采樣結(jié)束，使用全自動生化分析儀(邁瑞SAL-6000，中國)和分光光度計(BioTek-Epoch，美國)分析血清樣本，記錄血清睪酮、皮質(zhì)醇、SOD及ACTH值，并計算血清睪酮/皮質(zhì)醇比(T/C比值)。

Fig. 1 Experiment and training schedule

試驗開始當(dāng)天(T1)和結(jié)束后次日(T5)，研究人員測量受試者的身體成分。要求受試者著輕便衣物，靜止站立于身體成分測試儀(InBody 570，韓國)。整個試驗過程中，嚴(yán)格控制并詳細(xì)記錄每位受試者的飲食情況；全部受試者從研究開始前2周至研究結(jié)束(共42 d)禁止服用除指定運動飲料(佳得樂，美國)之外的任何其它補(bǔ)劑及中藥材等[8]。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

通過SPSS 25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用雙因素(2個組別×5個時間點)重復(fù)測量方差分析受試者的身體成分指標(biāo)(體重、體脂率、脂肪量和肌肉量)和生化指標(biāo)(血清睪酮、皮質(zhì)醇、T/C比值、SOD及ACTH)。如有顯著性差異，基于LSD標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行事后兩兩比較。

2 結(jié)果

2.1 受試者分組情況

試驗組和對照組各12人，均為6男6女，基本情況見表1。兩組受試者的身高、體重及年齡無顯著性差異。

2.2 橘皮素對身體成分的影響

試驗組和對照組試驗前后的身體成分指標(biāo)可見表2。試驗開始前，試驗組和對照組無統(tǒng)計學(xué)差異；試驗結(jié)束后，試驗組的體重、肌肉量顯著高于對照組(P<0.01)，體脂率顯著低于對照組(P<0.01)。試驗前后比較，對照組的各項身體成分無顯著性差異；試驗組的體重、肌肉量顯著增加(P<0.05)，體脂率、脂肪量顯著下降(P<0.05)。

2.3 橘皮素對身體機(jī)能生化指標(biāo)的影響

試驗組和對照組在試驗前、中、后的各項生化指標(biāo)可見表3。試驗前(T1)，試驗組與對照組的各項生化指標(biāo)均無顯著差異。試驗期間，對照組的血清睪酮持續(xù)下降，且在T3、T4及T5時顯著低于T1(P<0.05)；試驗組的血清睪酮雖有波動，但始終維持在初始水平，與T1無顯著差異；同時，試驗組的血清睪酮在T3和T5時顯著高于對照組(P<0.05)。

試驗期間，對照組的血清皮質(zhì)醇呈上升趨勢，試驗組的血清皮質(zhì)醇逐步下降，并在試驗結(jié)束時(T5)顯著低于初始值(T1)(P<0.01)，且顯著低于同期對照組(P<0.05)；對照組的T/C比值持續(xù)下降，試驗組的T/C比值逐步上升，且在試驗結(jié)束時(T5)大于前者，但兩組之間無顯著差異；對照組的SOD活性水平逐步降低，并在T5時顯著低于T1(P< 0.05)，試驗組的SOD活性水平小幅上升，但與T1相比無顯著差異；對照組的ACTH波動升高，試驗組的ACTH逐步下降，并在試驗結(jié)束時(T5)顯著低于初始值(T1)(P<0.01)。

Tab. 1 Subject grouping and n=12)

Tab. 2 The effects of intake tangeretin on body n=12)

Tab. 3 Effects of intake tangeretin on sreum testosterone, cortisol, T/C ratio, SOD and n=12)

T/C ratioCGEGSOD (U/ml)CGEGACTH (nmol/L)CGEGT10.21±0.190.21±0.2066.99±2.6961.33±12.03#3.58±1.093.96±0.94T20.20±0.180.23±0.2165.39±3.1463.12±5.012.56±1.232.96±0.77T30.18±0.180.21±0.2060.41±8.0765.48±4.672.41±1.242.58±1.32T40.16±0.160.19±0.1858.43±8.9760.96±4.663.36±1.113.05±0.84T50.16±0.170.27±0.33#60.47±7.66?63.49±6.073.61±1.792.91±0.92??

3 討論

本研究旨在探討4周橘皮素補(bǔ)充對冬訓(xùn)期間短跑運動員的血清睪酮、皮質(zhì)醇等生化指標(biāo)和身體成分的影響。研究發(fā)現(xiàn)：連續(xù)補(bǔ)充橘皮素4周、每天200 mg后，短跑運動員的血清睪酮維持穩(wěn)定，血清皮質(zhì)醇水平顯著下降，SOD活性水平上升；肌肉量明顯增加，體脂率和脂肪量顯著下降。上述結(jié)果提示，橘皮素補(bǔ)充能降低高強(qiáng)度運動造成的機(jī)體氧化應(yīng)激，維持機(jī)體血清睪酮水平，有效抑制皮質(zhì)醇過度分泌，改善身體成分。

睪酮的正常分泌對生殖器官發(fā)育、骨骼肌合成及骨密度維持等至關(guān)重要[1]。冬訓(xùn)期間，持續(xù)高強(qiáng)度運動導(dǎo)致生殖器官內(nèi)自由基數(shù)量激增，進(jìn)而抑制睪酮合成[1,3]。Córdova等[9]報道，持續(xù)3周高強(qiáng)度運動后，自行車運動員體內(nèi)的自由基數(shù)量驟增，并因此導(dǎo)致體內(nèi)血清睪酮水平下降。Slivka等[10]發(fā)現(xiàn)，3周山地越野自行車賽(3 211 km)結(jié)束，參賽選手的血清睪酮和SOD活性水平均顯著下降。本研究觀察到，對照組短跑運動員4周冬訓(xùn)結(jié)束，血清睪酮和SOD活性水平均顯著低于初始值；試驗組的血清睪酮維持穩(wěn)定，SOD活性水平小幅上升。研究[11]指出，補(bǔ)充抗氧化劑是清除體內(nèi)過量自由基，維持或提升睪酮水平的有效手段之一。作為天然抗氧化劑，橘皮素的抗氧化功效已被多項研究證實。細(xì)胞實驗[12]發(fā)現(xiàn)，橘皮素能顯著減少過氧化氫叔丁基(tert-butylhydroperoxide, t-BHP)誘發(fā)的HepG2細(xì)胞氧化損傷，抑制過量產(chǎn)生自由基。動物實驗[6]發(fā)現(xiàn)，橘皮素能顯著增強(qiáng)小鼠體內(nèi)抗氧化酶活性，緩解劇烈運動造成的骨骼肌、心肌氧化應(yīng)激損傷。本研究進(jìn)一步從人體試驗層面提供論證，發(fā)現(xiàn)：補(bǔ)充4周橘皮素后，試驗組的SOD活性水平小幅上升，血清睪酮保持穩(wěn)定，且在T2、T3、T5顯著高于對照組。綜上，橘皮素可能通過作用于生殖器官內(nèi)的自由基來保護(hù)睪酮合成酶活性，進(jìn)而促進(jìn)睪酮合成分泌，保證高強(qiáng)度運動訓(xùn)練期間，運動員體內(nèi)睪酮水平維持穩(wěn)定。

皮質(zhì)醇能通過抑制下丘腦-垂體-性腺軸與睪丸間質(zhì)細(xì)胞分泌睪酮，間接降低睪酮水平。研究[1,10]證實，長期高強(qiáng)度運動會刺激腎上腺分泌大量皮質(zhì)醇，造成血液皮質(zhì)醇濃度升高。與其它研究報道相似[11,12]，本研究發(fā)現(xiàn)，對照組的血清皮質(zhì)醇水平逐步上升，而試驗組的血清皮質(zhì)醇水平緩慢下降，且在試驗結(jié)束時顯著低于初始值(T1)及同期對照組；另外，在補(bǔ)充橘皮素4周過程中，試驗組運動員的血清皮質(zhì)醇水平始終保持在正常范圍內(nèi)(5～23 μg/dl[13])。因此，本研究認(rèn)為，橘皮素能緩解長期劇烈運動誘發(fā)的血清睪酮下降，可能與其對皮質(zhì)醇分泌的抑制作用有關(guān)。

皮質(zhì)醇與ACTH緊密相關(guān)，后者直接影響前者的分泌[14]。An等[15]報道，補(bǔ)充4周小補(bǔ)心湯(50 mg/kg總類黃酮)后，實驗鼠的血清皮質(zhì)醇和ACTH水平顯著下降。Kraemer等[2]也發(fā)現(xiàn)，口服4周混合類黃酮補(bǔ)劑后，10名男性受試者安靜狀態(tài)下的血清皮質(zhì)醇與ACTH均顯著性下降。上述研究認(rèn)為，類黃酮能抑制ACTH，進(jìn)而減少皮質(zhì)醇生成。本研究中，對照組和試驗組的ACTH變化趨勢大體一致，均在T2和T3時下降，T4時上升。試驗組的ACTH雖受運動強(qiáng)度影響而略有波動，但與血清皮質(zhì)醇變化基本保持一致，整體呈下降趨勢，與其它研究結(jié)果一致[2,15]。

人體腎上腺皮質(zhì)癌細(xì)胞(H295R細(xì)胞)是皮質(zhì)醇分泌的主要場所[16]。研究發(fā)現(xiàn)，類黃酮會抑制H295R細(xì)胞內(nèi)3β-羥基類固醇脫氫酶和細(xì)胞色素P450酶的活性，進(jìn)而減少皮質(zhì)醇的合成。Ohno等[8]報道，M6-羥基黃酮(IC50=0.5～2.7 μmol/L)能有效抑制3β-羥基類固醇脫氫酶和細(xì)胞色素P450酶的活性，減少皮質(zhì)醇分泌(-43%)。Hasegawa等[17]發(fā)現(xiàn)，橙皮素(IC50=10 μmol/L)與柚皮苷(IC50=30 μmol/L)均可有效抑制H295R細(xì)胞內(nèi)3β-羥基類固醇脫氫酶的活性，顯著降低脫氧皮質(zhì)酮水平。橘皮素與上述三種活性物質(zhì)同屬類黃酮亞族——多甲氧基黃酮(PMFs)[4]，它們的化學(xué)結(jié)構(gòu)與活性功能均高度相似。由此推測，橘皮素或許能通過抑制3β-羥基類固醇脫氫酶等的活性，降低皮質(zhì)醇的合成，但此假設(shè)有待論證。

T/C比值是反映肌肉合成代謝的關(guān)鍵指標(biāo)。本研究發(fā)現(xiàn)，試驗結(jié)束后，對照組的T/C比值明顯下降(-24%)，試驗組的T/C比值卻顯著增加(+38%)。目前雖無直接證據(jù)表明補(bǔ)充乳清蛋白會對睪酮、皮質(zhì)醇產(chǎn)生影響[18]，但是，冬訓(xùn)期間補(bǔ)充升睪(或抑制皮質(zhì)醇)補(bǔ)劑提升T/C比值，輔以補(bǔ)充乳清蛋白，能有效增加肌肉總量，并防止長期高強(qiáng)度運動導(dǎo)致肌肉質(zhì)量和力量丟失[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，冬訓(xùn)期間配合補(bǔ)充橘皮素，對照組與試驗組4周后的肌肉量均有增加，但試驗組增加了2.36%，對照組僅增加1.03%。這可能主要因為橘皮素能促進(jìn)睪酮合成及抑制皮質(zhì)醇分泌。另外，本研究中，試驗組服用由橘皮素(200 mg)和乳清蛋白粉(19.8 g)組成的混合補(bǔ)劑。有研究指出，植物蛋白能改善機(jī)體利用橘皮素的效率[20]，但兩者之間的相互作用機(jī)制尚不清楚。因此，本研究中觀察到的結(jié)果是否歸因于橘皮素與乳清蛋白之間的合成作用，由于缺少相關(guān)研究，尚需進(jìn)一步研究。

本研究首次將橘皮素補(bǔ)劑用于輔助爆發(fā)力項目運動員冬訓(xùn)。研究發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)充橘皮素能減少冬訓(xùn)期間高強(qiáng)度運動引起的機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)，維持血清睪酮水平穩(wěn)定，抑制血清皮質(zhì)醇過度分泌，增大T/C比值，促進(jìn)肌肉合成，改善身體成分，加速身體對高強(qiáng)度運動負(fù)荷的適應(yīng)能力。因此，橘皮素補(bǔ)劑可作為一款運動補(bǔ)劑用于冬訓(xùn)期間運動員身體機(jī)身的改善與運動能力的提升。