外泌體在急性心肌梗死診斷及預(yù)后的應(yīng)用價(jià)值

項(xiàng)楚涵，張?zhí)鹛?，張步?/p>

外泌體是細(xì)胞分泌的具有脂質(zhì)雙分子層結(jié)構(gòu)的細(xì)胞外囊泡，內(nèi)含DNA、RNA、代謝物、脂質(zhì)、胞質(zhì)和細(xì)胞表面蛋白，是細(xì)胞間通訊的重要介質(zhì)[1]。近年來(lái)有關(guān)外泌體與AMI關(guān)聯(lián)性的研究日益增多。本文旨在檢索國(guó)內(nèi)外近期已發(fā)表文獻(xiàn)深入分析外泌體在AMI中的作用及機(jī)制，為診斷和治療急性心肌梗死提供新的思路。

1 外泌體概述

外泌體的大小在40～160 nm，其平均直徑100 nm，主要來(lái)源于細(xì)胞的內(nèi)涵體(Endosome)。外泌體由細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)涵體通過(guò)胞吐作用釋放到胞外形成的[2]。

外泌體內(nèi)包含核酸、細(xì)胞因子、蛋白質(zhì)、脂類(lèi)等多種物質(zhì)，在細(xì)胞間的通訊中起到介質(zhì)作用。所有培養(yǎng)的細(xì)胞類(lèi)型均可分泌外泌體，且外泌體天然存在于體液中，包括血液、唾液、尿液、腦脊液和乳汁中。外泌體膜上富含參與外泌體運(yùn)輸?shù)乃目缒さ鞍准易?CD63、CD81和CD9)；熱休克蛋白家族((HSP60、HSP70、HSPA5、CCT2和HSP90)。外泌體的分離和富集是外泌體生物醫(yī)學(xué)研究和臨床應(yīng)用分析前的必要環(huán)節(jié)。不同的分離和富集方法會(huì)影響外泌體的數(shù)量、類(lèi)型和純度。目前外泌體的提取方式主要包括以下幾種：一是超速離心法，這是目前外泌體提取最常用的方法；此種方法得到的外泌體量多，但是純度不足；二是過(guò)濾離心，這種操作方法不影響外泌體的生物活性，但同樣存在純度不足的問(wèn)題；三是密度梯度離心法，用此種方法分離到的外泌體純度高，但是前期準(zhǔn)備工作繁雜，耗時(shí)，量少；四是免疫磁珠法，這種方法可以保證外泌體形態(tài)的完整，特異性高、操作簡(jiǎn)單、不需要昂貴的儀器設(shè)備，但是非中性pH和非生理性鹽濃度會(huì)影響外泌體生物活性，不便進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)；五是PS親和法，該方法將PS(磷脂酰絲氨酸)與磁珠結(jié)合，利用親和原理捕獲外泌體囊泡外的PS。該方法與免疫磁珠法相似，獲得的外泌體形態(tài)完整，純度最高。由于不使用變性劑，不影響外泌體的生物活性，該方法獲得的外泌體可用于細(xì)胞共培養(yǎng)和體內(nèi)注射。外泌體在心血管與代謝性疾病中都發(fā)揮重要作用。外泌體由于具有調(diào)節(jié)復(fù)雜細(xì)胞內(nèi)通路的特性使其在許多疾病的治療控制方面具有潛在的用途，可以用于免疫調(diào)節(jié)、抗原呈遞和組織修復(fù)等方向的治療。外泌體上的分子標(biāo)記使其成為用于疾病診斷和預(yù)后監(jiān)測(cè)的有效液體活檢指標(biāo)。隨著對(duì)外泌體的深入了解，其臨床應(yīng)用越來(lái)越受到關(guān)注。

2 外泌體在急性心肌梗死中的診斷價(jià)值

高敏肌鈣蛋白目前是診斷心肌梗死的標(biāo)準(zhǔn)生物標(biāo)志物，但是受年齡、性別、有無(wú)胸痛發(fā)作、腎功能水平的影響，在心力衰竭、應(yīng)激性心肌病、大量肺栓塞或肺動(dòng)脈高壓、嚴(yán)重急性中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病等疾病，甚至劇烈運(yùn)動(dòng)情況下也可能升高。人們發(fā)現(xiàn)外泌體能夠作為檢測(cè)惡性腫瘤的潛在標(biāo)志物[3]，而外泌體作為AMI生物標(biāo)記物具有很大的診斷潛力，我們著重關(guān)注外泌體所攜帶的miRNAs和蛋白的診斷價(jià)值。

血清和血漿中發(fā)現(xiàn)的miRNAs具有穩(wěn)定性、時(shí)間和組織特異性的特征，而外泌體作為miRNAs有效運(yùn)載體，可能為急性心肌梗死患者的診斷提供一種新的可能。從心肌梗死患者血清中分離的外泌體包含miR-183，研究[4]證實(shí)miR-183水平與心肌缺血損傷程度為正相關(guān)，是一種新的心肌梗死診斷的生物標(biāo)志物。miR-30a在急性心肌梗死患者血清的外泌體中高度富集，并通過(guò)外泌體在缺氧心肌細(xì)胞間有效轉(zhuǎn)移[5]，這提示外泌體做為運(yùn)載工具有很好的保護(hù)miRNAs的能力。值得關(guān)注的是外泌體來(lái)源的miRNAs也可以在尿液中檢測(cè)到，急性心肌梗死大鼠外泌體相關(guān)的miR-1在血液和尿液中均出現(xiàn)特異性升高[6]，這提示檢測(cè)尿液種的外泌體可能成為急性心肌梗死新的診斷方法，而提取尿液的無(wú)創(chuàng)性可能會(huì)大大提高心肌梗死的診斷率具有很好的臨床應(yīng)用前景。在心肌梗死的診斷、評(píng)估中不可以忽視外泌體特異性選擇攜帶蛋白的潛在價(jià)值。心肌梗死和非心肌梗死患者的血漿外泌體行蛋白質(zhì)組學(xué)分析后發(fā)現(xiàn)，心?；颊叩难獫{外泌體中有252種蛋白為顯著差異表達(dá)蛋白，并證實(shí)外泌體C1QA、C5、APOD、APOC3、GP1BA、PPBP可能為一組新的心肌損傷的標(biāo)志物[7]。

3 外泌體對(duì)急性心肌梗死患者預(yù)后的影響

患者急性心肌梗死后存活的心臟組織驟減，隨著病情的發(fā)展會(huì)出現(xiàn)心臟泵血功能下降，最終可能出現(xiàn)充血性心力衰竭。在心肌梗死病程中，多種類(lèi)型的心臟細(xì)胞會(huì)釋放外泌體入血，這些外泌體參與心臟細(xì)胞的信息交流并傳遞有效物質(zhì)，對(duì)心肌梗死患者的預(yù)后產(chǎn)生影響，值得注意的是miRNAs在外泌體介導(dǎo)反應(yīng)中的重要地位。

心肌細(xì)胞來(lái)源的外泌體對(duì)于急性心肌梗死可以起到調(diào)節(jié)炎癥、調(diào)節(jié)自噬、抑制細(xì)胞凋亡的作用。急性心肌梗死過(guò)程中來(lái)源于心肌細(xì)胞的外泌體的生成出現(xiàn)一過(guò)性增加，聚集在缺血心肌中的外泌體會(huì)被浸潤(rùn)的單核細(xì)胞迅速吸收，最終調(diào)節(jié)了局部的炎癥反應(yīng)[8]。人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞來(lái)源的心肌細(xì)胞(hiPSC-CM)在心肌梗死中的積極作用則離不開(kāi)其分泌的外泌體能夠促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的生成[9]，還可通過(guò)調(diào)節(jié)缺氧心肌細(xì)胞的自噬來(lái)改善心肌梗死后的心功能，為缺血性心肌病提供無(wú)細(xì)胞特異性治療[10]。心肌細(xì)胞所分泌的miRNAs的有效轉(zhuǎn)運(yùn)離不開(kāi)外泌體這個(gè)有效通訊介質(zhì)，如miR-92a以外泌體運(yùn)載的形式轉(zhuǎn)移到成纖維細(xì)胞中有助于心肌成纖維細(xì)胞的激活[11]。

間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)因?yàn)槠淙菀讛U(kuò)散分離、免疫原性低而且有轉(zhuǎn)化成多譜系的潛能，成為改善心肌梗死預(yù)后方面的研究熱點(diǎn)，而MSCs分泌的外泌體在影響心梗的預(yù)后方面也越來(lái)越被重視。不同來(lái)源的MSCs如骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、脂肪組織來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞、臍帶血來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的外泌體都有較積極的報(bào)道，比如通過(guò)促進(jìn)血管形成，抑制炎癥反應(yīng)，減少梗死面積，改善心臟收縮和舒張能力，以減少心肌梗死帶來(lái)的心肌組織缺血性的損傷。MSCs來(lái)源的外泌體在體內(nèi)體外均能把M1促炎型巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化為M2抗炎型巨噬細(xì)胞[12]。MSCs分泌的外泌體包含miR-125b-5p可以有效調(diào)節(jié)自噬水平來(lái)保護(hù)心肌[13]，也可以抑制促凋亡靶基因，從而抑制缺氧缺糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡[14]。

經(jīng)過(guò)修飾的干細(xì)胞外泌體或經(jīng)人工合成的外泌體是治療心肌梗死的新手段，外泌體可以幫助miRNA轉(zhuǎn)運(yùn)入靶細(xì)胞并延長(zhǎng)miRNs的生物半衰期，心球細(xì)胞(CDCs)、心臟祖細(xì)胞(CPCs)、肪組織來(lái)源的基質(zhì)細(xì)胞(ADSCs)都可能成為新的治療工具。CDCs是較為被認(rèn)可的心臟保護(hù)以及修復(fù)的一類(lèi)干細(xì)胞，心肌內(nèi)注射CDCs源性干細(xì)胞外泌體在急性心肌梗死的豬模型中已經(jīng)有了較好的試驗(yàn)成果，通過(guò)開(kāi)胸心肌內(nèi)注射CDCs源性干細(xì)胞外泌體，心肌梗死面積下降并維護(hù)了左室射血分?jǐn)?shù)[15]。CPCs來(lái)源的外泌體直接注射到缺血心臟因?yàn)檗D(zhuǎn)運(yùn)內(nèi)源性抗凋亡miRNAs可減少急性缺血再灌注損傷[16]。研究CPCs來(lái)源外泌體轉(zhuǎn)染了miR-322可以加強(qiáng)原外泌體的血管生成作用[17]。ADSCs分泌的外泌體經(jīng)過(guò)miR-146a的修飾可通過(guò)下調(diào)早期生長(zhǎng)反應(yīng)因子1(EGR1)來(lái)減弱急性心肌梗死誘導(dǎo)的心肌損傷[18]。

然而外泌體對(duì)于急性心肌梗死的預(yù)后影響不是只有積極的方面，關(guān)于外泌體對(duì)急性心肌梗死不良影響的研究還不夠深入全面。有研究[19]證實(shí)，心肌梗死所激活的巨噬細(xì)胞分泌的外泌體富集miR-155，并通過(guò)外泌體被轉(zhuǎn)移到心臟的成纖維細(xì)胞中，抑制了心臟成纖維細(xì)胞的增值并促進(jìn)了炎癥。

4 存在問(wèn)題與展望

外泌體具有很好的臨床應(yīng)用前景，缺乏被大家普遍接受的分離方法是最急需解決的問(wèn)題。經(jīng)典的外泌體分離方法是超速離心，其重復(fù)性高，獲得的外泌體量大，但是對(duì)技術(shù)和設(shè)備的要求高且分離時(shí)間長(zhǎng)；外泌體分離商業(yè)化試劑盒的運(yùn)用增多，其需要樣本量小，操作簡(jiǎn)單且時(shí)間消耗少，較易重復(fù)，但靈敏度和特異性較低。除此之外外泌體提取價(jià)格昂貴，提取后有存在雜質(zhì)的風(fēng)險(xiǎn)需經(jīng)過(guò)較為復(fù)雜的外泌體鑒定，總的來(lái)說(shuō)缺乏較為成熟的臨床應(yīng)用平臺(tái)。未來(lái)需要開(kāi)發(fā)出高純度、高通量、高回收率的外泌體分離方法和快速、高靈敏度、高特異性的外泌體檢測(cè)技術(shù)，這將大大推動(dòng)外泌體的臨床應(yīng)用。

敏感性與特異性是判斷疾病診斷標(biāo)志物是否合格的關(guān)鍵點(diǎn)，外泌體診斷急性心肌梗死需要比較外泌體生物標(biāo)志物與現(xiàn)臨床常規(guī)應(yīng)用指標(biāo)，需要完善的大型隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)。另外隨著“組學(xué)”技術(shù)的發(fā)展，應(yīng)重視對(duì)于外泌體的生物內(nèi)容物及表征識(shí)別的開(kāi)發(fā)。外泌體對(duì)急性心肌梗死的預(yù)后作用，目前研究多傾向于外泌體可以改善預(yù)后，這提供了對(duì)急性心肌梗死新的認(rèn)知層面，并一定程度上提示了未來(lái)可能更好的治療方式。現(xiàn)有研究多為細(xì)胞實(shí)驗(yàn)或動(dòng)物實(shí)驗(yàn)階段，后期的研究開(kāi)發(fā)還需要更多的技術(shù)理論支持。但需要關(guān)注的是外泌體的內(nèi)容物包含有益成分也有有害的成分，另外細(xì)胞間的信息交換外泌體只是其中一種運(yùn)行形式，需要深入研究細(xì)胞其它的分泌物。

綜上所述，未來(lái)外泌體有可能成為急性心肌梗死新的診斷標(biāo)志物，實(shí)現(xiàn)對(duì)急性心肌梗死患者的早期無(wú)創(chuàng)性初篩。在急性心肌梗死預(yù)后影響方面，外泌體也有許多且積極的研究成果公開(kāi)發(fā)布，這都展示了外泌體很好的應(yīng)用前景，可能與其穩(wěn)定性好、靶向性強(qiáng)、有一定級(jí)聯(lián)效應(yīng)、沒(méi)有導(dǎo)致畸形或?qū)е铝鲎兊那闆r以及無(wú)倫理學(xué)問(wèn)題相關(guān)。