基于網絡藥理學分析葛根山楂人參顆粒解酒保肝的作用機制

李陽，趙天倚，步洪石，王淑敏

（長春中醫(yī)藥大學，吉林長春130117）

近年來，酒精性肝病的發(fā)病率呈逐年上升變化趨勢，臨床治療主要通過阻斷酒精攝入和藥物輔助兩方面對其進行干預，常因患者配合度低戒酒效果不佳從而達不到治療效果，而長時間服藥會產生副作用從而對機體產生毒害反應。藥食兩用中草藥安全性高，患者以食療代替藥療的模式可達到對慢性疾病預防的目的[1]。

葛根山楂人參顆粒由葛根6 g、砂仁6 g、山楂3 g、麩炒白術3 g、人參和茯苓各1.5 g配制而成，具有解酒保肝、化酒祛濕、溫中和胃的功效。有關研究人員發(fā)現，解酒護肝產品能夠顯著提高受試動物體內乙醇脫氫酶和乙醛脫氫酶的活力，同時可降低血清中谷草轉氨酶和谷丙轉氨酶的平均含量以及丙二醛含量，增加機體內肝臟超氧化物歧化酶活力及還原性谷胱甘肽含量，起到解除酒毒保護肝臟功能的效果[2-4]。本研究擬采用網絡藥理學的方法，從靶點預測、網絡分析及分子對接以及動物實驗揭示葛根山楂人參顆粒解酒保肝作用的藥理機制。

1 材料與方法

1.1 動物與試劑

雄性昆明小鼠，體重20～22 g，SPF級，由遼寧長生生物技術有限公司提供，生產許可證編號：SCXK（遼）2020-0001；合格證編號：210726200100461748。正常飼養(yǎng)，自由攝取水和食物，保持12 h光暗循環(huán)。

葛根山楂人參顆粒由長春中醫(yī)藥大學實驗室制備。甘草酸二銨腸溶膠囊（中國正大天晴藥業(yè)集團有限公司，批號：200711102）；二鍋頭白酒（北京順鑫農業(yè)股份有限公司，批號：20200618）；丙二醛（MDA，批號：20210322）、還原性谷胱甘肽（GSH，批號：20210320）、甘油三脂（TG，批號：20210322），以上試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

1.2 分組、造模及給藥

將所有實驗動物隨機分為4組，每組10只，即空白組、模型組、甘草酸二銨組（60 mg kg-1）[5]和葛根山楂人參顆粒組（800 mg kg-1），各組按照相應劑量連續(xù)灌胃10 d。最后一天，給藥4 h后，除空白組外，其余各組均以每劑量12 h的間隔灌胃2劑56°白酒（12 mL kg-1），空白組給予等量的蒸餾水[6]。

1.3 組織指標檢測

試驗小鼠末次給予酒精1 h后，頸脫臼處死，取部分肝組織制成10%肝組織勻漿，4℃離心，取上清液。根據試劑盒說明書測定肝組織上清液中MDA、GSH和TG的水平[7,8]。

1.4 葛根山楂人參顆粒中化學成分檢索與篩選

運用中草藥系統藥理學平臺（TCMSP，http://tcmspw.com）[9]，分別輸入關鍵詞“葛根”、“砂仁”、“人參”、“白術”和“茯苓”，檢索5味中藥中含有的化學成分，整合得到相應的化學成分，將化合物口服生物利用度（OB）≥30%、類藥性（DL）≥0.18作為篩選要求[10-18]。再結合中醫(yī)藥百科全書數據庫ETCM（http://www.tcmip.cn/ETCM/index.php/Home/Index/)檢索山楂的活性成分[12]。

1.5 靶點的預測與“處方中藥-成分-靶點”網絡構建

在PubChem數據庫中下載活性成分的化學結構，將其導入靶點預測數據庫Swiss Target Prediction（http://www.swisstargetprediction.ch/）進行靶標預測，得到的靶標通過UniProt（https://www.uniprot.org/）數據庫，校準其標準基因名，種群限定為“Homo sapiens”，獲取作用于人種的葛根山楂人參顆粒的有效靶點[10,12,18,19]。整理中藥、成分、靶點表格文件，將其導入Cytoscape3.7.2軟件構建“葛根山楂人參顆粒中藥-成分-靶點”網絡。

1.6 疾病靶點的篩選與構建

以酒精性肝病為關鍵詞，限定物種為“Homo sapiens”，通過GeneCards、OMIM、Drugbank和PharmGkb等數據庫獲取作用于疾病的相關靶點。

1.7 葛根山楂人參顆粒蛋白互作（PPI）網絡的構建與分析

將與酒精性肝病相關靶點和葛根山楂人參顆粒的成分靶點進行交互，結果導入STRING（https://stringdb.org/）數據庫，構建蛋白間的相互作用關系，保存TSV格式的互作結果文件，并導入Cytoscape3.7.2軟件進行Network Analyzer分析[10]，將重復和孤立邊刪除，以節(jié)點（node）由大到小、顏色由深到淺用于反映網絡連接度[20,21]，保存設置，輸出文件得到葛根山楂人參顆粒作用靶點PPI網絡圖。

1.8 靶點的基因本體及通路富集分析

為了進一步明確篩選出的靶標蛋白基因的功能以及在信號通路中的作用，將1.2所得處方相關成分靶點導入matescape數據庫(http://metascape.org/gp/index.html#/main/step1)[22]，本數據庫整合了GO、KEGG、UniProt和DrugBank等數據庫內容，其數據更新較快，能夠完成通路富集分析和生物過程注釋，操作時將靶基因名稱列表保存文本文檔進行上傳，物種限定為人，轉換gene ID后，進行GO生物學過程注釋、聚類分析和KEGG通路富集分析，將所得KEGG分析結果前20個條目的P值進行轉換，運用微生信繪圖云平臺（http://www.bioinformatics.com.cn/login/）對所得結果進行氣泡圖繪制。

1.9 分子對接

運用AutoDock軟件將PPI蛋白互作網絡中度值前3的NFKB1、NR3C1和SRC分別與篩選出來的3個關鍵成分進行分子對接；在PubChem數據庫中查詢相應化合物結構，結果文件保存為SDF格式，通過導入Open Bable軟件，將其轉化保存為mol2格式，打開分子對接軟件AutoDock Tools 1.5.6將其加氫，并計算電荷等操作后保存為pdbqt格式文件。在蛋白質數據庫PDB（https://www.rcsb.org/）中下載3個蛋白的三維晶體結構pdb格式文件，導入Pymol軟件將蛋白的水分子以及小分子配體去除后，導入Auto-Dock Tools進行加氫，計算電荷操作，完成后保存文件為pdbqt格式。打開AutoDock Vina 4.0軟件，進行分子對接[11,12]，將得到的最優(yōu)對接結果導入Discovery Studio 2020 Client進行視圖優(yōu)化處理。

2 結果

2.1 葛根山楂人參顆粒對酒精性肝損傷小鼠MDA、GSH和TG的影響

與空白組相比，模型組肝組織中的MDA水平、TG含量顯著升高（P＜0.01），GSH水平顯著降低（P＜0.01）。與模型組相比，葛根山楂人參顆粒給藥組MDA水平顯著降低（P＜0.05），TG含量顯著降低（P＜0.05），GSH水平顯著升高（P＜0.05）[23]。以上結果表明葛根山楂人參顆?？梢悦黠@減輕酒精性肝損傷小鼠氧化應激指標變化，同時升高還原型谷胱甘肽含量，起到對肝臟的保護作用，結果見表1。

表1 小鼠肝組織中MDA、TG和GSH含量Table 1 Contents of MDA,TG and GSH in the mice liver tissue

2.2 處方中藥活性成分及靶標篩選結果

TCMSP數據庫對葛根山楂人參顆粒進行檢索共得到89個活性成分，其中葛根4個，山楂31個，人參22個，麩炒白術7個，砂仁10個，茯苓15個，剔除重復項最終獲得活性成分59個，與活性成分相關的靶點共1 474個，去除重復項獲得靶點956個。運用Cy-toscape軟件繪制所得葛根山楂人參顆粒中藥-成分-靶點網絡如圖1，綠色圓形為處方中5味中藥，橙色三角形為活性成分，紫色菱形為對應靶點[20]。拓撲網絡分析得到度值前3位的成分為Dehydroeburiconic acid（去氫沒食子酸）、Sulfurenic acid（硫色多孔菌酸）和Quercetin（槲皮素）對應度值分別為47、38和21。

圖1 葛根山楂人參顆粒中藥-成分-靶點網絡Fig.1 The drug-component-target network of Gegen Hawthorn Ginseng granules

2.3 PPI網絡構建結果

運用STRING數據庫平臺分析葛根山楂人參顆粒中的組方靶點，將靶點與靶點之間相互作用關系導出作用結果另存文件為TSV格式，將文件導入Cytoscape軟件進行分析，經互作網絡的拓撲學計算，結果顯示其涉及80個節(jié)點，154條邊，如圖2所示；其中以圓形節(jié)點代表蛋白，以每條邊表示蛋白與蛋白之間的相互作用關系，兩個蛋白之間有邊相連即代表其存在相互作用。其中以節(jié)點顏色深淺、形狀大小表示度值的高低，顏色越深、形狀越大代表該節(jié)點度值越高，即該節(jié)點的關鍵程度越高[20,21]。以度值大小梯度排序得到交互作用較多的靶標前10個為NR3C1、NFKB1、SRC、RXRA、AKTI、NCOA2、PPARG、ESR1、AR和AER1C3。AKTI、NCOA2與腫瘤的生物學特征均有一定關系，相關蛋白與AKTI結合可抑制前列腺癌細胞轉移[24]；NCOA2的融合可作為類似卵巢性索腫瘤的子宮腫瘤診斷評估[25]。ESR1、NR3C1、AR系列為激素受體基因，涉及雌激素、糖皮質激素和內分泌調節(jié)等信號通路。有研究表明，ESR1表達CCL23的表達受ESR1轉錄調控；另一方面，CCL23可以抑制AKT信號的激活，從而促進ESR1的表達，在肝癌細胞中形成反饋環(huán)，從而抑制肝癌的發(fā)展[26]。AKT是細胞存活的信號和必要因素，它參與細胞的生長和增殖，發(fā)揮了重要作用[27]；同時AKT1在肝細胞和肝星狀細胞的纖維生成過程中起到了抑制作用[28]，對于防治肝纖維化的發(fā)展提供了新的思路。

圖2 葛根山楂人參顆粒解酒保肝作用潛在靶點蛋白-蛋白互作（PPI）網絡分析Fig.2 The PPI network analysis of Gegen Hawthorn Ginseng Granule in relieving alcoholism and protecting liver

2.4 GO富集分析及KEGG富集分析

取葛根山楂人參顆粒解酒護肝作用相關的前80個主要靶點進行GO富集分析和KEGG通路富集分析，在GO分析得到的生物過程結果中選取前20個富集程度最高的生物過程[6]，輸出條目圖表見圖3。其主要包括類固醇代謝、細胞對有機環(huán)狀化合物反應、一元羧酸代謝過程、脂質代謝過程的調節(jié)和對有毒物質的反應?；蚬δ芫垲惤Y果展示了各生物過程間的關系聯接包括細胞對有毒物質、脂代謝、脂多糖、細胞分化和氧化應激的反應等，見圖4和圖5。圖4是由群集著色構成的網絡，節(jié)點顏色接近的是具有其中相同群集ID的生物過程，圖5是由P值著色構成的網絡，其中具有較深著色的代表其含有較多基因的項并具有較顯著的P值；KEGG分析選取前20條富集程度最高的信號通路見圖6，相關靶點主要在癌癥、類固醇激素生物合成、EB病毒感染、甲狀腺激素信號、胰高血糖素信號和膽汁分泌異常等通路上富集。

圖3 GO富集分析前20條條目Fig.3 The first 20 entries of GO enrichment analysis

圖4 葛根山楂人參顆粒解酒保肝作用GO聚類分析（群集著色）Fig.4 Gegen Hawthorn Ginseng Granule in relieving alcoholism and protecting liver GO clustering analysis(cluster coloring)

圖5 葛根山楂人參顆粒解酒護肝作用GO聚類分析（值顯著性著色）Fig.5 Gegen Hawthorn Ginseng Granule in relieving alcoholism and protecting liver GO clustering analysis(value significant coloring)

圖6 葛根山楂人參顆粒解酒保肝作用前20條KEGG通路富集分析Fig.6 The first 20 entries of KEGG channel enrichment analysis for Gegen Hawthorn Ginseng Granule in relieving alcoholism and protecting liver

2.5 分子對接結果

當分子與受體穩(wěn)定結合時，結合能越低，發(fā)生相互作用的可能性則越大，結果顯示，Dehydroeburiconic acid與SRC最小結合能為-8.63 kJ/mol，Sulfurenic acid與SRC最小結合能為-7.67 kJ/mol，Sulfurenic acid與NR3C1最小結合能為-4.91 kJ/mol，皆具有穩(wěn)定的結合表現[11,12]。核心化合物Dehydroeburiconic acid、Sulfurenicacid與SRC及NR3C1對接模式如下圖。

圖7 Dehydroeburiconic acid與SRC對接模式圖Fig.7 The dehydroeburiconic acid and SRC docking mode diagram

圖8 Dehydroeburiconic acid與SRC成鍵方式圖Fig.8 The dehydroeburiconic acid and SRC bonding mode diagram

圖9 Sulfurenic acid與SRC對接模式圖Fig.9 The sulfurenic acid and SRC docking mode diagram

圖10 Sulfurenic acid與SRC成鍵方式圖Fig.10 The sulfurenic acid and SRC bonding mode diagram

圖11 Sulfurenic acid與NR3C1對接模式圖Fig.11 The sulfurenic acid and NR3C1 docking mode diagram

圖12 Sulfurenic acid與NR3C1成鍵方式圖Fig.12 The sulfurenic acid and NR3C1 bonding mode diagram

表2 靶點PDB ID信息Table 2 The PDB ID information of target

3 討論

酒精性肝病已經嚴重影響人類的身體健康，多是由于長期大量飲酒而導致慢性中毒性肝損傷，發(fā)病初期主要癥狀為輕度脂肪肝，進而可發(fā)展成酒精性肝炎、肝纖維化和肝硬化，嚴重時可導致肝功能衰竭[29,30]。現代臨床治療多給予保肝、抗炎藥物多烯磷脂酰膽堿、還原型谷胱甘肽和水飛薊素類等，改善肝臟生物化學指標，達到保肝作用。對于輕中度酒精性脂肪肝的藥物如甘草酸二銨、甘草酸單銨半胱氨酸等應用也十分廣泛[31,32]。美他多辛可加速酒精從血清中清除，可改善慢性酒精中毒后的肝功能[33]。隨著多種抗炎保肝藥物的長期服用，其帶來的毒副作用也越發(fā)明顯，進一步增加了患者肝臟負擔。中藥復方具有多成分、多靶點和多途徑的作用優(yōu)勢，其安全性較高，能夠發(fā)揮良好的藥效。

本研究通過TCMSP、TCMID、ETCM數據庫檢索和篩選后共獲得了59個潛在活性成分，將篩選得到重要性前3的活性成分與蛋白互作網絡中度值前3位的核心靶蛋白進行了分子對接驗證，其中槲皮素和脫氫沒食子酸等化合物相關的靶蛋白較多且穩(wěn)定性較好，與核心靶點能夠較好地結合；槲皮素屬于黃酮類化合物，研究表明該類化合物具有改善脂肪酸代謝、抗炎、抗氧化、調節(jié)腸道微生物群和膽汁酸、保護肝臟的作用[34]。沒食子酸屬于多酚化合物，研究表明多酚類化合物可通過抗氧化、抗炎、脂質調節(jié)、抑制細胞凋亡、調節(jié)腸道微生物群組成和抗纖維化的作用機制達到對肝臟的保護作用[35]。PPI網絡得到的核心靶點NFB1基因，其多態(tài)性可影響NF-B信號通路的活化水平[36]，當人體內攝入過多酒精后，過量酒精產生的毒性作用導致活性氧自由基大量生成，從而引起肝細胞膜脂質的過氧化，同時內毒素水平的劇增誘導了NF-B的激活，大量的炎癥介質由此產生，并與炎癥級聯放大作用效應，導致重要的細胞器受到侵害，從而引發(fā)肝細胞功能紊亂甚至造成肝細胞凋亡或壞死，最終影響肝臟功能并導致酒精性肝病的形成[37,38]。分子對接過程中葛根山楂人參顆粒中的活性成分與NFB1基因可以穩(wěn)定結合，從而抑制炎癥的發(fā)展達到保護肝臟的目的。SRC激酶是在多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、遷移和侵襲起著重要作用的一個抗腫瘤藥物靶點，在肺癌、乳腺癌、腎癌、直腸癌和胰腺癌等多種腫瘤中都有較高水平的表達。SRC激酶抑制劑藥物對肝纖維化有良好的治療效果[39,40]，同時抑制肝癌的發(fā)展。對接結果顯示，蛋白NR3C1與葛根山楂人參顆粒中的主要成分結合良好，而NR3C1是一種糖皮質激素受體，研究表明NR3C1與NCOA1、NCOA2、NOCRO1和FKBP5等蛋白存在相互作用，并且參與了炎癥反應、細胞增殖和分化等生物過程[41]。在炎癥反應中，抗炎細胞因子可在糖皮質激素的誘導下合成[42]，炎性細胞因子白介素6（IL-6）、白介素8（IL-8）和腫瘤壞死因子-（TNF-）的合成受到抑制，藥物即可發(fā)揮抗炎和免疫抑制作用，干預炎癥反應，從而達到防治肝炎、阻斷肝纖維化發(fā)展的效果。其中，作為一種急性和慢性炎癥的主要調節(jié)因子白介素6，密切影響了肝細胞的壞死程度，肝衰竭的嚴重程度也可以通過IL-6的高表達去反應[43]。臨床上，激素治療酒精性肝病的案例，效果也較為顯著[44]。但由于個體差異以及激素耐受人群的不同，在用于治療酒精性肝病上還存有爭議。葛根山楂人參顆粒是在經典解酒方劑葛花解酒湯的基礎上重新配伍調制，通過相關數據庫分析葛根山楂人參顆粒得到的活性成分與SRC、NR3C1等蛋白具有較好的對接活性，在分子層面上，藥物靶點作用疾病靶標，二者穩(wěn)定結合，阻斷疾病的發(fā)生，達到防御的目的。通路分析結果顯示，葛根山楂人參顆?？蓞⑴c甾類激素生物合成通路、癌癥通路和胰高血糖素通路等發(fā)揮其藥理作用。相關研究表明甾類化合物對于抗炎、抗癌和鎮(zhèn)痛等方面能夠發(fā)揮良好的藥用效果[45]。處方中的成分基因促進甾類化合物的合成，形成抗炎屏障，抑制炎癥的產生。本研究通過大數據的分析與處理，對于中藥復方藥理作用機制的探索提供了一定的參考價值，進一步體現了葛根山楂人參顆粒對于解酒護肝的臨床治療潛力。

綜上所述，通過網絡藥理學和分子對接技術分析了葛根山楂人參顆粒治療酒精性肝病的潛在作用機制，為酒精性肝病的防治提供了新的思路與依據，同時對于解酒護肝保健食品的研發(fā)也提供了新的方法。以食療代替藥療，讓中醫(yī)養(yǎng)生走入尋常百姓家，致力更多研究開發(fā)保肝護肝的新產品，促進健康產業(yè)蓬勃發(fā)展！