內皮細胞膜微粒與缺血性腦卒中的相關性研究進展

朱良琴，張惠婷，葉燁 綜述 鐘望濤，馬曉瑭 審校

廣東醫(yī)科大學附屬醫(yī)院神經內科，廣東 湛江524000

隨著社會的進步，人類壽命的逐漸延長，腦血管疾病在人類疾病譜中占據著越來越高的比例。腦卒中作為腦血管疾病的最常見類型，包括缺血性腦卒中(ischemic stroke，IS)和出血性腦卒中，其中，IS占80%以上。IS具有高發(fā)病率、高致殘率、高死亡率、高復發(fā)率等特點，隨著社會老齡化的逐漸加重，其給家庭乃至整個社會都帶來巨大的壓力。IS是指各種腦血管病變所致腦部血流供應障礙，導致局部腦組織缺血、缺氧性壞死，而迅速出現相應神經功能缺損的一類臨床綜合征。其中，內皮細胞功能障礙、動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)、血栓形成等是IS的關鍵病理生理過程。細胞膜微粒(microvesicles，MVs)是指在細胞活化、損傷和/或凋亡過程中從質膜上脫落的亞微米顆粒；內皮細胞膜微粒(endothelial microvesicles，EMVs)是內皮細胞(endothelial cells，ECs)在活化和/或凋亡過程中從細胞膜上產生的一種囊泡結構。大量實驗結果表明，EMVs在內皮細胞功能障礙、血栓形成、AS等IS的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用，這預示著EMVs在IS的發(fā)生、發(fā)展及預后等過程中扮演著重要的角色。

1 MVs與EMVs

1.1 MVs生物學特性

1.1.1 MVs的形成MVs是指在細胞活化、損傷和/或凋亡過程中從質膜上脫落的亞微米顆粒，靜息狀態(tài)下細胞膜的特點是磷脂分布，外層是磷脂酰膽堿和鞘磷脂，內層是磷脂酰乙醇胺和磷脂酰絲氨酸(phosphatidylserine，PS)[1]。這種不對稱分布對生物膜功能至關重要，并受復雜的跨膜酶平衡的控制。在細胞活化、損傷和/或凋亡和隨后胞漿中Ca2+濃度增加的過程中，質膜被修飾，磷脂不對稱性受到損害，尤其是磷脂不對稱性的喪失導致PS外化，并激活包括Calpain在內的胞漿酶，導致細胞骨架絲斷裂。以上現象導致膜源性水泡形成增加，水泡產生的MVs被釋放到循環(huán)血液中[2]。

1.1.2 MVs的研究歷史 早在20世紀中葉，人類血清就被懷疑含有亞細胞血小板樣促凝血因子[1]。1967年，具有促凝活性的血小板膜碎片在人血漿中被描述為“血小板塵”。這種“灰塵”由能夠促進凝固的小氣泡(直徑＜0.1μm)組成。隨后研究發(fā)現，ECs、血管平滑肌細胞、白細胞、淋巴細胞和紅細胞的MVs在體外也有釋放。在患者和健康人的血液中都發(fā)現了這些MV群體[2]。

1.1.3 MVs的生物學功能MVs是一種納米級的囊泡，能夠在細胞間傳遞DNA、mRNAs、microRNAs、ncRNAs、蛋白質和脂類等[3]，可以保護RNA不被核酸酶降解，并能在血液和細胞外空間循環(huán)，代表了一種新的細胞間通訊形式。這些囊泡不僅是蛻膜，還能夠將生物信息傳遞給靶細胞。因此，它們應該被認為是細胞間的信使，而不僅僅是細胞損傷或激活的生物標志物[3]。MVs已經被證明能介導多種病理生理過程，包括炎癥、凝血、內皮細胞功能障礙、AS等[4]。

1.2 EMVs的生物學特性

1.2.1 EMVs的形成EMVs是ECs在活化和/或凋亡過程中從細胞膜上產生的一種復雜的囊泡結構，可反映ECs的狀態(tài)[5]。目前對EMVs形成的認識主要來源于對分離或培養(yǎng)的ECs的實驗。事實上，EMVs產生的體內機制仍不清楚。多項實驗表明，培養(yǎng)的ECs在經過各種長時間的刺激(主要是炎癥刺激)激活后都可以釋放EMVs[6]。1999年，COMBES等[7]首次報道了腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)刺激人臍內皮細胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)產生EMVs的過程。后續(xù)實驗也證明多種刺激均可誘導ECs釋放EMVs。WANG等[8]發(fā)現，C反應蛋白(C-reactive protein，CRP)可誘導HUVECs產生EMVs，這種作用至少部分與受損的四氫生物蝶呤依賴型NO產生有關。HUVECs中增強的EMVs生成被認為是促成與CRP相關血管損傷發(fā)病機制的新的潛在機制。BRODSKY等[9]發(fā)現纖溶酶原激活物抑制劑-1具有劑量依賴性地促進EMVs形成的新作用，同時降低了磷脂的跨膜不對稱性。FAURE等[10]研究尿毒癥毒素在體外誘導EMVs釋放的能力，表明尿毒癥毒素(草酸鹽，吲哚酚硫酸鹽，對甲酚和高半胱氨酸)可增加體外EMVs的釋放。另外，炎性細胞因子[11]、細菌脂多糖[11]、活性氧[11]、喜樹堿[12]、凝血酶[13]也被證明能誘導EMVs的產生。

1.2.2 EMVs的生物學功能 目前認為，EMVs可作為內皮功能障礙的生物標志物，并反映ECs的狀態(tài)。有研究發(fā)現，EMVs并不是隨意釋放入血的，是受機體內分泌和旁分泌作用分泌的，在生理條件下，血液中EMVs的濃度在臨床上微不足道，在多種病理條件下(動脈內皮功能障礙相關的多種疾病)，血液中EMVs的濃度會有所增加[11，14]。例如，EMVs在動脈粥樣硬化、急性冠狀動脈綜合征、肺動脈高壓、心力衰竭、終末期腎功能衰竭、嚴重高血壓、腦血管疾病、血小板減少性紫癜、代謝綜合征等疾病中均有不同程度的升高[1]。同時，越來越多的證據表明EMVs在細胞內信號傳遞中起著中介作用，因為它們能夠將許多生物活性分子轉移到受體細胞，這些生物活性分子主要包括生長因子、蛋白酶、黏附分子、DNA、microRNAs、ncRNAs等，調控多種受體細胞功能。由此可見，它們作為生物傳送器在調節(jié)血管穩(wěn)態(tài)中起著關鍵作用。

2 EMVs與IS相關性

內皮細胞功能障礙、AS、血栓形成等都是IS的關鍵病理生理過程。與其他細胞源性MVs一樣，EMVs是一種巨大的生物效應器，影響心腦血管生理病理的各個層面。它們可能通過促進內皮功能障礙和動脈壁炎癥而引發(fā)動脈粥樣硬化，也可能促進斑塊的發(fā)展和破裂[7]。因此，EMVs在IS的整個發(fā)生發(fā)展過程中扮演重要角色。

2.1 EMVs在IS發(fā)生發(fā)展過程中的作用

2.1.1 EMVs與內皮細胞功能的相關研究 研究發(fā)現，血腦屏障作為大腦的一種物理和生化屏障，可限制和調節(jié)血液與中樞神經系統(tǒng)之間的分子、離子和細胞的交換，這主要依賴于血腦屏障內皮細胞之間的緊密連接。IS的病理生理特征之一是血腦屏障的破壞，導致細胞旁通透性增加，從而導致血管性水腫，其明顯促進了腦損傷的發(fā)展和隨后的神經系統(tǒng)損傷[15-16]。而且，內皮功能障礙和損害是IS的病理生理基礎，在IS的發(fā)生發(fā)展中占據著重要作用。因此，維持一個完整的單層內皮細胞屏障對正常血管結構和功能至關重要，并且其可以通過釋放促進抗凝、抑制炎癥和誘導血管舒張的物質在體內發(fā)揮動脈粥樣硬化保護作用[11]。ECs在活化和/或凋亡過程中可釋放EMVs，其可以反映ECs的功能狀態(tài)[11]。DENSMORE等[17]在動物實驗水平通過大鼠模型研究發(fā)現EMVs可損傷ECs介導的血管舒張功能，纖溶酶原激活物抑制劑-1刺激人ECs產生的EMVs能夠損傷乙酰膽堿酯酶介導的主動脈內皮依賴性血管舒張功能并減少一氧化氮的產生，導致血管舒張功能障礙、血管僵硬。另外，GOOD等[18]在動物水平發(fā)現EMVs抑制內皮型NO合酶，抑制阻力動脈的血管舒張。AMABILE等[19]在臨床水平研究發(fā)現循環(huán)中EMVs水平與終末期腎功能衰竭患者肱動脈血流介導的擴張幅度呈負相關；在體外，終末期腎功能衰竭患者的EMVs會削弱內皮依賴性舒張功能和環(huán)狀鳥苷單磷酸的生成，EMVs與終末期腎功能衰竭中的內皮功能障礙和動脈功能障礙密切相關。另一方面，EMVs可能在急性血管應激(如敗血癥性休克)中對ECs具有血管保護作用。EMVs可作為促炎癥產物的下游輸送系統(tǒng)，在急性炎癥條件下具有血管保護作用，但在慢性疾病中可能使血管功能不全持續(xù)存在。由此可見，EMVs并不是損傷的惰性標志物，其對血管ECs有利有弊，在不同的疾病狀態(tài)下，其發(fā)揮的作用也有所不同[5]。

2.1.2 EMVs與AS的相關研究AS是一個慢性進行性炎癥性過程，由早期和持續(xù)的內皮功能障礙促進和延續(xù)，也是IS的主要病理過程之一。AS主要涉及中型和大型動脈中的脂質蓄積、纖維化和炎癥，是心腦血管疾病的主要原因[20]。鑒于EMVs的生化成分、性質和生物學效應，其似乎在很大程度上參與了動脈粥樣硬化的發(fā)生。首先，EMVs本身可以增強ECs對炎癥的反應，有研究發(fā)現，p38絲裂原活化蛋白激酶能靶向促炎性內皮微粒的產生。在體外細胞實驗表明，EMVs的釋放與促炎因子的釋放有關，表明EMVs的釋放與經典的炎癥途徑可能有密切的關系。此外，EMVs和ECs之間的相互作用通過增加ICAM信使RNA的表達以及靶細胞中可溶性ICAM的脫落而觸發(fā)促炎癥反應[21]。內皮功能障礙是AS的始動環(huán)節(jié)。DENSMORE等[17]在動物水平通過大鼠模型研究不僅發(fā)現前面提到的，EMVs還可以通過損傷ECs介導的血管舒張功能，從而導致血管舒張功能障礙、血管僵硬；還發(fā)現，EMVs還可使鼠肺毛細血管通透性顯著增加，進而易于單核細胞遷移聚集于內皮下和低密度脂蛋白的沉積。不僅如此，多項研究表明，EMVs在AS的發(fā)生發(fā)展全過程中扮演著關鍵的一角，從內皮功能障礙、血管壁炎癥、氧化應激和細胞凋亡到動脈粥樣硬化進展和發(fā)展中的凝血和血栓形成[20]。

2.1.3 EMVs與促凝血方面的研究 有研究顯示，凝血功能障礙，如促凝血方面的異常活躍可導致血液的高凝狀態(tài)，其可局部或彌漫性發(fā)生，也可進一步導致IS的發(fā)生[22]。凝血功能障礙在IS的病理生理中起重要作用。凝血酶作為凝血系統(tǒng)中的重要一員，已被多次證實其可誘導ECs釋放EMVs。SIMONCINI等[23]在細胞實驗水平發(fā)現控制EMVs釋放的新機制，即sTRAIL參與凝血酶誘導的EMVs釋放，主要通過涉及一核因子激活的下游途徑誘導的細胞間黏附分子-1核白介素8表達。另外，SAPET等[24]發(fā)現凝血酶誘導EMVs生成還可通過Caspase-2激活Rho激酶ROCK-Ⅱ而不依賴于細胞死亡的新途徑。如上，凝血酶可以通過多種途徑誘導EMVs的釋放。而也有研究發(fā)現，EMVs又能在許多疾病中介導凝血酶的生成[21]。主要是EMVs表面存在組織因子(tissue factor，TF)及PS，其中，PS能結合凝血因子并促進其活化，此外，TF的EMVs是外源性凝血途徑的起始者，在體外和體內誘 導TF依賴 性凝 血 酶的 形 成[25]。SABATIER等[26]在體外實驗發(fā)現，EMVs與單核細胞和血小板相互作用可誘導并加大TF依賴性促凝活性。LEROYER等[27]及MALLAT等[28]均在人動脈粥樣硬化斑塊中發(fā)現了促凝血EMVs。而且，MALLAT等[29]也在急性冠狀動脈綜合征患者外周血中發(fā)現促凝血EMVs。EMVs在多種病理情況下表現出明顯的促凝作用，在止血、血栓形成中起重要作用。

2.2 EMVs作為IS的生物學標志物潛能 臨床上很多疾病，例如感染、糖尿病、急性心肌梗死、血脂異常等，都可以靠相應的血液生物標志物來診斷。但目前還沒有相關的血液生物標志物可以用來診斷IS。因此，尋求IS相關血液生物標志物顯得尤為有意義。EMVs攜帶內皮細胞成分和細胞表面抗原，可區(qū)別來源于白細胞、紅細胞或血小板的MVs。此外，EMVs表型特征可受刺激類型的影響，不同的蛋白質表達模式有助于區(qū)分刺激類型[30]。SIMAK等[31]發(fā)現，循環(huán)的EMVs某些表型可能與急性缺血性卒中(acuteischemic stroke，AIS)的嚴重程度、病變體積和預后有關，其實驗結果顯示CD105+CD41a-CD45-EMV[E(+)EMV]、CD105+CD144+EMV[C(+)EMV]、CD105+PS+CD41a-EMV[PS(+)EMV]和CD105+CD54+CD45-EMV[I(+)EMV]在中重度AIS患者中均有升高，其中，三種EMV表型[E(+)EMV，PS(+)EMV和I(+)EMV]與腦病變量顯著相關，其中I(+)EMV相關性最強。另外，C(+)EMV和E(+)EMV與患者出院臨床結局相關，這可能有利于AIS患者的預后評估。JUNG等[30]臨床研究發(fā)現近期發(fā)作的缺血腦卒中與更高的CD62E+EMV水平密切相關。而且，CD62E+EMV水平與神經損傷指標(美國國立衛(wèi)生研究院卒中量表評分即NIHSS評分和腦梗死體積)呈顯著正相關，這提示CD62E+EMV水平與缺血壞死程度直接相關。同時還發(fā)現，在缺血性腦血管疾病相關危險因素組，顱外動脈狹窄患者的CD62E+EMV水平較高，而顱內動脈狹窄患者的CD31(+)/CD42b(-)和CD31(+)/AV(+)EMV水平更高。CD62E+與CD31(+)/CD42b(-)或CD31(+)/AV(+)EMV比值可協助判定顱內外動脈狹窄程度。另外，不論中風亞型，急性期CD62E+EMV水平均升高，且隨時間而降低，這些結果可能提示了激活的EMVs而不是凋亡的EMVs是誘導中風的主要因素。有實驗表明，ECs在凋亡和激活過程中所釋放EMVs也是不同表型的，這也提示對EMV表型特征的分析可提供有關內皮狀態(tài)的臨床有用信息。JIMENEZ等[32]細胞實驗發(fā)現在細胞凋亡中，EMV中的組成性標志物顯著增加(CD31＞CD105)，Annexin V EC表面結合和膜聯蛋白V+EMV也顯著增加。相反，在細胞激活中，EMV中的誘導性標記均顯著增加(CD62E＞CD54＞CD106)。LI等[33]發(fā)現AIS患者的CD144(+)/CD41a(-)EMV、CD31(+)/CD41a(-)EMV、CD62E+EMV和Annexin V(+)/CD62E(+)EMV的水平顯著升高。值得注意的是，CD144(+)/CD41a(-)EMV的水平與卒中嚴重程度密切相關，Annexin V(+)/CD62E(+)微粒與中風亞型之間存在輕度相關性。而且，值得一提的是，ZHANG等[34]發(fā)現血漿EMVs和EMVs-miR-155的水平在IS的急性期和亞急性期顯著增加，而在慢性期則保持不變，并且與梗死體積和NIHSS得分呈正相關，并與所定義的大動脈粥樣硬化和心臟栓塞亞型相關。這表明血漿EMVs和EMVs-miR-155是IS有前途的生物標記物。以上相關實驗研究提示，EMV不同表型及其攜帶的內容物都將有利于判斷急性缺血性中風分型、嚴重程度及其預后等。此外，另一個值得關注的是，有研究發(fā)現，CD105(+)/CD144(+)EMV計數在有出血轉化的急性缺血性腦卒中患者中升高，這對于診斷腦梗死出血轉化有莫大臨床意義[31]。

2.3 EMVs在IS中的治療潛力 臨床上，目前對于IS的治療主要集中在超急性期再灌注治療、急性期的病因和發(fā)病機制治療、恢復期的功能訓練及二級預防等。已有研究表明，當大腦的供血動脈嚴重狹窄或閉塞時，血流通過新生血管側支循環(huán)的方式，改善受損腦組織中的缺血缺氧狀態(tài)，有助于神經功能的恢復[35]。因此，促進血管生成也是IS的有效治療方法之一。大量實驗研究結果表明，EMVs在促血管生成方面也有作用。LACROIX等[36]發(fā)現EMVs可以通過表達尿激酶型纖溶酶原激活物及其受體誘導纖溶酶的生成，它可以對抗EMVs產生的凝血酶，在維持血管通暢、促進細胞遷移和血管生成方面發(fā)揮關鍵作用。另外，還有實驗結果表明，EMVs與細胞外基質相互作用，并激活基質金屬蛋白酶，參與細胞外基質降解和生長因子的釋放，這些因子在組織重塑和血管生成中起關鍵作用[37]。再者，組織缺血過程中產生的EMVs被認為能夠促進ECs增殖和血管生成，微血管ECs釋放的富含TF的EMVs可以通過促進缺血后新生血管和組織再灌注[20，38]。然而，EMVs在血管生成中的作用仍存有不少爭議。有細胞實驗發(fā)現從HUVECs中分離出的高濃度EMVs可抑制血管生成，而低EMVs含量可促進毛細血管樣結構的形成[21]?；谀壳把芯?，EMVs在炎癥、凝血、血管生成等病理過程中的作用并不是定性的，在不同的內環(huán)境和疾病狀態(tài)下，內皮細胞膜微粒的組分有所不同，一方面可促炎、促凝、損傷內皮細胞功能以促進疾病的進展，另一方面也可發(fā)揮抗炎、抗凝作用促進內皮細胞修復從而延緩疾病進展。因此，EMVs在不同病理狀態(tài)下表現出來的作用可能是不一樣甚至反方向的，其可能與EMVs分泌來源的細胞相關，因為不少研究指出EMVs可攜帶母細胞的生物學信息?？偠灾珽MVs有促進血管生成改善血流等功能，同時具有免疫原性低、循環(huán)穩(wěn)定性好、傳遞效率高、可穿過血腦屏障等優(yōu)點，這些優(yōu)點讓EMVs在IS的治療中具有極大潛力。

3 結語

總的來說，EMVs參與了IS的整個發(fā)生發(fā)展過程并在其中扮演著重要角色。在不同的病理生理情況下，EMVs的表型有所不同，其發(fā)揮的作用也不盡相同。有多項研究表明，某些表型的EMVs及其攜帶的內容物與IS的急慢性期、分型、病情嚴重程度及預后等有顯著相關性，這表明EMVs有望成為IS的有效血液生物學標志物，為IS的臨床診療提供新思維、新方法。但目前對于IS的具體發(fā)病機制、EMVs在IS病情發(fā)展過程中發(fā)揮作用的具體機制均還未完全明確，如何將其充分應用于IS的臨床診療中還有待于今后的進一步研究。另外，EMVs在IS治療中的潛力也仍需后續(xù)更多的實驗研究去探索及證明。