移植性肺癌動物模型建立的研究進(jìn)展

鄭偉珍 綜述 吳愛兵，楊志雄 審校

1.廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院腫瘤中心，廣東 湛江524000；2.湛江中心人民醫(yī)院，廣東 湛江524000

肺癌是最常見的癌癥類型(占病例總數(shù)的11.6%)和癌癥死亡的主要原因(占癌癥死亡總數(shù)的18.4%)[1]。為更好了解肺癌臨床發(fā)病特征以及制定出更好、更有效的診治措施，為還原與人肺癌病因、發(fā)病機(jī)制、發(fā)展過程，需要精準(zhǔn)模擬肺癌病理過程的動物模型。本文就目前國內(nèi)外報(bào)道的肺癌移植性模型的構(gòu)建方法的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，以期為肺癌相關(guān)研究提供模型參考。

1 實(shí)驗(yàn)動物的選取

選取適合的實(shí)驗(yàn)動物對肺癌動物模型的建立具有重要意義。用于肺癌造模的實(shí)驗(yàn)動物大多為免疫缺陷動物，如免疫缺陷小鼠、大鼠、兔、犬等。目前用來研究肺癌模型建立的品種主要有：(1)正常鼠，BALB/C-裸小鼠，C57BL/6J小鼠；(2)免疫缺陷鼠：裸鼠、嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷(severe combined immunodeficiency，SCID)小鼠，NOD-SCID小鼠，CB.17 SCID小鼠，無胸腺大鼠等。C57BL/6小鼠、裸鼠、SCID小鼠、NOD/SCID小鼠都是構(gòu)建移植性肺癌轉(zhuǎn)移模型的常用品種，具體選擇哪種類型的小鼠建模，需要充分考慮實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、?shí)驗(yàn)周期、接種方法以及檢測指標(biāo)等因素。這幾種品系小鼠各有優(yōu)勢，其中C57BL/6小鼠具有正常的免疫功能，價(jià)格低廉、耐受性強(qiáng)，模型成熟，常用于Lewis細(xì)胞的肺癌轉(zhuǎn)移建模型構(gòu)建。裸鼠、SCID小鼠、NOD/SCID小鼠常用于人源肺癌細(xì)胞的移植性種植，小鼠成瘤率與其種類、免疫特性有著密不可分的聯(lián)系。闕祖俊等[2]將人源肺癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞CTC-TJH-01(1×106個(gè)/只)采用尾靜脈注射的方法，注射后第8周NOD/SCID小鼠首次觀察到肺部成瘤，第10周NOD/SCID小鼠肺部成瘤率為100%，而在Nude小鼠和C57BL/6小鼠體內(nèi)均不成瘤。吳健彬等[3]研究顯示NOD/SCID小鼠皮下移植瘤模型成瘤率為55.6%，高于BALB/c裸鼠的成瘤率，并且肺癌在NOD/SCID小鼠易發(fā)生肺轉(zhuǎn)移與骨轉(zhuǎn)移，NOD/SCID小鼠仍然是移植性肺轉(zhuǎn)移模型的首選品系。其可能的原因是小鼠的免疫排斥反應(yīng)被人源肺癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞的較強(qiáng)的免疫原性激發(fā)。Nude小鼠由于無胸腺，因此T淋巴細(xì)胞所占百分比很低，但具備B淋巴細(xì)胞及NK細(xì)胞的正常功能。C57BL/6小鼠、BALB/c裸鼠為免疫水平正常小鼠；而NOD/SCID小鼠是聯(lián)合免疫缺陷小鼠，其體內(nèi)T、B淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞的表達(dá)極低，因而較適用于異種移植造模。

2 肺癌動物模型分類

目前主要有以下三種模型用于肺癌動物建模的研究：

2.1 誘發(fā)性肺癌動物模型 其優(yōu)點(diǎn)是具有跟人肺癌相似的形態(tài)學(xué)、組織學(xué)以及分子生物學(xué)特征，更貼近肺癌實(shí)際發(fā)生發(fā)展原理。主要方法包括吸入、口服致癌劑以及肺或支氣管灌注或肺或支氣管黏膜下注射致癌物誘發(fā)肺癌等。YE等[4]在氣管內(nèi)滴注碘油混懸液(I)和DEN，成功誘導(dǎo)出肺部腫瘤。近年來國外常采用此方式建模，應(yīng)用于腫瘤相關(guān)預(yù)防藥物的開發(fā)實(shí)驗(yàn)。但因?yàn)樵摲椒?gòu)建較困難，誘導(dǎo)時(shí)長難以統(tǒng)一，腫瘤形成效率低，難以開展大規(guī)模研究。

2.2 轉(zhuǎn)基因肺癌模型 基因工程模型建模耗資較多、時(shí)間較長，少見相關(guān)報(bào)道。

2.3 移植性肺癌動物模型 在實(shí)驗(yàn)動物體內(nèi)接種腫瘤細(xì)胞或組織構(gòu)建而成的腫瘤動物模型即為移植性模型。移植性模型能在同種或相近物種中反復(fù)移植，長時(shí)間保存以備研究所需，而且可批量接種等量的腫瘤細(xì)胞或組織于動物體內(nèi)，增殖快慢相對統(tǒng)一，動物間區(qū)別較小，成瘤率高，研究所需時(shí)間較短，研究條件易調(diào)節(jié)，所以被普遍應(yīng)用。但移植性動物模型難以用于早期腫瘤發(fā)生發(fā)展機(jī)制的相關(guān)研究。以研究目的、造模方式的差異為根據(jù)，可將移植性肺癌動物模型進(jìn)行分類：如按接種部位，可分為原位移植模型和異位移植模型；按照腫瘤細(xì)胞的來源，可分為誘發(fā)性、自發(fā)性、移植性和轉(zhuǎn)基因動物模型等；按照轉(zhuǎn)移部位，可分為腦、骨、淋巴轉(zhuǎn)移模型。

2.3.1 異位移植模型 將肺癌細(xì)胞或組織接種于實(shí)驗(yàn)動物皮下或腎包膜下或血管內(nèi)即為異位移植。其易于動態(tài)測量瘤塊大小、增殖進(jìn)程，且移植成功率較高。潘泓等[5]研究發(fā)現(xiàn)，與皮下移植相比，腎包膜下移植成瘤率較高，但因?qū)嶒?yàn)技術(shù)更為復(fù)雜，對實(shí)驗(yàn)動物有較大損傷，且因腎包膜及其脆弱，導(dǎo)致操作容易失敗，因此極少應(yīng)用。除此之外，不可直觀測量腫瘤的形態(tài)、體積也是腎包膜下移植的顯而易見的不足之處。

2.3.1.1 皮下移植瘤模型 在當(dāng)前的肺癌模型研究中，皮下移植型模型仍是最為多見的。把肺癌組織、細(xì)胞注入免疫缺陷動物皮下的方式已經(jīng)成為以往數(shù)十年對惡性腫瘤進(jìn)行研究的首選途徑。皮下移植瘤可在不同部位進(jìn)行，其可導(dǎo)致腫瘤轉(zhuǎn)移性、成瘤特點(diǎn)等方面產(chǎn)生差異，例如背部、腋部、后肢等，其中以腋部皮下移植最常采用。小鼠肺癌皮下移植瘤是當(dāng)前檢測腫瘤相關(guān)藥物的重要臨床前工具，因?yàn)槠洳僮骱唵巍⒊闪雎矢?、不影響動物活動且可動態(tài)測量等優(yōu)點(diǎn)。有研究在小鼠不同部位(右腋皮下、右腹股溝皮下、腳墊皮下)分別注入穩(wěn)定表達(dá)螢光素酶的小鼠Lewis肺腺癌細(xì)胞，結(jié)果顯示腋下組腫瘤體積增長穩(wěn)定，較晚才出現(xiàn)壞死，且肺轉(zhuǎn)移率最高，更適用于實(shí)驗(yàn)時(shí)間較長、需要觀察轉(zhuǎn)移灶的實(shí)驗(yàn)。皮下移植造模的方法盡管已較多采納，同時(shí)，也存在不足之處，正因?yàn)榉闻K與皮下所處內(nèi)環(huán)境存在天壤之別，肺癌細(xì)胞一些特性蛋白及因子表達(dá)受其原發(fā)腫瘤部位差異的影響，表現(xiàn)在局部侵犯、遠(yuǎn)處定植尤為明顯。進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)或藥物篩選時(shí)，應(yīng)用皮下移植瘤模型得出的結(jié)果與實(shí)際臨床藥效存在極大差異。所以，選取異位造模時(shí)，為避免產(chǎn)生藥物療效的假陽性，在抗腫瘤治療藥物研究時(shí)，應(yīng)將某些與藥物敏感性有關(guān)的特異表達(dá)是否可能因腫瘤生長部位差異而不同考慮進(jìn)去。

2.3.1.2 血管內(nèi)注射DENG等[6]在雌性裸鼠體內(nèi)通過尾靜脈注入A549單細(xì)胞懸液，結(jié)果在小鼠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)肺部轉(zhuǎn)移瘤，病理顯示為肺腺瘤。另外，有研究經(jīng)裸鼠尾靜脈將腫瘤細(xì)胞注入裸鼠內(nèi)，分別于第5、11周觀察到肺部轉(zhuǎn)移、惡病質(zhì)，研究過程無小鼠死亡。

2.3.1.3 左心室注射 為構(gòu)建腦轉(zhuǎn)移模型，多個(gè)研究表明與左心室注射相比，尾靜脈注射更易形成肺病灶，而左心室注射更易形成腦轉(zhuǎn)移[7]。曾有研究者大膽猜想，采用左心室內(nèi)注射的方法能使肺部轉(zhuǎn)移灶出現(xiàn)的幾率和數(shù)量下降，使腦轉(zhuǎn)移形成率大大提高，其機(jī)理可能是因?yàn)橥ㄟ^左心室內(nèi)注射，更多腫瘤細(xì)胞可直達(dá)腦部形成腦轉(zhuǎn)移灶，而尾靜脈注射法中肺部毛細(xì)血管網(wǎng)最先捕捉肺癌細(xì)胞從而在肺內(nèi)定植，導(dǎo)致肺部病灶出現(xiàn)。

2.3.2 肺癌原位模型 在動物呼吸系統(tǒng)中接種一定數(shù)量的肺癌細(xì)胞懸液或瘤塊，進(jìn)而原位成瘤及產(chǎn)生轉(zhuǎn)移灶的建模方法即為肺癌原位模型。與異位皮下接種相比，原位肺癌因其可效仿肺癌臨床腫瘤發(fā)生機(jī)制、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、胸水發(fā)生及模擬腫瘤的微環(huán)境，在肺癌診治實(shí)驗(yàn)有著重大意義。這個(gè)也側(cè)面體現(xiàn)了種子土壤學(xué)說，即肺癌細(xì)胞的生長、轉(zhuǎn)移具備器官特異性。與此同時(shí)，胸膜播散、氣胸、血胸是原位移植造模的主要危險(xiǎn)。

2.3.2.1 肺臟原位移植模型 肺內(nèi)移植方法已成為最近幾年研究的熱門，成為較合適的造瘤模型，因其移植成功率高，而且能最大程度模擬肺癌微環(huán)境，與人類肺癌的生物學(xué)行為相近。與此同時(shí)，原位移植對時(shí)間周期長、操作技術(shù)要求高、對腫瘤生長的監(jiān)測難度大。隨著科技進(jìn)步，在經(jīng)皮穿刺瘤塊移植過程中，運(yùn)用CT引導(dǎo)有動物損傷小、成功率高等優(yōu)勢，因此被廣泛應(yīng)用。

2.3.2.2 支氣管原位移植模型HAI等[8]通過氣管切開，往右側(cè)支氣管用導(dǎo)管注入腫瘤細(xì)胞懸液，從而實(shí)現(xiàn)原位建模。結(jié)果顯示，肺癌細(xì)胞原位建模能轉(zhuǎn)移到腦、腎、骨骼等全身多個(gè)部位。另外，國內(nèi)有學(xué)者在SCID小鼠及裸大鼠一側(cè)肺內(nèi)通過氣管、胸壁穿刺兩種方法接種肺癌細(xì)胞，從而構(gòu)建肺癌原位模型[9]。經(jīng)支氣管原位建模，其生理學(xué)特性與臨床肺癌實(shí)際發(fā)生發(fā)展機(jī)理最為接近，應(yīng)用于肺部腫瘤實(shí)驗(yàn)更為恰當(dāng)。遺憾的是，成瘤數(shù)量、大小不穩(wěn)定、操作難度大、成瘤率較低等缺陷使氣管內(nèi)移植的發(fā)展應(yīng)用受到極大局限。

2.3.2.3 胸腔原位移植模型 胸腔內(nèi)注射肺癌細(xì)胞懸液進(jìn)行小鼠原位肺癌造模的較高效、簡單易行的方式之一。ZHENG等[10]采用胸腔注射法將腫瘤細(xì)胞注入裸鼠左肺，應(yīng)用CT掃描進(jìn)行動態(tài)觀察。原位肺癌動物模型的腫瘤形成率為90%，腫瘤轉(zhuǎn)移率為100%。相比而言，胸腔原位種植法建模相對異位皮下腫瘤模型更難以實(shí)時(shí)動態(tài)觀察，需要借助CT影像學(xué)輔助，而且價(jià)格較昂貴。

2.3.2.4 肺內(nèi)和胸膜同步移植模型 文石兵等[11]將在裸鼠皮下、肺內(nèi)及肺內(nèi)和胸膜腔分別注入人肺腺癌細(xì)胞，結(jié)果顯示，與單純肺內(nèi)移植組相比，胸水發(fā)生率更高，且存活時(shí)間更久，而皮下組無胸水、轉(zhuǎn)移灶產(chǎn)生。因此，兩部位同步移植法進(jìn)行造模，可較大程度還原肺部浸潤、轉(zhuǎn)移的臨床特點(diǎn)，可用于探討肺癌胸腔積液診治機(jī)理的實(shí)驗(yàn)。

2.4 肺癌轉(zhuǎn)移模型

2.4.1 腦轉(zhuǎn)移模型 腦是肺癌較為多見的轉(zhuǎn)移部位之一。腦轉(zhuǎn)移癌動物模型可通過尾靜脈、頸內(nèi)動脈、顱內(nèi)局部、左心室注射等途徑。吳濤等[12]在裸鼠顱內(nèi)植入人SCLC細(xì)胞懸液，造模成功后經(jīng)病理證實(shí)為腫瘤組織。造模成功率高是顱內(nèi)局部接種的顯著優(yōu)點(diǎn)，但同時(shí)也存在不少缺陷，例如難以還原腫瘤形成過程，即無法模擬肺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移過程中隨著血液流動形成腦轉(zhuǎn)移病灶等一系列步驟。陳愉生等[13]通過應(yīng)用胸腔原位及左心室注射法，將PC9細(xì)胞注入裸鼠，結(jié)果兩組腦轉(zhuǎn)移率分別為11.1%、100%，充分證明胸腔原位注射法相比，左心室注射法腦轉(zhuǎn)移率更高。

2.4.2 骨轉(zhuǎn)移模型 肺癌患者，骨轉(zhuǎn)移是肺部腫瘤較為多見的轉(zhuǎn)移位置，轉(zhuǎn)移率為30%～40%。當(dāng)前而言，應(yīng)用較多的肺癌骨轉(zhuǎn)移造模有以下幾種方法：

2.4.2.1 血管內(nèi)注射KUCHIMARU等[14]經(jīng)尾動脈注射和心內(nèi)注射兩種方法，結(jié)果顯示與心內(nèi)注射相比，應(yīng)用尾動脈注射法的腫瘤細(xì)胞運(yùn)輸效率為其3倍，且向小鼠下體器官具有顯性傳遞性，而心內(nèi)注射則導(dǎo)致癌細(xì)胞則擴(kuò)散到各種組織。與心內(nèi)注射相比，尾動脈注射組的小鼠骨量大大減少。生存期檢測顯示，心內(nèi)注射的小鼠注射后在25 d死亡率為100%，而尾動脈注射組小鼠生存期大于32 d。而后，多名學(xué)者經(jīng)尾動脈注射法成功進(jìn)行了肺癌骨轉(zhuǎn)移造模，且成功率較高，提示該方法是肺癌骨轉(zhuǎn)移造模的可行方法之一。

2.4.2.2 心室內(nèi)接種DAVID等[15]通過左心室注射法構(gòu)建A549細(xì)胞肺癌模型，使小鼠自發(fā)形成骨轉(zhuǎn)移。YANG等[16]通過左心室注射法建立肺癌自發(fā)轉(zhuǎn)移的模型，接種一周后給予生理鹽水或不同劑量的氟伐他汀干預(yù)，結(jié)果提示氟伐他汀可以抑制肺腺癌細(xì)胞其是骨骼的轉(zhuǎn)移。

2.4.2.3 骨髓腔內(nèi)注射 在骨髓腔內(nèi)注射腫瘤細(xì)胞即骨內(nèi)接種：其耗時(shí)短、費(fèi)用低，可用于較長期的研究，且實(shí)驗(yàn)期間內(nèi)不會發(fā)生其他臟器組織轉(zhuǎn)移，較適于進(jìn)行藥物實(shí)驗(yàn)。但關(guān)于其為原發(fā)或轉(zhuǎn)移腫瘤的討論仍無法統(tǒng)一意見。這種方法可效仿肺癌細(xì)胞在骨內(nèi)生長的狀況，但其缺陷是難以還原轉(zhuǎn)移經(jīng)過。SONN等[17]的研究在裸鼠L5椎體骨內(nèi)注入肺腺癌細(xì)胞，病理證實(shí)為L5椎體腫瘤侵犯，實(shí)現(xiàn)了肺癌單純性椎體轉(zhuǎn)移建模，在C57BL/6小鼠右后肢脛骨平臺下注射腫瘤細(xì)胞，然后進(jìn)行短暫免疫抑制，從而模擬肺癌骨轉(zhuǎn)移過程，結(jié)果顯示，在制備小鼠肺癌骨轉(zhuǎn)移模型，免疫抑制劑的中、高劑量組成瘤率較高，但相對而言，中等劑量組小鼠有較高的存活率。通過骨內(nèi)接種建立骨轉(zhuǎn)移模型，操作技術(shù)相對易行，但因骨轉(zhuǎn)移率低，少見與此相關(guān)的報(bào)道。

2.4.3 淋巴道轉(zhuǎn)移 有研究報(bào)道，在裸鼠不同部位(左側(cè)背部近腋窩、右側(cè)背部近腋窩、左側(cè)后肢和左后爪墊皮下)注入腫瘤細(xì)胞，結(jié)果顯示左側(cè)背部近腋窩注射成瘤率高，淋巴轉(zhuǎn)移率高，簡便易行，為通過皮下造模從而導(dǎo)致淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的最優(yōu)先選擇部位[18]。

3 進(jìn)展

3.1 選擇模型物種的創(chuàng)新 兔：相對于鼠而言，兔本身VX2肺癌細(xì)胞株具有與人源肺癌極其相似的形態(tài)及生理行為，且無自身免疫源性，所以被普遍運(yùn)用于兔肺癌建模。狗：因?yàn)檫m于在大動物體內(nèi)生長的瘤株難于找到，因此難進(jìn)行大動物模型的相關(guān)實(shí)驗(yàn)。犬傳染性性病腫瘤(CTVT)細(xì)胞作為新近的動物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ脱芯康臒狳c(diǎn)，其含有穩(wěn)定、獨(dú)特的生理特點(diǎn)，可以穿透細(xì)胞屏障，躲避體內(nèi)免疫監(jiān)視定植從而生長為腫瘤病灶。

3.2 移植性肺癌動物模型制方法改進(jìn) 微創(chuàng)胸腔穿刺進(jìn)行肺癌造模簡單易行，失敗率低，對動物損傷低，但針拔出時(shí)肺癌細(xì)胞易外溢，致胸腔播散，降低了獨(dú)立結(jié)節(jié)形成率，難以評估、監(jiān)測。最近數(shù)年移植方法的改進(jìn)為減少腫瘤細(xì)胞播散帶來曙光。

3.2.1 雙針共軸瘤塊原位移植 有研究報(bào)道，在兔體內(nèi)，CT輔助下運(yùn)用雙針共軸法將肺癌組織接種至兔體內(nèi)[19]。相比單針移植，雙針使胸腔播散率大大下調(diào)，而肺孤立結(jié)節(jié)形成率上升，更有利于實(shí)驗(yàn)的檢測和評估。肺內(nèi)孤立VX2成瘤率在該研究組為80%，而在林曉南[20]的報(bào)道中，則分別為75%和70%，顯而易見共軸穿刺法更勝一籌。

3.2.2 膠原蛋白海綿條 劉宇等[21]用兩條可生物降解的膠原海綿條前后包埋瘤塊，形成“三文治”結(jié)構(gòu)，再運(yùn)用胸腔穿刺術(shù)植入將其植入兔內(nèi)，能有效避免瘤塊播散導(dǎo)致胸腔種植。

3.2.3 親水凝膠 李欣等[22]在實(shí)驗(yàn)動物體內(nèi)移植包含瘤塊的親水凝膠，防止腫瘤細(xì)胞的播散。并且，其可提高瘤塊與實(shí)驗(yàn)動物肺上皮細(xì)胞的的接觸面積，因?yàn)槟z有親水性，可吸收水分而膨漲。

3.3 高轉(zhuǎn)移細(xì)胞株的獲取CUI等[23]在裸鼠皮下內(nèi)接種從中國肺癌患者腹水中提取的腫瘤細(xì)胞，1個(gè)月后切除原發(fā)腫瘤，將其接種至新小鼠皮下，反復(fù)傳代，并檢測各代腫瘤細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)移率，第一、二、三代分別為30%、60%、90%，得到轉(zhuǎn)移效率較高的瘤株，從而后續(xù)建模提供保障。

3.4 肺癌組織PDX模型的研究進(jìn)展 研究報(bào)道顯示，肺癌細(xì)胞在體外反復(fù)傳代可致一些基因發(fā)生篡改，而且，細(xì)胞經(jīng)過消化酶處理后，細(xì)胞生理特性會產(chǎn)生變化。親代肺癌組織的微環(huán)境及生理特點(diǎn)可被保存通過PDX模型的建立[24-26]。在免疫缺陷動物體內(nèi)接種手術(shù)或穿刺組織而來的肺部瘤塊進(jìn)行造模即肺癌PDX。新鮮腫瘤組織能立即造模(普遍要求1 h內(nèi)植入)也可低溫保存復(fù)蘇使用。瘤塊大小不等，2 mm3[27]、15～30 mm3[28]均見報(bào)道。瘤塊混合基質(zhì)膠再一起接種，若肺癌組織樣本量低，則需先混合基質(zhì)膠進(jìn)行離心，再植入免疫動物。PDX模型能使腫瘤微環(huán)境被最大程度保存。由于PDX模型更貼近人肺癌組織環(huán)境，所以越來越受到重視，可能是未來研究肺癌動物模型的方向[29-31]。

4 結(jié)語

綜上所述，移植性肺癌轉(zhuǎn)移模型是進(jìn)行肺癌研究的重要支撐，傳統(tǒng)的移植性肺癌轉(zhuǎn)移模型主要以皮下移植為主，但是肺臟與皮下所處內(nèi)環(huán)境存在天壤之別，不能精準(zhǔn)模擬肺癌的發(fā)生發(fā)展過程，因此還不能完全滿足我們的需要。目前新的移植性動物模型例如PDX模型越來越受研究人員的青睞，因其最大限度的保留親代肺癌組織的微環(huán)境及生理特點(diǎn)，同時(shí)相比肺癌原位接種操作相對簡單，可能是未來移植性肺癌模型研究方向。