肺癌發(fā)生骨轉(zhuǎn)移的機制進展

王東昌，李亞華(綜述)，邵 娟，陳 剛*(審校)

(1.河北醫(yī)科大學第三醫(yī)院呼吸一科，河北 石家莊 050051；2.河北醫(yī)科大學第三醫(yī)院老年病科，河北 石家莊 050051)

發(fā)生骨轉(zhuǎn)移的晚期肺癌患者承受著難以忍受的疼痛，因此需要使用世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO)鎮(zhèn)痛階梯中最高等級的強效阿片類藥物進行姑息治療[1]。除骨轉(zhuǎn)移導致的疼痛癥狀外，其常見的并發(fā)癥包括病理性骨折、脊髓和神經(jīng)壓迫綜合征和高鈣血癥，高鈣血癥可導致腎功能不全、心律失常，甚至導致患者死亡，嚴重影響這些患者的生活質(zhì)量[2]。因此，預防和治療肺癌骨轉(zhuǎn)移對改善患者的生活質(zhì)量和減少骨相關事件至關重要。本綜述的目的是對肺癌骨轉(zhuǎn)移研究領域已取得的分子機制進行概述，為探索有效預防或治療骨轉(zhuǎn)移方法提供理論基礎。

1 骨髓內(nèi)微環(huán)境及結(jié)構有利于骨轉(zhuǎn)移發(fā)生

骨髓微環(huán)境對肺癌細胞具有特別的吸引力：骨基質(zhì)含有大量轉(zhuǎn)化生長因子β超家族(transforming growth factor β，TGF-β)、胰島素樣生長因子(insulin-like growth factor，IGF)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)、血小板衍生生長因子(platelet-derived growth factor，PDGF)、成纖維細胞生長因子(fibroblast growth factor，F(xiàn)GF)和鈣。值得關注的是這些因子不僅儲存在骨基質(zhì)中，而且也可由成骨細胞主動產(chǎn)生[1,3]。

骨髓中的內(nèi)皮細胞形成多個有孔的竇，這有利于骨髓和血液循環(huán)中細胞的內(nèi)、外遷移。骨細胞和內(nèi)皮細胞之間以及血管生成和骨生成之間在發(fā)育和骨再生過程具有相互調(diào)節(jié)作用，其中骨細胞產(chǎn)生促血管因子，而內(nèi)皮細胞產(chǎn)生刺激骨構建的血管分泌因子[4]。具有重要意義的是，骨髓內(nèi)皮細胞參與了保持癌細胞和造血干細胞(hematopoietic stem cell，HSC)的休眠。細胞休眠是一種極其復雜的現(xiàn)象，它反映了骨髓微環(huán)境的復雜性和存在于其中的許多生態(tài)位。腫瘤休眠可以通過增殖停滯或使細胞死亡率與增殖率相等的方式來實現(xiàn)[5]。骨髓中至少有兩個生態(tài)位可以使癌細胞保持靜止：骨內(nèi)生態(tài)位和血管生態(tài)位，二者可能在骨髓微環(huán)境中共存和協(xié)作，但都依賴于細胞與細胞的接觸以及可溶性因子。許多癌細胞保持休眠的機制中與HSC用來維持自身靜止的分子途徑相似[5-8]，因此骨髓可能是細胞休眠發(fā)生的最常見的部位。

人體內(nèi)動脈血氧分壓為130～80 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)，腎臟等器官的血氧分壓為72 mmHg，而骨內(nèi)膜中血氧分壓急劇下降至50 mmHg，是一個缺氧的微環(huán)境，而這個環(huán)境條件與骨內(nèi)生態(tài)位接近[1]。缺氧似乎可以直接促進骨細胞的活動[9]。研究發(fā)現(xiàn)氧水平適應在細胞中非常重要，無論在生理還是病理條件下其作用主要是通過缺氧誘導因子(hypoxia-inducible factor，HIF)家族實現(xiàn)的[10-11]。在非小細胞肺癌中，已有研究提出HIF-1α與骨轉(zhuǎn)移之間的相關性[12]，結(jié)果顯示HIF-1α不僅作為局部轉(zhuǎn)移的決定因素，而且在腫瘤原發(fā)部位表達也能促進骨轉(zhuǎn)移的發(fā)生。

正是由于骨髓內(nèi)微環(huán)境具有以上特殊性，使得包括肺癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤易發(fā)生骨轉(zhuǎn)移，其在前列腺癌中的發(fā)病率為65%～90%，乳腺癌為65%～75%，肺癌為17%～64%，結(jié)直腸癌為10%[13-14]。

2 骨組織的“良性循環(huán)”與“惡性循環(huán)”

骨組織以一種嚴格控制的方式不斷進行著骨基質(zhì)的更新，從而保證了骨沉積和骨吸收之間的微妙平衡[1]。這個過程是從一個機械或分子刺激開始，刺激骨膜或骨內(nèi)膜細胞，然后這些骨內(nèi)膜細胞彼此遠離，暴露出需要重塑的骨表面。在此過程中同時會刺激破骨細胞前體，使其在原位分化為破骨細胞，附著并封閉暴露的骨部分，然后使其降解，進而清除降解的部分，促進成骨細胞分化。新形成的骨骼再次被骨內(nèi)膜細胞覆蓋，從而結(jié)束了所謂的骨骼“良性循環(huán)”?！傲夹匝h(huán)”過程中有大量的分子參與，肺癌細胞可以在其不同的階段對其進行改造，使其有利于促進自身的生長，當肺癌細胞將“良性循環(huán)”改造為“惡性循環(huán)”，也就標志著骨轉(zhuǎn)移的發(fā)生。

在體內(nèi)，成骨細胞產(chǎn)生有利于腫瘤生長的因子，如IGF、趨化因子、白細胞介素6和TGF-β。此外，成骨細胞還通過產(chǎn)生核因子κB配體受體激活劑(receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand,RANKL)和巨噬細胞集落刺激因子(macrophage-colony stimulating factor，M-CSF)來促進破骨細胞的分化和活性，進一步刺激因破骨細胞骨吸收而從骨基質(zhì)中釋放IGF-1、BMP、PDGF、TGF-β，進而促進腫瘤生長，重新啟動“惡性循環(huán)”[1,3,14]。此外，破骨細胞從骨基質(zhì)中釋放的鈣離子除了可導致潛在的致命性高鈣血癥外，它們還能刺激鈣敏感受體(calcium-sensing receptor，CaSr)陽性癌細胞，從而促進其生長、逃避凋亡和甲狀旁腺激素相關肽(parathyroid hormone-related peptide，PTHrP)的產(chǎn)生能力，在“惡性循環(huán)”中發(fā)揮作用。在“溶骨性惡性循環(huán)”中，腫瘤細胞產(chǎn)生的多種因子(如白細胞介素6、TNF-α、白細胞介素1β)，可直接或間接刺激破骨細胞前體分化為成熟破骨細胞，其結(jié)果是加劇了骨吸收過程[3,15]，造成包裹在骨基質(zhì)中的上述生長因子釋放，進而刺激腫瘤細胞生長。

3 肺癌發(fā)生骨轉(zhuǎn)移的關鍵環(huán)節(jié)

為了建立“惡性循環(huán)”，癌細胞首先必須從原發(fā)部位遷移到骨骼，這一過程可簡化為以下步驟：①局部侵襲；②轉(zhuǎn)移到血液或淋巴系統(tǒng)；③在遠處部位停滯并穿出血管；④免疫抵抗并在轉(zhuǎn)移部位建立支持其生長的生態(tài)位；⑤腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的激活。在大多數(shù)情況下，轉(zhuǎn)移過程在短時間內(nèi)發(fā)生，但也可能有數(shù)年的潛伏期，隨著時間的推移，即使原發(fā)腫瘤病灶較小也會脫落數(shù)百萬的循環(huán)腫瘤細胞(circulating tumour cell，CTC)，這些細胞現(xiàn)在可被用作液體活檢。CTC可能會在骨髓中轉(zhuǎn)移，成為播散性腫瘤細胞(disseminated tumour cell，DTC)。轉(zhuǎn)移過程中的每一步都需要一組特定的分子參與，其中一些分子可能在不同的實體癌中很常見，例如基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase 9，MMP-9)[16]，而另一些分子則對不同的癌癥或轉(zhuǎn)移類型有特異性，如與骨骼轉(zhuǎn)移相關的PTHrP[17]。

3.1腫瘤細胞歸巢 歸巢過程反映了癌細胞在遠處器官的微環(huán)境中扎根、存活、休眠或增殖的能力。這一過程雖然非常復雜，但目前已鑒定了許多分子標志物。極遲抗原4(very late antigen 4，VLA-4)可通過與骨髓內(nèi)皮細胞和基質(zhì)細胞中表達的血管細胞黏附分子1(vascular cell adhesion molecule 1，VCAM-1)相互作用，介導破骨細胞與骨基質(zhì)的黏附，有利于癌細胞歸巢和轉(zhuǎn)移。盡管對HSC與癌細胞歸巢機制的共性這一重要課題進行了多年研究，但它仍然具有繼續(xù)深入研究的必要[18]。這其中一個關鍵分子似乎是基質(zhì)衍生因子1(stromal-derived factor1，SDF-1)的配體C-X-C趨化因子受體4(C-X-C chemokine receptortype 4，CXCR4)。CXCR4對HSC歸巢至關重要，但癌細胞也可以利用這一途徑通過血流穿出血管后與骨髓基質(zhì)成分相互作用[19]。

CD44和αvβ3都是骨基質(zhì)的主要成分骨橋蛋白的受體[20]。CD44可能與αvβ3整合素協(xié)同作用，使肺癌細胞歸巢至骨。此外，CD44可與MMP-9相互作用，使癌細胞侵襲能力提高。CD44結(jié)合CXCR4可能對推動癌細胞進入骨髓生態(tài)位很重要，而CXCR4對于保持HSC在該生態(tài)位中至關重要，而對癌細胞也很重要。AnnexinII能結(jié)合SDF-1，是幫助HSC保持生態(tài)位的另一個關鍵因素。而癌細胞也可以利用這種蛋白質(zhì)來取代HSC在骨微環(huán)境中的位置。

關于Notch通路參與骨轉(zhuǎn)移的研究還很少，直到最近幾年才有關于這方面的研究[21]，Jagg-1是Notch家族成員的配體，可由轉(zhuǎn)移癌細胞表達，并能與成骨細胞和骨前體結(jié)合。Dickkopf-Wnt信號通路抑制物1(Dickkopf Wnt signaling pathway inhibitor1，DKK1)是一個新的骨轉(zhuǎn)移分子，已有研究表明，DKK1高表達提示腫瘤傾向于向骨轉(zhuǎn)移，而DKK1低表達提示腫瘤傾向于轉(zhuǎn)移到肺部，在受DKK1阻礙的通路中，這種現(xiàn)象仍然存在：在肺中，這種蛋白會破壞非常規(guī)的Wnt途徑，這將導致免疫細胞趨化，從而減緩生長；而在骨骼中，它作用于成骨細胞，減少典型的Wnt通路激活，從而使成骨細胞-破骨細胞平衡向破骨細胞傾斜，導致骨吸收增加[22]。

CCL-2又稱單核細胞趨化蛋白1(monocyte chemoattractant protein-1,MCP-1)，可以克服粒細胞單核細胞(granulocyte-monocyte，GM)-CSF的抗破骨細胞生成作用，是一種有效的破骨細胞生成誘導劑[23]。PTHrP和CCL-2之間的關系可能在骨轉(zhuǎn)移過程中很重要[24]。CCL-2由PTHrP誘導，進而誘導破骨細胞生成，同時增加腫瘤血管內(nèi)皮生長因子A(vascular endothelial growth factor A，VEGF-A)的生成，最終促進血管生成和腫瘤生長[23]。然而，抑制CCL-2在減少骨轉(zhuǎn)移方面的作用并不確定，這也表明骨微環(huán)境是非常復雜多樣的[25]。

3.2骨髓微環(huán)境中的細胞因子與骨轉(zhuǎn)移 成骨細胞完成生命周期后，有三種可能結(jié)局：①發(fā)生凋亡；②成為靜止的骨內(nèi)膜細胞；③分化為骨細胞。當已完成生命周期的程序被激活后，成骨細胞在自身周圍沉積骨基質(zhì)，骨基質(zhì)包裹成骨細胞后成為真正的骨細胞。骨細胞的數(shù)量遠遠超過其他細胞，其主要功能是通過一個復雜的相互連接的網(wǎng)絡感知微環(huán)境中的機械變化，通過初級纖毛感知剪切應力。骨細胞能夠協(xié)調(diào)并在特定情況下執(zhí)行骨吸收或沉積，以感應如機械負荷或泌乳等生理環(huán)境信號，以及微觀或宏觀骨折等病理信號[26]。在分子水平上，骨細胞主要是通過硬骨素(sclerostin，SOST)和RANKL來實現(xiàn)以上作用的，SOST是典型Wnt途徑的拮抗劑，可在不需要時減少骨形成，RANKL則使其控制破骨細胞的生成。

破骨細胞來源于單核細胞/巨噬細胞系的造血前體，其分化是一個多步驟的過程，涉及一系列轉(zhuǎn)錄因子的激活。在分化的最后階段，破骨細胞前體表達的M-CSF與受體c-fms結(jié)合，進而促進其生存和生長。RANKL導致核因子κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)活化，進而活化細胞漿中的鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶依賴型T細胞活化核因子(nuclear factor of activated T-cell，NFATc1)，這將使前體融合并產(chǎn)生成熟的、可吸收的破骨細胞。此外，過多的炎性細胞因子也可調(diào)節(jié)破骨細胞的發(fā)生[27]，而癌細胞常常利用這一特性誘導破骨細胞活動和骨吸收過程。

4 缺氧、血管生成與骨轉(zhuǎn)移

缺氧在骨轉(zhuǎn)移導致的疼痛中發(fā)揮一定作用，HIF-1α激活了癌細胞中的Warburg效應，從而誘導骨微環(huán)境中乳酸等成分的釋放，進而向骨骼中的傷害性感受器發(fā)出信號，導致了疼痛癥狀[1]。另一方面是破骨細胞被“惡性循環(huán)”激活，而靶向V-ATPase可減少癌癥引起的骨痛[28]，與此同時腫瘤細胞可利用V-ATPase在骨微環(huán)境中釋放相關因子以利于轉(zhuǎn)移發(fā)生。

與缺氧和癌癥相關的另一個重要方面是持續(xù)的血管生成，缺氧增加血管生成的概念已經(jīng)被認識多年。事實上，HIF-1α可以激活VEGF及其受體的表達，激活血管生成素、bFGF、PDGF、干細胞因子(stem cell factor，SCF)、骨橋蛋白(osteopontin，OPN)、MMP、一氧化氮合酶2(nitric oxide synthase 2，NOS-2)、環(huán)氧合酶2(cyclooxygenase 2，COX-2)以及對成骨細胞骨轉(zhuǎn)移有重要作用的內(nèi)皮素1(endothelin-1，ET-1)的表達。骨轉(zhuǎn)移瘤除了具有促進血管系統(tǒng)生成并輸送營養(yǎng)和氧氣外，還可以通過激活骨髓中的血管生成程序促進血管生態(tài)位的建立。VEGF一方面可以促進成骨細胞的分化和活動，助長成骨細胞的“惡性循環(huán)”，另一方面，它可以激活破骨細胞的生成，助長“溶骨惡性循環(huán)”。BFGF同樣可以觸發(fā)破骨細胞分化，也可以激活成骨細胞活性，因此，可能導致骨轉(zhuǎn)移的兩個“惡性循環(huán)”。

5 免疫細胞在骨生物學和腫瘤轉(zhuǎn)移中的作用

免疫細胞是骨生理學和病理學中最重要的調(diào)節(jié)因素之一。Th17細胞可直接或間接通過成骨細胞誘導RANKL和M-CSF，誘導破骨細胞生成，而免疫抑制性T-reg細胞則抑制破骨細胞生成。B細胞可產(chǎn)生RANKL，RANKL既是自分泌因子，又是破骨細胞生成的誘導因子。此外，中性粒細胞主要通過細胞因子分泌和原位吸引Th17淋巴細胞來影響骨生理。所有這些存在于骨髓中的免疫細胞除了影響骨生物學之外，還影響骨轉(zhuǎn)移過程。

骨轉(zhuǎn)移患者血液循環(huán)中的破骨細胞前體數(shù)量增加，而這些細胞與T細胞共培養(yǎng)時無需RANKL或M-CSF，即可導致破骨細胞生成。T細胞和腫瘤細胞之間的RANKL-RANK接觸可促進腫瘤生長、侵襲和轉(zhuǎn)移。通過敲除Lyn酪氨酸激酶可增加T細胞的反應能力，導致破骨細胞骨吸收增加，而抑制骨轉(zhuǎn)移生長。

轉(zhuǎn)移性骨生長的另一種重要細胞類型是髓源性抑制細胞(myeloid-derived suppressor cell，MDSC)。MDSC的特征是Gr-1和CD11b共同表達，可抑制先天性免疫和獲得性免疫，從而促進包括肺癌、乳腺癌和多發(fā)性骨髓瘤在內(nèi)的多種癌癥的腫瘤生長。MDSC還能夠通過分泌VEGF和bFGF來激活腫瘤血管生成，這些VEGF和bFGF可激活成骨細胞和破骨細胞的活性，從而促進成骨細胞和溶骨的惡性循環(huán)。免疫細胞也參與了兩種不同類型腫瘤休眠的建立。一方面，潛在的休眠腫瘤細胞與HSC競爭其休眠的骨內(nèi)生態(tài)位[29]，另一方面，免疫細胞也能夠抑制轉(zhuǎn)移癌細胞或原發(fā)癌細胞，平衡腫瘤增殖能力和免疫介導的對腫瘤的殺傷能力，從而誘導腫瘤進入休眠狀態(tài)，這個過程被稱為免疫介導的休眠[30]。此外，已證明中性粒細胞和巨噬細胞被癌細胞交替激活為M2或N2表型，從而成為腫瘤相關中性粒細胞(tumour-associated neutrophil，TAN)或巨噬細胞(macrophages，TAM)，最終導致血管生成增加和包括骨轉(zhuǎn)移在內(nèi)的腫瘤播散。以上內(nèi)容并不是骨微環(huán)境中癌細胞和免疫細胞之間的全面相互調(diào)節(jié)，因為如果一個腫瘤能夠在機體強大的免疫監(jiān)視及清除系統(tǒng)中生長，它對免疫系統(tǒng)的作用一定是相當復雜的。

6 細胞外囊泡(extracellular vesicle，EV)與骨轉(zhuǎn)移

EV是直徑為20～1 000 nm的顆粒，其含有多分子物質(zhì)，可以反映原始細胞的組成，或者富含特定分子，與多種病理生理事件有關，幾乎每種細胞類型都可以將其用作旁分泌和遠距離信息傳遞的手段[31-32]。癌細胞可以利用EV來影響它們的微環(huán)境，促進腫瘤的進展、轉(zhuǎn)移和器官向性[33]。研究發(fā)現(xiàn)成骨細胞通過成骨細胞-EV-RANKL的方式可無需直接接觸細胞就能促進破骨細胞存活[34]。

EV可以根據(jù)膜上的整合素集在腫瘤轉(zhuǎn)移時判斷腫瘤的器官取向性，重新改造一個特定的微環(huán)境，使之成為一個預轉(zhuǎn)移生態(tài)位，但是目前未發(fā)現(xiàn)特定的EV整合素與骨轉(zhuǎn)移發(fā)生有直接關系。另有研究表明肺癌源性EV介導的雙調(diào)蛋白(Amphiregulin)[35]或miR-21[36]可促進破骨細胞的生成，而另一研究中發(fā)現(xiàn)了在轉(zhuǎn)移性肺癌中富集的EV-miR信號。

EV是細胞的通訊載體，在藥物傳遞領域開辟了許多可能性，如能在EV裝載藥物，可以使不良反應最小化，同時增加靶細胞內(nèi)的藥物濃度。因為骨內(nèi)生態(tài)位是缺氧的，灌注也相對較小，以EV為載體的靶向治療將有助于提高細胞毒性藥物的療效。

7 展 望

近年來在肺癌骨轉(zhuǎn)移方面已經(jīng)開展了大量工作，確定了一些有效的治療方案，如雙膦酸鹽和特異性靶向RANKL的地諾單抗，它們都是針對惡性循環(huán)的破骨細胞。因此，骨轉(zhuǎn)移是可以治療的，但目前仍然無法治愈。對肺癌發(fā)生骨轉(zhuǎn)移的分子生物學機制的認識還很局限，很多問題還需研究人員繼續(xù)深入探索，有理由相信隨著對其機制的認識不斷地深入，必將為新的治療和預防方案提供更多的理論依據(jù)，以期克服這種常見的肺癌并發(fā)癥。