骨髓細胞在牽拉成骨中作用的研究進展

方 均，張 一(綜述)，王 斌*(審校)

(1.河北省唐山市第二醫(yī)院手外科，河北 唐山 063000;2.華北理工大學附屬醫(yī)院骨科，河北 唐山 063000)

牽拉成骨(distraction osteogenesis，DO)是在截骨的兩端安裝牽拉裝置，然后以適當?shù)乃俾薁坷毓嵌耍ぐl(fā)體內(nèi)組織再生能力，在延長區(qū)內(nèi)誘導新骨形成的過程，目前已廣泛應用于骨缺損、骨延長、骨感染、肢體矯形、下肢慢性缺血性疾病[1]等。成骨的作用離不開骨髓與骨膜的共同作用。骨髓中含有多種細胞成分，這些細胞是DO過程中形成新血管及骨組織的重要來源之一。從骨髓中分離的成人間充質(zhì)干細胞(bone mesenchymal stem cells，MSCs)具有多種潛能，可分化為骨、軟骨、肌肉和脂肪等組織。骨髓中同時含有豐富的生長因子，這些生長因子為在DO中新骨形成中起到重要的調(diào)節(jié)作用。在DO中，血管再生是新骨生成的基本保證，而骨髓中富饒的血管系統(tǒng)，為DO提供了充足的營養(yǎng)與支持作用。既往有學者以骨膜為入手點綜述其在DO中的作用機制[2]，故本文以骨髓細胞為入手點綜述其對DO的作用機制。

1 DO相關的骨髓細胞成分及其發(fā)生

骨髓位于髓腔及松質(zhì)骨間隙中，是一種近似海綿狀、膠凍狀或脂肪性的柔軟組織，由血管、網(wǎng)狀組織和各種基質(zhì)組成，富含多種細胞成分。骨髓促進牽張成骨的作用與其細胞成分密切相關，主要包括骨髓間充質(zhì)干細胞(bone mesenchymal stem cells，BMSCs)[3]、內(nèi)皮祖細胞(endothelial progenitor cells，EPCs)[4]、成骨細胞(osteoblasts，OBs)[5]、破骨細胞(osteoclasts，OCs)[5]等。

BMSCs是一種來源于中胚層的非造血性多能干細胞，存在于髓腔骨內(nèi)膜、基質(zhì)以及血管周圍，具有極強的成骨能力。Pittenger等[6]對BMSCs的誘導分化實驗中證明，在BMSCs的培養(yǎng)基中加入不同的誘導劑可誘導形成脂肪細胞、軟骨細胞、成骨細胞等。來源于髓系血細胞的單核巨噬細胞所融合而成的破骨細胞，則具有吸收骨質(zhì)的能力。成骨細胞的生成骨質(zhì)能力與破骨細胞的骨質(zhì)吸收能力共同作用，參與骨質(zhì)的改建與塑形。因此，骨髓間充質(zhì)干細胞、成骨細胞、破骨細胞等在DO中起到重要的成骨塑形作用。

EPCs起源于胚胎發(fā)育早起的中胚層，主要來源于骨髓，是一種能直接分化為血管內(nèi)皮細胞(endothelial cells，ECs)的前體細胞，可促進血管的修復與再生[7]。Lee等[8]在DO過程中檢測到EPCs分泌的細胞動員因子如血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、超化因子1(stromal cell-derived factor-1,SDF-1)增加，證明了DO過程中EPCs的動員。SDF-1可促進DO中延長區(qū)新骨礦化。Lee等[9]的另一DO實驗，在大鼠DO模型中測量血流量及EPCs分布，證明了EPCs的動員以及歸巢有助于DO中新血管的生成。Jia等[4]與Lee等[9]分別在大鼠實驗與臨床研究中證明了骨髓細胞中的內(nèi)皮祖細胞通過刺激血管形成加快了DO的骨礦化過程。由此看來，EPCs分化為ECs促進血管形成，對于DO中髓腔的循環(huán)起到了至關重要的作用，眾所周知循環(huán)系統(tǒng)可發(fā)揮營養(yǎng)支持作用；同時EPCs分泌的SDF-1促進了DO的骨礦化。因此EPCs也是DO中不可或缺的細胞之一。

2 DO中重要骨髓細胞間相互作用

復雜的生物學效應并不是由某種細胞單獨發(fā)揮作用，而是多種細胞之間通過相互作用來表達。

BMSCs和EPCs作為DO中兩種重要的細胞，各司其職的同時又互相影響。有研究表明，當BMSCs與EPCs共同培養(yǎng)相比單獨培養(yǎng)時，VEGF、Ⅰ型膠原蛋白(type-Ⅰ collagen)、骨橋蛋白(osteopontin，OPN)、骨結(jié)核素(osteonectin，OCN)的mRNA表達明顯上調(diào)，說明BMSCs與EPCs相互作用既可以促進成骨也可以促進成血管[10]。EPCs已被證實可以通過分泌某些因子分化為血管內(nèi)皮細胞，Qin等[11]對EPCs與BMSCs研究指出，EPCs通過分泌細胞外小泡(endothelial progenitor cells extracellularvesicles，EPC-EVs)來調(diào)節(jié)BMSCs的增殖與分化。Yu等[12]的研究中表明，當BMSCs與EPCs共同培養(yǎng)時，不僅相互促進增殖，而且提高了抗凋亡蛋白Bcl-2的表達以及降低了促凋亡蛋白Bax和Caspase3的表達，因此兩種細胞共同培養(yǎng)時具有互相抑制凋亡的作用，同時也證明了BMSCs與EPCs兩者通過PI3K/Akt/Cox2軸來介導上述作用。因此，DO中的BMSCs與EPCs共存時相互提高活性，不僅促進各自獨有的作用，而且共同促進成骨塑形與成血管作用。

骨的動態(tài)平衡由OCs與OBs共同作用，前者移除舊的骨質(zhì)，后者形成新的骨質(zhì)。當這種動態(tài)平衡被打破時，會導致骨質(zhì)疏松癥或骨硬化癥。成骨細胞可分泌多種細胞因子，如核因子κ B受體活化因子配體(receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL)、巨噬細胞集落刺激因子(macrophage-stimulating factor，M-CSF)、單核細胞趨化蛋白1(monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1)等[13]。M-CSF上調(diào)破骨細胞前體細胞膜上RANK的表達，加強RANK的配體RANKL與其結(jié)合，促進破骨細胞的分化以及骨質(zhì)的吸收[14]。MCP-1與破骨細胞前體細胞表達的MCP-1受體特異性結(jié)合，RANKL調(diào)控前體破骨細胞向破骨細胞分化的過程[15]。破骨細胞也可分泌多種細胞因子影響成骨細胞的發(fā)生與其成骨作用，如肝配蛋白、臂板蛋白和叢狀蛋白等[16]。總的來說，DO中新骨的改建與塑形離不開OBs與OCs的相互作用。

各種骨髓細胞在DO過程中發(fā)揮不同的作用，相互影響共同調(diào)控DO過程，簡要作用見表1。

表1 骨髓細胞在牽拉成骨中的作用

3 DO中骨髓重要細胞的信號通路

3.1經(jīng)典BMP信號通路 骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)屬于轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)超家族的一類多功能生長因子，目前對其研究及應用最為廣泛，BMP的信號傳導既有典型的依賴Samd途徑[17]，也有非典型的不依賴Samd途徑(如p38絲裂原活化蛋白激酶，p38-MAPK)[18]。

BMP在DO中具有極強的成骨作用[19-20]。DO中，經(jīng)典的級聯(lián)反應BMP-Samd信號通路，BMP2、BMP4等首先與細胞膜上具有絲氨酸/蘇氨酸激酶活性的受體BMPR Ⅱ結(jié)合并使其磷酸化，然后激活受體BMPR Ⅰ，BMPR Ⅰ進一步磷酸化Smad1、Smad5和Smad8，磷酸化后的Smad1、5、8與Smad4在細胞質(zhì)中形成復合物，轉(zhuǎn)位到細胞核后，復合物與成骨細胞中的其他轉(zhuǎn)錄因子如Runx2相互作用使靶基因翻譯及表達相關蛋白[18]，促進BMSCs向前體成骨細胞分化[21]。Khanal 等[22]用免疫組織化學方法的對DO中的BMP2、BMP4和Smad1、Smad5、Smad8進行檢測，這些因子首先出現(xiàn)在截骨邊緣的間充質(zhì)細胞與成骨細胞中，隨著延長的進行這些細胞高度表達，牽拉結(jié)束后相關因子隨著時間的推移逐漸表達降低。Li等[23]在兔DO的模型中指出，應用rhBMP-2和rhBMP-2聯(lián)合纖維蛋白的實驗組無論在放射學、Micro-CT、組織學還是彎曲力學檢查上，均優(yōu)于空白組及對照組，說明了rhBMP-2對DO具有較強的成骨作用。

3.2p38/MMP-2信號通路 DO穩(wěn)定、持續(xù)、緩慢的牽拉提供了一個幾乎靜態(tài)的機械應變力，BMSCs感知靜態(tài)應變力后，被血管基底膜(vessel of basilar membrane，VBM)釋放并遷移到延長區(qū)促進骨的再生與修復。p38蛋白作為絲裂原活化蛋白激酶超家族的成員之一，可調(diào)節(jié)細胞對機械信號的反應及促進細胞遷移。Yang等[24]團隊的一項實驗中證實了實驗組(DO組)大鼠的延長區(qū)骨痂中Nestin+/p38+細胞數(shù)明顯高于對照組(非DO組)，且體外實驗中具有活性的p38可促進BMSCs的遷移及應用p38的阻斷劑后阻斷了p38的活化及MMP-2的表達，首次揭示了靜態(tài)應變通過p38/MMP-2信號通路促進BMSCs遷移。

3.3FGF/FGFR信號通路 成纖維細胞生長因子(fibroblast growth factor，F(xiàn)GF)在胞膜上與具有酪氨酸激酶活性的受體FGFR(FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4)特異性結(jié)合后，引起細胞內(nèi)信號傳導級聯(lián)反應，其中對DO中成骨細胞具有重要影響。Haque等[25]采用兔脛骨的DO模型分析了FGF1，F(xiàn)GF2，F(xiàn)GF18，IGF1，IGF2，TGFβ1的時間與空間上的分布，結(jié)果顯示延長期的成骨細胞明顯表達FGF2，且FGF18不同于其他影響因子，其在牽拉各個時期均顯著表達，提示FGF18對DO的作用尤為顯著。Fang等[26]對小鼠下頜骨DO的研究中表明，在截骨后第13天(延長期)，正常牽拉組小鼠的FGF2水平是急性延長組小鼠FGF2水平的4倍，正常牽拉組小鼠均獲得骨性愈合，而急性延長組小鼠則出現(xiàn)纖維性骨不連的情況，表明FGF2對DO具有重要的成骨作用。

3.4SDF-1/CXCR4軸-PI3K/Akt信號通路 細胞基質(zhì)衍生因子(stromal cell derived factor-1，SDF-1)與G蛋白偶聯(lián)受體C-X-C基序趨化因子受體(C-X-C motif receptor 4，CXCR4)特異性結(jié)合后，PI3K(磷脂酰肌醇3激酶)再被偶聯(lián)受體上的Gβγ亞基結(jié)合，使PIP2磷酸化成PIP3，PIP3作為細胞內(nèi)重要的第二信使可磷酸化Akt(蛋白激酶B)從而發(fā)揮下游的生物學效應。SDF-1/CXCR4軸-PI3K/Akt信號通路作為人體中一條重要的信號通路，有研究表明其不僅對EPCs募集、分化、遷移、抗凋亡具有關鍵的作用[27-28]，也有研究表明其同時對BMSCs具有分化、遷移作用[29-30]。

Fujio等[31]對小鼠DO的實驗中證明快速DO組(H-DO)的小鼠局部應用SDF-1后，可募集骨髓的內(nèi)皮細胞與EPCs加速血管生成從而促進延長區(qū)的礦化。Xu等[32]在大鼠DO與骨折的模型中證明，DO組SDF-1和成骨相關基因的表達水平均高于骨折組，SDF-1的峰值出現(xiàn)在牽張期結(jié)束時，且在大鼠BMSCs的培養(yǎng)中，應用CXCR4拮抗劑AMD3100后，堿性磷酸酶與早期成骨相關基因表達明顯降低。

3.5Wnt/β-catenin信號通路 Wnt/β-catenin信號通路又被稱為經(jīng)典的Wnt通路，Wnt與細胞表面受體Frizzled結(jié)合后阻止β-catenin降解，上調(diào)的β-catenin轉(zhuǎn)移到細胞核后刺激下游相關基因的表達。Wnt/β-catenin信號已被證明可以促進BMSCs向成骨細胞的分化[33]。Wang等[34]對大鼠DO實驗中證明，應用Wnt通路拮抗劑rrDkk1后，β-catenin和Lef-1受到抑制，長期的結(jié)果顯示延長區(qū)礦化明顯受限，因此Wnt信號通路參與了DO的整個過程。

DO延長區(qū)中新血管形成、新骨形成改建塑形受到可受到多條關鍵信號通路共同調(diào)控，經(jīng)典BMP信號通路、p38/MMP-2信號通路、FGF/FGFR信號通路、SDF-1/CXCR4軸-PI3K/Akt信號通路、Wnt/β-catenin信號通路等在調(diào)節(jié)新骨形成改建塑形扮演了重要角色，同時SDF-1/CXCR4軸-PI3K/Akt信號通路對延長區(qū)中新血管的形成也起到了不可或缺的作用。p38/MMP-2信號通路、SDF-1/CXCR4軸-PI3K/Akt信號通路受到牽張力的刺激后可促進BMSCs向延長區(qū)的遷移，當BMSCs到達延長區(qū)后又受到經(jīng)典BMP信號通路、FGF/FGFR信號通路、Wnt/β-catenin信號通路等的調(diào)控，促進BMSCs向OBs的分化；SDF-1/CXCR4軸-PI3K/Akt信號通路與此同時調(diào)控EPCs的募集、分化，加速延長區(qū)中新血管的形成，為成骨過程提供有利的環(huán)境。這些信號通路相互聯(lián)系、互相影響、共同作用。雖然DO中信號通路的研究在某些方面取得了重要進展，但各個通路之間是否存在多個交集、是否單個信號可調(diào)控多通路的機制仍未完全明確，有待學者們的進一步研究。

4 DO中髓腔內(nèi)的循環(huán)

DO依賴于良好循環(huán)的建立，因髓腔中無淋巴循環(huán)，故主要是延長區(qū)新血管的形成，局部血供是新骨形成最基本的條件，各種細胞成分、營養(yǎng)因子多通過血管系統(tǒng)到達所需部位，促進DO中骨的形成、塑形與改建。

正常的骨組織中，滋養(yǎng)血管穿過皮質(zhì)骨進入髓腔，滋養(yǎng)動脈形成的小分支動脈圍繞在滋養(yǎng)靜脈形成的中央靜脈的周圍，部分進入皮質(zhì)骨哈弗管的細小動脈經(jīng)血竇回流到小靜脈，髓腔內(nèi)的血液流動呈環(huán)形，髓腔中心流向髓腔周圍再返回髓腔中心[35]。在DO中，髓腔內(nèi)血管的再生，為延長區(qū)提供了多種循環(huán)因子以及細胞，同時遷移的血管內(nèi)皮細胞是新骨生成與骨改建重塑中的活躍分子。Choi等[36]對大鼠脛骨進行了DO研究，在延長區(qū)采用血管鑄型與掃描電鏡觀察的方法，結(jié)果顯示截骨后髓內(nèi)小靜脈與血竇明顯擴張，并且在血竇周圍出現(xiàn)了許多新生萌芽血管，延長區(qū)內(nèi)新骨的形成從血竇生成開始，伴隨著延長，從截骨面新生的血管相向而行，血管生成與血流量逐漸豐富，但并未進入由成纖維細胞、軟骨樣細胞與中間態(tài)細胞形成的位于延長區(qū)中間的纖維間帶(fibrous interzone，F(xiàn)IZ)中，延長期結(jié)束后，截骨面兩側(cè)相向而行的新生血管互相吻合，此后發(fā)生骨組織的再生。只有形象的觀察正常骨組織與DO中的血液循環(huán)，才有助于學者們深入了解DO中新骨形成、塑形與改建這一復雜的新骨形成規(guī)律。

5 骨髓細胞促進DO愈合的臨床應用

利用骨髓細胞移植的方式加速DO愈合的報道越來越多，并取得了令人滿意的結(jié)果。Kitoh等[37]對46例(92側(cè)骨)患者的下肢進行DO技術后采用注射自體骨髓系細胞(bone marrow cells，BMC)聯(lián)合富血小板血漿(platelet-rich plasma，PRP)治療的臨床研究中表明，注射BMC+PRP治療組患者的愈合指數(shù)明顯小于未注射的對照組，治療組未出現(xiàn)延遲礦化，對照組有45%的患者出現(xiàn)延遲礦化，兩組有關并發(fā)癥發(fā)生率分別為6%和23%，各數(shù)據(jù)差異均有統(tǒng)計學意義。同時發(fā)現(xiàn)注射BMC+PRP后股骨的治療效果優(yōu)于脛骨。Memeo等[38]對8例因軟骨發(fā)育不全而行DO延長術治療但發(fā)生延遲愈合的患者采用了注射自體濃縮骨髓抽吸物(bone marrow aspirate concentrate， BMAC)，經(jīng)髂骨骨髓抽取的BMAC富含干細胞、單核細胞、淋巴細胞及骨髓固有細胞等有核細胞，將BMAC注射到延長區(qū)的新生骨中。術后所有8例患者的新生骨的質(zhì)量得到改善，延遲愈合平均恢復時間為5.2個月，愈合指數(shù)18.7～23.8 d/cm，平均23.1 d/cm。Memeo等[38]可能是首次使用BMAC治療因軟骨發(fā)育不全患者行DO中延遲愈合的問題。Lee等[39]對20例行DO延長雙側(cè)脛骨的患者進行隨機分組后，治療組中10例(20側(cè)脛骨)患者注射自體BMAC+PRP，而對照組未注射。術后治療組的每側(cè)皮質(zhì)愈合指數(shù)及完全負重指數(shù)均小于對照組，差異有統(tǒng)計學意義，提示了治療組的骨愈合較快且較早達到完全負重，證明了在DO中截骨部位應用BMAC+PRP有助于促進骨愈合。Lim等[40]對1例下頜骨發(fā)育不良的患者采用了DO矯正畸形，為縮短治療周期，該團隊將取自患者髂骨的骨髓分離出BMSCs，經(jīng)傳代培養(yǎng)后分化為OBs，注射到礦化期的延長區(qū)中。該患者獲得了有效愈合且沒有出現(xiàn)任何并發(fā)癥。

由于骨髓細胞富含單個核細胞，其成分較多，具有較強的分化能力，在骨愈合方面具有很高的潛力；富血小板血漿中同時富含一些營養(yǎng)因子。因此究竟是骨髓細胞或是富血小板血漿起主要作用，亦或是兩者對于加速DO愈合同等重要，尚未有明確報道。仍有待學者們的進一步探索。

6 總結(jié)與展望

本文以骨髓細胞在DO中作用機制為切入點，總結(jié)骨髓中與DO有關的細胞(如BMSCs、EPCs、OBs、OCs等)及其發(fā)生、細胞間的相互作用、細胞相關通路等，發(fā)現(xiàn)各司其能的同時又共同調(diào)控延長區(qū)新血管形成和新骨的形成改建塑形，通過簡述DO髓腔內(nèi)的循環(huán)有助于加深了解DO這一復雜的新骨形成規(guī)律，列舉骨髓系細胞的臨床應用有力的佐證了骨髓細胞在DO中不可或缺的地位。

目前學者們多以骨膜為切入點研究DO的作用機制，但骨髓與骨膜同為骨骼系統(tǒng)的重要組成部分，共同調(diào)控DO這一過程。經(jīng)查閱相關文獻后，骨髓細胞在DO中的作用機制相對較少。骨髓細胞間通過何種具體機制相互作用共同DO愈合仍未明確，未來的研究方向應著重于細胞間的相互作用，因為生物學效應依賴多細胞的共同的作用。在DO中，臨床醫(yī)師在詳細了解每種細胞的分子機制、細胞間相互作用及生物信號通路等更能造?；颊卟⑼苿覦O技術的發(fā)展。

DO技術通過對所牽拉組織施加緩慢、持續(xù)、穩(wěn)定的牽張力，可使相應組織細胞發(fā)生類似于胚胎再發(fā)育的過程。經(jīng)過半個多世紀的發(fā)展，此技術應用于多種難治性疾病并取得了顯著成效，伴隨著新研究方法的出現(xiàn)，可能發(fā)現(xiàn)更多的機制以及某些已發(fā)現(xiàn)的機制需要進一步的完善。