非小細(xì)胞肺癌免疫微環(huán)境的細(xì)胞分類及研究進(jìn)展

謝雯瑩，張大川，王 輝，賈晨昊，李 青

目前肺癌病死率位居惡性腫瘤的首位，其發(fā)病率呈逐年增高趨勢(shì)[1]。其中非小細(xì)胞肺癌(non-small-cell lung cancer, NSCLC)是肺癌最常見(jiàn)的病理類型，5年生存率僅為23%[2]。雖然現(xiàn)階段肺癌的手術(shù)、放療、化療和靶向治療等治療方案取得了一定的進(jìn)展，但是多數(shù)患者在確診時(shí)已發(fā)生局部進(jìn)展或廣泛轉(zhuǎn)移，預(yù)后仍較差。目前，免疫治療已成為包括肺癌在內(nèi)的實(shí)體腫瘤治療的新方案，但僅有30%的患者受益[3]。腫瘤微環(huán)境(tumor microenvironment, TME)由腫瘤細(xì)胞、免疫細(xì)胞、腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞(cancer-associated fibroblasts, CAFs)、信號(hào)分子和細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)組成，主要可分為以免疫細(xì)胞為主的免疫微環(huán)境和以CAFs為主的非免疫微環(huán)境。在肺癌TME中，腫瘤細(xì)胞可以通過(guò)影響腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞以促進(jìn)腫瘤的發(fā)生[4]。本文現(xiàn)就NSCLC免疫微環(huán)境的細(xì)胞分類及其研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 T細(xì)胞

浸潤(rùn)在腫瘤局部的淋巴細(xì)胞被稱為腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞(tumor infiltration lymphocytes, TILs)，浸潤(rùn)的CD4+和CD8+T細(xì)胞及其免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞因子在TME中發(fā)揮適應(yīng)性免疫作用。腫瘤間質(zhì)中CD4+/CD8+T細(xì)胞的浸潤(rùn)與NSCLC患者的預(yù)后及生存率密切相關(guān)，腫瘤間質(zhì)淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)越多的NSCLC患者，其總生存期(overall survival, OS)和無(wú)瘤生存期(disease-free survival, DFS)越長(zhǎng)，預(yù)后越好[5]。

大量研究表明，腫瘤浸潤(rùn)C(jī)D8+T細(xì)胞與肺癌患者的預(yù)后顯著相關(guān)。Ganesan等[6]的研究結(jié)果證實(shí)，CD8+T細(xì)胞是抑制肺癌生長(zhǎng)的關(guān)鍵細(xì)胞，其生物學(xué)效應(yīng)功能可以被CD4+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cells, Tregs)抑制，基本轉(zhuǎn)錄譜可用于指導(dǎo)患者選擇更加合適的免疫治療方法，還可用于開(kāi)發(fā)能預(yù)測(cè)單一或聯(lián)合檢查點(diǎn)阻斷治療臨床反應(yīng)的生物學(xué)標(biāo)志物[7]。細(xì)胞程序性死亡受體-1(programmed cell death-1, PD-1)、T細(xì)胞免疫球蛋白黏蛋白-3(T-cellimmunoglobulin mucin-3, TIM-3)、細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4(cytotoxic T lymphocyte-associated antigen4, CTLA4)、淋巴細(xì)胞活化因子-3(lymphocyte activation gene-3, LAG-3)等在CD8+T細(xì)胞上的表達(dá)與疾病進(jìn)展有關(guān)，且T細(xì)胞的活化和效應(yīng)功能隨著抑制性受體表達(dá)的增加而降低[8]。Kim等[9]研究發(fā)現(xiàn)肺鱗狀細(xì)胞癌中PD-L1和PD-L2的表達(dá)與CD8+TILs數(shù)量增加和MET基因表達(dá)增加有關(guān)，這可能為針對(duì)PD-1/PD-Ls信號(hào)通路靶向治療肺鱗狀細(xì)胞癌提供新思路。

除CD8+T細(xì)胞外，其他CD4+T細(xì)胞，如Tregs和Th17細(xì)胞亞群也是導(dǎo)致包括癌癥在內(nèi)等多種疾病發(fā)展的關(guān)鍵因素。這兩者在TME中調(diào)節(jié)細(xì)胞因子和趨化因子的產(chǎn)生，促進(jìn)免疫細(xì)胞的募集并參與調(diào)節(jié)抗腫瘤和促腫瘤免疫細(xì)胞的活化狀態(tài)，通過(guò)改變免疫細(xì)胞的數(shù)量和功能促進(jìn)肺癌的發(fā)展、轉(zhuǎn)移[10]。NSCLC患者的CD4+T細(xì)胞數(shù)量較鄰近正常肺組織的CD4+T細(xì)胞數(shù)量顯著增多，其中CD4+Foxp3+Tregs在這些腫瘤浸潤(rùn)細(xì)胞中占比較大[6]。Guo等[11]研究發(fā)現(xiàn)腫瘤浸潤(rùn)的Tregs中存在異質(zhì)性，根據(jù)TNFRSF9的表達(dá)可以將其分為活性高、低兩群，其中激活態(tài)Tregs的比例與肺腺癌患者的不良預(yù)后相關(guān)。Th17細(xì)胞可通過(guò)產(chǎn)生IL-17促進(jìn)炎癥反應(yīng)，IL-17及其信號(hào)通路的改變與肺癌的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)，IL-17基因多態(tài)性和IL-17信號(hào)通路的表觀遺傳改變與肺癌易感性增加有關(guān)[12]。目前，關(guān)于肺癌中Tregs和Th17細(xì)胞亞群的平衡機(jī)制及其對(duì)評(píng)估預(yù)后的價(jià)值仍需深入探究。

2 B細(xì)胞

在NSCLC亞型中，腫瘤浸潤(rùn)性B細(xì)胞(tumor-infiltrating B cell, TIB)總數(shù)比癌旁組織多，其中以肺腺癌最為明顯[13]。TIB和CD4+TILs位于三級(jí)淋巴結(jié)構(gòu)(tertiary lymphoid structure, TLS)內(nèi)，TLS與早期NSCLC的良好預(yù)后呈正相關(guān)，提示TIB在NSCLC中具有抗腫瘤作用。Germain等[14]研究發(fā)現(xiàn)，在NSCLC中TLS生發(fā)中心發(fā)生體細(xì)胞高頻突變和類別轉(zhuǎn)換重組機(jī)制被激活，證實(shí)B細(xì)胞密度對(duì)NSCLC患者預(yù)后生存具有較高的預(yù)測(cè)價(jià)值，而低密度的CD20+和DC-LAMP+的成熟樹(shù)突狀細(xì)胞可以用于識(shí)別具有高死亡風(fēng)險(xiǎn)的患者，使用這些生物學(xué)標(biāo)志物將有助于調(diào)整治療策略。在部分NSCLC患者中，TIB能將內(nèi)源性腫瘤抗原遞呈給CD4+TILs并改變其表型，對(duì)TIB應(yīng)答的CD4+TILs分別為活化型、抗原相關(guān)型和無(wú)應(yīng)答型，在活化型和抗原相關(guān)型的CD4+TILs亞群中，活化的TIB與效應(yīng)T細(xì)胞應(yīng)答相關(guān)[13]。目前除抗CD20+B細(xì)胞單抗外，B細(xì)胞治療還處于臨床前研究階段，未來(lái)仍需要開(kāi)發(fā)能有效誘導(dǎo)B細(xì)胞放大其他免疫細(xì)胞抗腫瘤效應(yīng)的方法。

此外，TIB也被證實(shí)具有促進(jìn)腫瘤發(fā)展的功能。TIB可抑制抗腫瘤免疫反應(yīng)，而TME促使TIB功能障礙。調(diào)節(jié)性B細(xì)胞(regulatory B cells, Bregs)通過(guò)分泌IL-35和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(transforming growth factor-β, TGF-β)抑制免疫應(yīng)答[15]。在自身免疫和自體移植排斥反應(yīng)中，從TLS中去除B細(xì)胞會(huì)導(dǎo)致T細(xì)胞功能下降，而B(niǎo)細(xì)胞(尤其是Bregs)可使群體向Tregs表型傾斜[16]。上述研究顯示，TIB與CD4+TILs在NSCLC TME中的相互作用，有可能成為未來(lái)NSCLC免疫治療的潛在靶點(diǎn)。

3 樹(shù)突狀細(xì)胞(dendritic cell, DC)

DC是髓系來(lái)源的抗腫瘤免疫的中樞調(diào)節(jié)因子，也是功能最強(qiáng)的局部抗原提呈細(xì)胞(antigen presenting cell, APC)。免疫檢查點(diǎn)分子B7-H3是NSCLC患者生存較差的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子，而在NSCLC患者中，B7-H3在腫瘤組織駐留DC中的表達(dá)明顯上調(diào)[17]。細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(cytokine-induced killer cells, CIK)聯(lián)合樹(shù)突狀細(xì)胞(DC-CIK)可誘導(dǎo)Lewis肺癌細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與14-3-3ζ和p-Bad蛋白的下調(diào)有關(guān)，證明DC-CIK在NSCLC的聯(lián)合治療中有可能成為一種有希望的佐劑[18]。此外，Lee等[19]發(fā)現(xiàn)用自體DC介導(dǎo)表達(dá)CCL21基因的腺病毒載體(Ad-CCL21-DC)進(jìn)行瘤內(nèi)注射可引起全身特異性免疫應(yīng)答，導(dǎo)致CD8+T細(xì)胞浸潤(rùn)增加以及腫瘤內(nèi)PD-L1表達(dá)增加。Lu等[20]研究發(fā)現(xiàn)，NSCLC細(xì)胞下調(diào)共刺激分子(CD80和CD86)和促炎細(xì)胞因子(IL-12和IL-23)的表達(dá)，但促進(jìn)CD1c+DC亞型分泌抗炎細(xì)胞因子(IL-10)，從而阻斷體內(nèi)抗腫瘤免疫。上述研究為未來(lái)將免疫治療與原位疫苗接種相結(jié)合提供了理論依據(jù)，評(píng)估PD-1/PD-L1檢查點(diǎn)抑制聯(lián)合DC-CCL21的治療作用仍有待研究。

4 髓源性抑制細(xì)胞(myeloid-derived suppressor cells, MDSCs)

MDSCs是廣泛存在于腫瘤患者的外周血及腫瘤組織骨髓來(lái)源的具有強(qiáng)免疫抑制功能的細(xì)胞群，其數(shù)量和比例與腫瘤大小、惡性程度有關(guān)。MDSCs可以通過(guò)表達(dá)高水平的精氨酸酶、一氧化氮合酶和活性氧抑制T細(xì)胞介導(dǎo)的特異性抗腫瘤免疫及NK細(xì)胞和巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的非特異性抗腫瘤免疫[21]。目前，MDSCs可分為粒細(xì)胞型(PMN-MDSCs)和單核細(xì)胞型(M-MDSCs)。PMN-MDSCs具有許多中性粒細(xì)胞的形態(tài)和表型特征，但M-MDSCs更接近未成熟的單核細(xì)胞。在小鼠和人類腫瘤中，主要為表型與中性粒細(xì)胞相似的PMN-MDSCs[22]。臨床資料分析顯示，NSCLC患者外周血M-MDSCs中C-C趨化因子受體5型(C-C chemokine receptor 5, CCR5)的表達(dá)明顯高于健康者，且無(wú)復(fù)發(fā)生存率與PMN-MDSCs和CCR5+M-MDSCs在血液循環(huán)中的比例呈負(fù)相關(guān)，與其在腫瘤細(xì)胞中的比例無(wú)關(guān)[23]。Condamine等[24]研究發(fā)現(xiàn)中性粒細(xì)胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)可引起血凝素樣氧化低密度脂蛋白受體(lectin-type oxidized LDL receptor-1, LOX-1)顯著上調(diào)，使中性粒細(xì)胞轉(zhuǎn)化為PMN-MDSCs?，F(xiàn)有數(shù)據(jù)顯示,在NSCLC患者中LOX-1+PMN-MDSCs的數(shù)量與腫瘤大小相關(guān)，但仍需深入研究來(lái)評(píng)估這些細(xì)胞作為NSCLC治療預(yù)后生物標(biāo)志物的潛力。

5 腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(tumor-associated macrophages, TAMs)

進(jìn)入腫瘤組織的巨噬細(xì)胞在腫瘤及其微環(huán)境來(lái)源的抑制性細(xì)胞因子的作用下分化成熟為T(mén)AMs，在促進(jìn)腫瘤血管生成和淋巴管生成過(guò)程中具有重要意義。TAMs可分化為不同的表型，包括M1型(經(jīng)典型巨噬細(xì)胞)和M2型(替代性活化巨噬細(xì)胞)。目前認(rèn)為T(mén)AMs共同表達(dá)M1和M2標(biāo)記，其與M2型巨噬細(xì)胞的表型特征和功能特點(diǎn)更為相似[25]。IL-4可以誘導(dǎo)TME中的巨噬細(xì)胞M2極化，參與降解ECM并重塑TME[26]。肺癌細(xì)胞也能促進(jìn)TAMs的M2極化，TAMs分泌的TGF-β激活了肺癌細(xì)胞的C-Jun和Smad3通路，增加了肺癌細(xì)胞SOX9基因的表達(dá)，促進(jìn)了肺癌細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)換，從而促進(jìn)腫瘤的增殖、遷移和侵襲[27]。Sumitomo等[28]研究發(fā)現(xiàn)，肺鱗狀細(xì)胞癌間質(zhì)中的M2 TAMs密度顯著高于肺腺癌，且NSCLC間質(zhì)中的M2 TAMs密度與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理分期、低DFS和OS變短有關(guān)。因此，腫瘤間質(zhì)M2 TAMs密度是預(yù)測(cè)腫瘤惡性程度和臨床預(yù)后的潛在指標(biāo)。

6 中性粒細(xì)胞

在細(xì)胞水平上，中性粒細(xì)胞是NSCLC中數(shù)量最多的免疫細(xì)胞類型，約占免疫細(xì)胞總數(shù)的20%[29]。有研究發(fā)現(xiàn)早期肺癌可以誘導(dǎo)具有APC特征的腫瘤相關(guān)中性粒細(xì)胞(tumor-associated neutrophils, TANs)亞群形成，這種獨(dú)特的細(xì)胞亞群能夠交叉呈遞抗原，并增強(qiáng)抗腫瘤T細(xì)胞的功能[30]。TANs還可通過(guò)合成、分泌相關(guān)蛋白酶參與腫瘤的增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移。Mcloed等[31]發(fā)現(xiàn)中性粒細(xì)胞可通過(guò)表達(dá)IL-1β介導(dǎo)對(duì)NF-κB抑制劑的抵抗從而促進(jìn)肺癌的發(fā)生，這也是NF-κB抑制劑對(duì)肺癌治療無(wú)效的重要原因之一。

與上述促瘤效應(yīng)相反，中性粒細(xì)胞也有抗腫瘤及抗轉(zhuǎn)移作用。TANs抑制腫瘤細(xì)胞增殖最主要的途徑是通過(guò)抗體依賴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用減少腫瘤增殖，抗體可以通過(guò)TANs表面的Fc受體來(lái)識(shí)別腫瘤，從而釋放細(xì)胞毒介質(zhì)，產(chǎn)生細(xì)胞毒作用，殺傷腫瘤細(xì)胞，TANs還可以直接產(chǎn)生細(xì)胞毒作用介質(zhì)，如ROS、髓過(guò)氧化物酶等，它們可以殺傷腫瘤細(xì)胞，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖[32]。已有研究證實(shí)干擾素-β(interferon-β, IFN-β)可抑制腫瘤浸潤(rùn)中性粒細(xì)胞中血管生成因子(如VEGF和MMP-9)的表達(dá)，導(dǎo)致缺乏IFN-β的動(dòng)物體內(nèi)腫瘤的血管化和生長(zhǎng)加快[33]。由于目前在肺癌中多數(shù)關(guān)于中性粒細(xì)胞作用的研究均基于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，肺癌患者TANs表型和功能的數(shù)據(jù)有限，對(duì)TANs在肺癌中的作用仍需深入探究。

7 自然殺傷(natural killer, NK)細(xì)胞

NK細(xì)胞是早期抗腫瘤的重要免疫細(xì)胞，是抗腫瘤的第一道防線。NK細(xì)胞表面表達(dá)的免疫抑制性受體和表面活化受體控制著NK細(xì)胞的活化以及對(duì)靶細(xì)胞的殺傷。有研究發(fā)現(xiàn)NK細(xì)胞的存在并不影響NSCLC患者的臨床療效，可能因?yàn)門(mén)ME能局部重塑瘤內(nèi)NK細(xì)胞的表型，導(dǎo)致激活受體的表達(dá)減少，而CTLA4等抑制性受體的表達(dá)增加[34]。NK細(xì)胞表面可以表達(dá)一些免疫抑制分子，如PD-1、LAG-3、TIM-3等[35]。有研究表明肺TME可能誘導(dǎo)抑制NK細(xì)胞，且CD8+T細(xì)胞浸潤(rùn)與NK細(xì)胞中CTLA4表達(dá)呈正相關(guān)，提示免疫活性腫瘤中也存在抑制性NK細(xì)胞[34]。盡管目前腫瘤免疫治療已取得較大的進(jìn)展，但仍有相當(dāng)比例的患者未能從這些治療中獲益，部分原因是缺乏腫瘤特異性NK細(xì)胞反應(yīng)。因此，結(jié)合其他療法重新激活NK細(xì)胞的方法將可能有利于肺癌患者的治療及預(yù)后。

8 TME細(xì)胞分類的臨床實(shí)踐方法

關(guān)于NSCLC中TME細(xì)胞分類的臨床應(yīng)用，目前主要有流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry, FCM)、免疫組織化學(xué)(immunohistochemistry, IHC)、酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)、Western blot法以及高通量測(cè)序(next generation sequencing, NGS)等。FCM可用于檢測(cè)NSCLC組織及癌旁組織中Tregs、TILs、MDSCs、TAMs等免疫細(xì)胞比率[6,15]，對(duì)癌旁組織中的淋巴細(xì)胞進(jìn)行全面的TILs定量[13]。Osinska等[36]使用FCM檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid, BALF)中Tregs含量顯著高于外周血，且肺腺癌患者BALF中的Tregs比例高于肺鱗狀細(xì)胞癌患者，闡述BALF并分析其在肺癌免疫反應(yīng)評(píng)價(jià)中的作用，檢測(cè)TME中的Tregs可能對(duì)抗癌免疫治療有一定的意義。除FCM外，IHC法檢測(cè)腫瘤細(xì)胞和浸潤(rùn)性免疫細(xì)胞中PD-L1的表達(dá)已成為篩選NSCLC免疫治療優(yōu)勢(shì)人群的相關(guān)靶標(biāo)[19]。ELISA法則可用于分析抗體特異性[14]，陳志等[37]采用ELISA法檢測(cè)NSCLC患者及健康人血清中7種自身抗體(p53、PGP9.5、SOX2、GAGE7、GBU4-5、MAGAEA1、CAGE)的水平，證實(shí)聯(lián)合檢測(cè)自身抗體陽(yáng)性率與NSCLC相關(guān)，是肺癌篩查和診斷的有效輔助手段。Western blot法可用于獲得特定蛋白質(zhì)在所分析的細(xì)胞或組織中表達(dá)情況的信息，Hou等[18]用該方法證明DC-CIK減少腫瘤細(xì)胞中14-3-3ζ和p-Bad蛋白的表達(dá)，這可能是DC-CIK誘導(dǎo)Lewis肺癌細(xì)胞凋亡的機(jī)制之一。Ganesan等[6]采用RNA測(cè)序(RNA-Seq)技術(shù)對(duì)未經(jīng)治療的早期NSCLC患者腫瘤樣本中的純化CD8+TILs進(jìn)行分析，證明腫瘤中組織駐留記憶T細(xì)胞密度越高，肺癌患者的預(yù)后越好，且這種影響與細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞密度無(wú)關(guān)。通過(guò)基于FCM、IHC等技術(shù)分析并結(jié)合全面的基因表達(dá)譜，進(jìn)一步了解免疫治療獲益者的免疫圖譜，將有可能闡明抗腫瘤的免疫機(jī)制，從而為免疫檢查點(diǎn)抑制劑的使用提供更加有利的信息。

傳統(tǒng)方法中僅針對(duì)腫瘤實(shí)質(zhì)細(xì)胞的治療已不能滿足醫(yī)學(xué)發(fā)展的需要，對(duì)肺癌TME的研究以及針對(duì)微環(huán)境藥物的開(kāi)發(fā)開(kāi)啟了腫瘤治療的新時(shí)代。免疫療法有可能成為晚期NSCLC患者新的治療手段，未來(lái)需要更深入闡明宿主與腫瘤免疫之間的相互作用和腫瘤免疫逃逸機(jī)制，這是腫瘤免疫治療領(lǐng)域的新挑戰(zhàn)。