SEMA3A、SEMA3B蛋白免疫組化染色中抗原修復(fù)方法的優(yōu)化

閆紅娟，馬曉平，李 曼，張 楠，郁曉丹，徐 江

信號(hào)素3A(SEMA3A)是信號(hào)蛋白家族成員中第一個(gè)被研究的潛在腫瘤抑制因子，其被認(rèn)為是一個(gè)候選的抑癌基因。近期研究表明，SEMA3A在不同類型腫瘤，如黏液表皮樣癌[1]、舌鱗狀細(xì)胞癌[2]、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌[3]、胃癌[4]、前列腺癌[5]等中均呈低表達(dá)。SEMA3B是信號(hào)蛋白家族成員，具有抑制腫瘤細(xì)胞的功能，是一個(gè)位于染色體3p21.3區(qū)域的抑癌基因。SEMA3B在黏液表皮樣癌[1]、食管鱗狀細(xì)胞癌[6]、胃癌[7]等多種惡性腫瘤中均呈不同程度的表達(dá)缺失和下調(diào)。故采用免疫組化法檢測(cè)SEMA3A和SEMA3B蛋白的表達(dá)具有重要意義?？乖迯?fù)技術(shù)是影響免疫組化染色的重要因素[8]，不同抗原修復(fù)法會(huì)直接影響SEMA3A和SEMA3B的免疫組化染色質(zhì)量。選擇合適的抗原修復(fù)方法是免疫組化成功與否的關(guān)鍵，尤其是關(guān)于抗原修復(fù)方法和修復(fù)液的選擇，目前，高壓修復(fù)和微波修復(fù)是兩種最常見(jiàn)的熱修復(fù)方法，枸櫞酸緩沖液和EDTA緩沖液是最兩種常使用的修復(fù)液。免疫組化染色顯示SEMA3A和SEMA3B表達(dá)主要定位于細(xì)胞質(zhì)。為了更好的展示細(xì)胞質(zhì)抗原免疫組化染色效果，本實(shí)驗(yàn)選擇了不同的熱修復(fù)方法和修復(fù)液，對(duì)上述細(xì)胞質(zhì)蛋白進(jìn)行免疫組化檢測(cè)，尋找最佳的修復(fù)方法，以提高細(xì)胞質(zhì)抗原染色的準(zhǔn)確性和可靠性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑收集2015～2020年石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院手術(shù)切除的口腔鱗狀細(xì)胞癌癌旁正常組織標(biāo)本40例，所有病例病理診斷明確。Olympus BX51圖像分析儀；2.5 L高壓鍋；美的家用微波爐；SEMA3A抗體(1 ∶200，Abcam公司，Cambridge，UK)、SEMA3B抗體(1 ∶500，Abcam公司，Cambridge，UK)；EnVision檢測(cè)試劑盒(Dako公司)；DAB顯色試劑盒(Dako公司)；枸櫞酸緩沖液(pH 6.0)和EDTA緩沖液(pH 9.0)為本實(shí)驗(yàn)室所配制。

1.2 方法將蠟塊組織連續(xù)切片，切片插入切片架內(nèi)置于65 ℃的電熱恒溫干燥箱中烘烤2 h以上，防止掉片。按照免疫組化EnVision法染色步驟操作。將脫臘至水的切片在同一實(shí)驗(yàn)條件下、同一時(shí)間內(nèi)進(jìn)行抗原修復(fù)，根據(jù)抗原修復(fù)條件不同，分為高壓-EDTA緩沖液修復(fù)組、高壓-枸櫞酸緩沖液修復(fù)組、微波-EDTA緩沖液修復(fù)組、微波-枸櫞酸緩沖液修復(fù)組。

抗原修復(fù)：使用熱修復(fù)方法，修復(fù)液使用EDTA緩沖液或枸櫞酸緩沖液。高壓修復(fù)：將修復(fù)盒內(nèi)的EDTA緩沖液(或枸櫞酸緩沖液)及高壓鍋中的水分別加熱至沸騰，隨后將切片依次插入修復(fù)盒內(nèi)的切片架上，修復(fù)盒放入高壓鍋的置物架上，高壓鍋加蓋，電磁爐1 800 W加熱至噴氣，調(diào)至800 W計(jì)時(shí)8 min后關(guān)閉電源，放氣并取出修復(fù)盒，修復(fù)盒置于室溫下自然冷卻至30 ℃～40 ℃；微波修復(fù)：將修復(fù)盒內(nèi)的EDTA緩沖液(或枸櫞酸緩沖液)置于微波爐中高火煮至沸騰，將切片依次插入修復(fù)盒內(nèi)的切片架內(nèi)，修復(fù)盒放入微波爐中低火加熱30 min，取出修復(fù)盒，修復(fù)盒置于室溫下自然冷卻至30 ℃～40 ℃。

切片浸入新鮮配制的3%雙氧水中，室溫下孵育10 min，蒸餾水沖洗3次，PBS震洗3次，每次5 min，各組切片分別滴加100 μL最佳工作濃度的一抗，濕盒置于4 ℃冰箱中孵育過(guò)夜，室溫下復(fù)溫，PBS震洗，每張切片上滴加100 μL二抗后，37 ℃恒溫箱中孵育30 min，PBS震洗，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，自來(lái)水藍(lán)化，透明，封固。PBS緩沖液代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.3 結(jié)果判定SEMA3A、SEMA3B主要定位于細(xì)胞質(zhì)，呈黃色或棕黃色為陽(yáng)性。SEMA3A、SEMA3B染色參照標(biāo)準(zhǔn)[1]：光鏡下觀察陽(yáng)性細(xì)胞百分比和染色強(qiáng)度。(1)按陽(yáng)性細(xì)胞占所觀察細(xì)胞的百分比計(jì)分：陽(yáng)性細(xì)胞百分比≤5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，>50%為3分。(2)按陽(yáng)性細(xì)胞染色強(qiáng)度計(jì)分：未著色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。每個(gè)標(biāo)本最終的陽(yáng)性或陰性結(jié)果由兩種計(jì)分方法的乘積來(lái)判定：≤3為陰性，>3為陽(yáng)性。

2 結(jié)果

2.1 不同抗原修復(fù)方法對(duì)口腔鱗狀細(xì)胞癌癌旁正常組織中SEMA3A染色的影響SEMA3A蛋白以口腔鱗狀細(xì)胞癌癌旁正常組織細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒為陽(yáng)性細(xì)胞。使用不同抗原修復(fù)方法及修復(fù)液修復(fù)后，高壓修復(fù)的免疫組化染色陽(yáng)性強(qiáng)度高于微波修復(fù)法。高壓-EDTA緩沖液修復(fù)組陽(yáng)性強(qiáng)度最強(qiáng)，細(xì)胞質(zhì)明顯著色，定位準(zhǔn)確，表達(dá)效果最理想(圖1A)。高壓-枸櫞酸緩沖液修復(fù)組、微波-EDTA緩沖液修復(fù)組陽(yáng)性強(qiáng)度下降(圖1B、C)。微波-枸櫞酸緩沖液修復(fù)組陽(yáng)性強(qiáng)度最弱，效果不理想(圖1D)。

圖1 SEMA3A抗體：A.高壓-EDTA緩沖液修復(fù)組；B.高壓-枸櫞酸緩沖液修復(fù)組；C.微波-EDTA緩沖液修復(fù)組；D.微波-枸櫞酸緩沖液修復(fù)組 圖2 SEMA3B抗體：A.高壓-EDTA緩沖液修復(fù)組；B.高壓-枸櫞酸緩沖液修復(fù)組；C.微波-EDTA緩沖液修復(fù)組；D.微波-枸櫞酸緩沖液修復(fù)組

2.2 不同抗原修復(fù)方法對(duì)口腔鱗狀細(xì)胞癌癌旁正常組織中SEMA3B染色的影響SEMA3B蛋白以口腔鱗狀細(xì)胞癌癌旁正常組織細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒為陽(yáng)性細(xì)胞。使用不同抗原修復(fù)方法及修復(fù)液修復(fù)后，高壓-EDTA緩沖液修復(fù)組染色均勻，背景清晰，對(duì)比明顯，染色效果最理想(圖2A)。高壓-枸櫞酸緩沖液修復(fù)組陽(yáng)性強(qiáng)度提高，但出現(xiàn)背景著色，染色效果欠佳(圖2B)；微波-EDTA緩沖液修復(fù)組陽(yáng)性強(qiáng)度明顯提高，但普遍出現(xiàn)背景著色且背景染色深(圖2C)。微波-枸櫞酸緩沖液修復(fù)組背景染色深，出現(xiàn)假陽(yáng)性，效果不理想(圖2D)。

3 討論

免疫組化技術(shù)是對(duì)組織切片或細(xì)胞標(biāo)本中的某些化學(xué)成分進(jìn)行原位定性、定位或半定量研究[9]。石蠟包埋組織經(jīng)甲醛固定，組織中蛋白質(zhì)的氨基與固定液中的醛基交聯(lián)，導(dǎo)致部分蛋白抗原簇被封閉，從而在一定程度上影響組織染色效果[10]。通過(guò)抗原修復(fù)可以使抗原決定簇重新暴露并與抗體有效結(jié)合，因此抗原修復(fù)是影響組織染色效果的最關(guān)鍵因素。不同修復(fù)方式均有各自的優(yōu)點(diǎn)和局限性，應(yīng)當(dāng)依據(jù)抗原特性選擇合適的修復(fù)方法，以取得最佳修復(fù)效果。本實(shí)驗(yàn)選用不同的抗原修復(fù)方式和抗原修復(fù)液，檢測(cè)SEMA3A和SEMA3B蛋白的表達(dá)，其中SEMA3A蛋白經(jīng)高壓修復(fù)的免疫組化染色陽(yáng)性強(qiáng)度高于微波修復(fù)。高壓-EDTA緩沖液修復(fù)組陽(yáng)性強(qiáng)度最強(qiáng)，細(xì)胞質(zhì)明顯著色，定位準(zhǔn)確，表達(dá)效果最理想。SEMA3B蛋白經(jīng)高壓-EDTA緩沖液修復(fù)組染色均勻，背景清晰，對(duì)比明顯，表達(dá)效果最理想。因此，用高壓-EDTA緩沖液作為SEMA3A和SEMA3B抗原修復(fù)方法能夠取得較理想的染色效果，值得推廣。

臨床上關(guān)于抗原修復(fù)方式的報(bào)道較多，常見(jiàn)的有微波、高壓、電爐加熱、酶消化等[11]。高壓和微波修復(fù)法是目前應(yīng)用最廣泛的組織抗原修復(fù)法，效果較為肯定[9,12]。高溫高壓熱修復(fù)法是最有效、最穩(wěn)定的抗原修復(fù)方法[13-14]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)組織進(jìn)行高壓及微波處理的對(duì)照實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，高溫高壓抗原修復(fù)法的修復(fù)效果明顯優(yōu)于微波抗原修復(fù)法；與李紹剛等[15]和袁士成等[16]的研究結(jié)果一致。由于微波熱修復(fù)過(guò)程中的微波焦點(diǎn)范圍小，組織切片接收到的微波輻射量少且不均勻，并且不同區(qū)域的組織處理強(qiáng)度不一致，導(dǎo)致不同區(qū)域染色深淺不同，邊緣效應(yīng)比較明顯。高壓熱修復(fù)法熱效率高且均勻；暴露抗原決定簇效果優(yōu)于微波修復(fù)，這使得弱陽(yáng)性、假陰性的組織獲得更可靠、更準(zhǔn)確地表達(dá)，組織陽(yáng)性定位準(zhǔn)確，染色均勻，特異性強(qiáng)，結(jié)果穩(wěn)定，背景著色較弱，可以提高抗原抗體陽(yáng)性檢測(cè)率，操作簡(jiǎn)便，節(jié)省時(shí)間，陽(yáng)性率較微波抗原修復(fù)法高。但高壓法的缺點(diǎn)是容易脫片或使組織出現(xiàn)大小不等的缺損。

目前，常用的抗原修復(fù)液有EDTA修復(fù)液和枸櫞酸修復(fù)液。本實(shí)驗(yàn)中分別采用枸櫞酸緩沖液和EDTA緩沖液處理組織切片。結(jié)果表明，高pH值的EDTA緩沖液修復(fù)的切片免疫化學(xué)染色效果明顯優(yōu)于枸櫞酸緩沖液。這或許是因?yàn)镋DTA緩沖液是一種螯合劑，能夠消除由福爾馬林固定引起的不利因素。崔錦珠[17]和廖德貴等[18]分別報(bào)道高pH值的EDTA緩沖液的效果優(yōu)于檸檬酸鹽緩沖液。Shi等[19]報(bào)道了在不同pH值下抗原修復(fù)對(duì)免疫組化染色結(jié)果的影響，他們認(rèn)為在高pH值下的高溫高壓抗原修復(fù)對(duì)于大部分的胞質(zhì)抗體均能取得良好的效果。因此，高pH值下的高壓修復(fù)法，具有操作時(shí)間短、抗原修復(fù)好且結(jié)果穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，目前普遍應(yīng)用于大多數(shù)細(xì)胞質(zhì)抗原的修復(fù)中[20]。高溫高壓EDTA緩沖液抗原修復(fù)法可使多數(shù)胞質(zhì)抗體達(dá)到理想的染色結(jié)果，是一種值得推廣使用的免疫組化抗原修復(fù)法。

本實(shí)驗(yàn)僅在口腔鱗狀細(xì)胞癌癌旁正常石蠟組織標(biāo)本中，對(duì)SEMA3A和SEMA3B細(xì)胞質(zhì)蛋白通過(guò)不同的抗原修復(fù)方式及修復(fù)液，進(jìn)行修復(fù)實(shí)驗(yàn)且比較免疫組化染色結(jié)果，而對(duì)于其他細(xì)胞質(zhì)蛋白是否也存在與本實(shí)驗(yàn)相同的結(jié)論，尚有待進(jìn)一步驗(yàn)證。