傳統(tǒng)發(fā)酵食品中具有抑菌活性乳酸菌篩選及其 代謝產(chǎn)物穩(wěn)定性分析

黃曉英，李啟明，吳華星，劉絨梅，曹珺，萬倩，于基成，唐俊妮*

（1.西南民族大學食品科學與技術(shù)學院，西南民族大學青藏高原動物遺傳資源保護與利用教育部重點實驗室，四川成都 610041）（2.乳品營養(yǎng)與功能四川省重點實驗室，新希望乳業(yè)股份有限公司，四川省優(yōu)質(zhì)乳品制備與質(zhì)量控制技術(shù)工程實驗室，四川成都 610023）（3.大連民族大學生物技術(shù)與資源利用教育部重點實驗室，沈陽大連 116600）

傳統(tǒng)發(fā)酵食品中擁有大量的微生物類群，其中最主要的類群是乳酸菌[1]。乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）是一類無芽孢、厭氧或兼性需氧的革蘭氏陽性細菌，能利用可發(fā)酵碳水化合物產(chǎn)生大量乳酸的細菌，并且是屬于基因多樣性的細菌，包括桿狀細菌、球菌等[2]。研究發(fā)現(xiàn)，乳酸菌產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物有機酸、細菌素及其他抑菌物質(zhì)對腐敗菌和致病菌擁有較強的抑制作用，從而能夠防止食品腐敗變質(zhì)、延長食品的保質(zhì)期，可作為新型生物抑菌劑[3,4]。

隨著食品工業(yè)的發(fā)展，傳統(tǒng)的抑菌保鮮方式已經(jīng)不能滿足現(xiàn)代食品行業(yè)的需求，而乳酸菌作為生物抑菌劑的良好備選菌株，可代替化學食品添加劑[5]。張穎等[6]將篩選到的具有抗真菌活性的乳酸菌作為輔助發(fā)酵劑用于酸奶的生產(chǎn)中，發(fā)現(xiàn)該乳酸菌不僅能改善酸奶后酸化現(xiàn)象，還能延長酸奶貨架期。Axel等[7]將具有抗菌活性的乳酸菌與酵母同時發(fā)酵烘焙產(chǎn)品時，可以減少化學防腐劑的使用量，并延長烘焙產(chǎn)品的保質(zhì)期。同時，乳酸菌又具有良好的安全性，是公認的食品級安全微生物，在食品中的安全性和有效性得到反復(fù)驗證[8]。目前，文獻已報道將乳酸菌作為生物抑菌劑開始應(yīng)用于不同食品保鮮中，如肉制品保鮮[9]、水產(chǎn)品保鮮[10]、面制品保鮮[11]、果蔬保鮮[12]、豆制品保鮮[13]、乳制品保鮮[14]、鮮蛋保鮮[15]等。目前，對于乳酸菌的資源開發(fā)還有很大的空間，優(yōu)良的菌種資源仍然比較匱乏。因此，本研究擬從傳統(tǒng)發(fā)酵食品中篩選具有良好抑菌作用的乳酸菌，并進一步研究菌株代謝產(chǎn)物的穩(wěn)定性，為具有抑菌作用乳酸菌的開發(fā)和天然生物防腐劑的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

MRS肉湯培養(yǎng)基、LB液體培養(yǎng)基、LB瓊脂培養(yǎng)基購自青島海博生物技術(shù)有限公司；馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）自配；金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大腸桿菌（Escherichia coli）、沙門氏菌（Salmonella）、阪崎腸桿菌（Enterobacter sakazakii）、大腸桿菌O157:H7（Escherichia coliO157:H7）、蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）、單增李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）標準菌株由西南民族大學食品微生物實驗室保藏；釀酒酵母購自安琪酵母股份有限公司；青霉菌自行分離；胃蛋白酶（100 U/mg）、胰蛋白酶（250 USPu/mg）、木瓜蛋白酶（800 U/mg）購自上海源葉生物科技有限公司；氫氧化鈉分析純、氯化鈉分析純、濃鹽酸、乳酸購自成都科龍化工試劑廠；牛膽鹽購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SC-15數(shù)控超級恒溫槽，寧波新芝生物科技股份有限公司；318C+酶標儀，上海沛歐分析儀器有限公司；TGL-16K醫(yī)用離心機，湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；UV-6100分光光度計，上海美普達儀器有限公司；MLS-3020電熱自動滅菌鍋，日本SANYO公司；GHP-9080隔水式恒溫培養(yǎng)箱，上海齊欣科學儀器有限公司；HZQ-F160恒溫振蕩培養(yǎng)箱，江蘇省太倉市實驗設(shè)備廠。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌株來源

由新希望乳業(yè)股份有限公司從全國不同地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵食品中分離鑒定的39株乳酸菌作為本實驗的試驗菌株。包括植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）10株、德氏乳桿菌（Lactobacillus delbrueckii）13株、乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）6株、嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）9株，乳明串珠菌（Leuconostoc lactis）1株，具體菌株來源見表1。

1.3.2 優(yōu)良抑菌活性乳酸菌篩選

指示菌懸液的制備[16]：將指示菌金黃色葡萄球菌ATCC43300、大腸桿菌ATCC25922、沙門氏菌H9812接種到LB液體培養(yǎng)基中，在37 ℃下震蕩培養(yǎng)24 h，用分光光度計調(diào)節(jié)菌濃度至0.5 MCF（OD625nm=0.08～0.13），配制菌懸液備用。

表1 菌株的來源信息Table 1 Source information of the strain

發(fā)酵上清液的制備[17]：將分離鑒定過的39株乳酸菌以2%的接種量接種到MRS液體培養(yǎng)基中，活化兩代，取第三代發(fā)酵培養(yǎng)液，8000 r/min離心10 min，收集上清液，經(jīng)0.22 μm的細菌過濾器過濾，即為乳酸菌的無細胞上清液（cellfree supernatant，CFS）。

采用牛津杯瓊脂擴散法[18]進行篩選，以金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌為指示菌，測定抑菌圈直徑大小，平行測定三次取平均值。

1.3.3 乳酸菌生長特性試驗

1.3.3.1 生長曲線和產(chǎn)酸曲線的測定[19]

取活化兩次的乳酸菌按2%的接種量接種于50 mL MRS肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)，分別在0、2、4、6、8、10、12、16、20、24、36、48 h處取適量測定發(fā)酵液的吸光值（OD600nm）以及其pH值，平行測定三次取平均值，繪制生長曲線圖以及產(chǎn)酸曲線圖。

1.3.3.2 乳酸菌耐膽鹽性測定[20]

取活化兩次的乳酸菌按2%的接種量接種于含有0%、0.03%、0.1%、0.2%、0.3%的牛膽鹽的MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)24 h后測定發(fā)酵液的吸光值（OD630nm），平行測定三次取平均值。

1.3.3.3 乳酸菌耐滲透壓性測定[21]

取活化兩次的乳酸菌按2%的接種量接種于含有0%、2%、4%、6%、8%、10%、12%、14%的氯化鈉的MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)24 h后測定發(fā)酵液的吸光值（OD630nm），平行測定三次取平均值。 1.3.3.4 乳酸菌耐酸堿性測定[22]

調(diào)節(jié)MRS液體培養(yǎng)基的pH至2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，按2%接種量接種活化兩次的乳酸菌，37 ℃振蕩培養(yǎng)24 h后測定發(fā)酵液的吸光值（OD630nm），平行測定三次取平均值。

1.3.4 抑菌譜測定[23]

指示菌：阪崎腸桿菌ATCC29544、大腸桿菌O157:H7、蠟樣芽孢桿菌ATCC11778、單增李斯特氏菌CCIC21633、釀酒酵母、青霉菌。將指示菌按1.3.2制成一定濃度的菌懸液，采用牛津杯瓊脂擴散法測定，細菌用LB瓊脂培養(yǎng)基平板，真菌用PDA瓊脂培養(yǎng)基平板，測定抑菌圈直徑大小，平行測定三次取平均值。

1.3.5 代謝產(chǎn)物穩(wěn)定性試驗

1.3.5.1 抑菌物質(zhì)對溫度敏感性試驗[24]

設(shè)立溫度梯度20 ℃、40 ℃、60 ℃、80 ℃、100 ℃、121 ℃，將乳酸菌的代謝產(chǎn)物分別在不同的溫度里處理15 min，以金黃色葡萄球菌為指示菌，按1.3.2測定抑菌圈直徑大小，平行測定三次取平均值。

1.3.5.2 抑菌物質(zhì)對pH敏感性試驗[25]

用1 mol/L的鹽酸和1 mol/L的氫氧化鈉調(diào)節(jié)發(fā)酵上清液的pH值至2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，保持2 h后再調(diào)回發(fā)酵上清液的初始pH值，以未調(diào)節(jié)過的發(fā)酵上清液為對照，金黃色葡萄球菌為指示菌，按1.3.2測定抑菌圈直徑大小，平行測定三次取平均值。

1.3.5.3 抑菌物質(zhì)對酶敏感性試驗[26]

將木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K、過氧化氫酶溶于PBS緩沖液中，得到一定濃度的蛋白酶母液。調(diào)節(jié)發(fā)酵上清液的pH至木瓜蛋白酶（pH 5.0～7.0）、胰蛋白酶（pH 7.8～8.5）、胃蛋白酶（pH 2.0～4.0）、蛋白酶K（pH 4.0～12.5）、過氧化氫酶（pH 5.0～8.0）反應(yīng)的最適pH，加入PBS蛋白酶母液使其最終濃度為1 mg/mL，在37 ℃恒溫水浴2 h進行酶反應(yīng)，再在100 ℃下加熱10 min進行滅酶處理，調(diào)節(jié)發(fā)酵上清液的pH至初始pH值，以未處理的發(fā)酵上清液作為對照，金黃色葡萄球菌為指示菌，按1.3.2測定抑菌圈直徑大小，平行測定三次取平均值。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS 21.0和Excel統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 具有抑菌活性的乳酸菌篩選結(jié)果

采用牛津杯瓊脂擴散法測定了39株乳酸菌對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌的抑菌效果，結(jié)果詳見表2。由表2可知，56.41%的實驗菌株對三種指示菌均有抑菌作用，64.10%的菌株對金黃色葡萄球菌有抑制作用，61.54%的菌株對大腸桿菌、沙門氏菌有抑制作用。綜合HS011、HS023、HS033對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌的平均抑菌直徑達到了14.83 mm、16.16 mm、15.00 mm，作為后續(xù)試驗的菌株，這三株乳酸菌對指示菌都具有較好的抑菌效果，三株乳酸菌分別為Lactobacillus plantarum MG5276、Lactobacillus delbrueckiisubsp.Bulgaricus strain NDO4、以及Streptococcus thermophilus 3233。

乳酸菌可產(chǎn)生具有抑菌活性的代謝產(chǎn)物，利用乳酸菌的代謝產(chǎn)物作為生物防腐劑，或者直接利用具有抑菌特性的乳酸菌作為生物保護菌運用于發(fā)酵制品和食品原料保鮮中，這已經(jīng)成為食品的熱點研究領(lǐng)域[27,28]。呂欣然等[29]從遼西傳統(tǒng)發(fā)酵食品中獲得一株對單增李斯特菌有較強拮抗活性的植物乳桿菌，劉彩琴等[30]從黃酒米漿水中篩選出36株對蠟樣芽孢桿菌和大腸桿菌具有抑菌作用的乳桿菌，吳詩敏等[31]從高山牧場的鮮牛奶中篩選到了對李斯特菌具有良好抑菌作用的乳酸乳球菌。本研究從傳統(tǒng)發(fā)酵食品中篩選了具有優(yōu)良抑菌特性的植物乳桿菌、德氏乳桿菌、嗜熱鏈球菌，與文獻報道中的結(jié)果相似，反映了傳統(tǒng)發(fā)酵食品是優(yōu)良乳酸菌菌株的重要來源。

表2 具有抑菌活性乳酸菌的篩選結(jié)果Table 2 Screening results oflactic acid bacteriawith antibacterial activity

2.2 三株乳酸菌的生長特性

2.2.1 生長曲線和產(chǎn)酸曲線的測定

菌株HS011、HS023、HS033的生長曲線與產(chǎn)酸曲線如圖1和圖2所示。

圖1 HS011、HS023、HS033的生長曲線Fig.1 Growth curve of HS011, HS023, HS033

圖2 HS011、HS023、HS033的產(chǎn)酸曲線Fig.2 Acid production curve of HS011, HS023, HS033

將試驗菌株按2%的接種量接種于MRS液體培養(yǎng)基中37 ℃振蕩培養(yǎng)48 h，每隔一段時間測定吸光度值（OD600nm）繪制生長曲線與產(chǎn)酸曲線。如圖1所示為HS011、HS023、HS033的生長曲線，0～2 h內(nèi)為延滯期，時間較短；2～8 h為對數(shù)生長期，這個期間三株乳酸菌的OD600nm的值分別由0.202、0.269、0.252左右增加到了1.293、1.341、1.333；8～36 h是穩(wěn)定期，36 h以后是衰亡期，HS023最先到達穩(wěn)定期，但三株菌到達穩(wěn)定期的時間都相差不大。由圖2所示為HS011、HS023、HS033的產(chǎn)酸曲線，主要是在對數(shù)生長期間產(chǎn)酸最多，2 h后的培養(yǎng)基pH開始下降，到20 h時產(chǎn)酸曲線趨于穩(wěn)定，三株菌發(fā)酵液的pH分別由5.44、5.44、5.42下降到3.55、3.54、3.57。綜上所述，HS023的生長性能和產(chǎn)酸性能相對較好。

2.2.2 三株乳酸菌的耐膽鹽性測定

菌株HS011、HS023、HS033的耐膽鹽曲線如圖3所示。

圖3 HS011、HS023、HS033的耐膽鹽曲線Fig.3 The tolerance curve to bile salt of HS011, HS023, HS033

將試驗菌株HS011、HS023、HS033分別接到牛膽鹽含量為0.03%、0.1%、0.2%、0.3%的MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h后測定其吸光度OD630nm值，如圖3所示，膽鹽含量在0.1%以下時對三種乳酸菌的生長影響較小，隨著膽鹽含量從0.03%增加到0.3%，三株菌的生物量分別由1.537、1.545、1.546降到了0.161、0.168、0.156。由圖可知，HS023的耐膽鹽能力比另外兩株乳酸菌好，但都耐0.10%以下的膽鹽。

小腸中膽汁濃度在0.03%～0.30%范圍內(nèi)波動[32]，優(yōu)良的乳酸菌應(yīng)具備一定的耐受能力，因為食品中添加的一些鹽、酸類物質(zhì)會對細菌的生長會造成一定的影響[33]。Dowarah等[34]從仔豬糞便中分離得到的30株乳酸菌中有20株對膽鹽有著良好的耐受性，Reuben等[35]從農(nóng)作物和肉雞腸道中分離的15株乳酸菌對0.3%的膽鹽具有良好耐受性。本實驗三株乳酸菌對小于0.1%的膽鹽具有一定的耐受性，對0.3%的膽鹽耐受性較差，其生長受到較大的抑制。

2.2.3 三株乳酸菌的耐滲透壓性測定

菌株HS011、HS023、HS033的耐滲透壓曲線如圖4所示。

圖4 HS011、HS023、HS033的耐滲透壓曲線Fig.4 The osmotic pressure curve of HS011, HS023, HS033

由圖4所示為HS011、HS023、HS033的耐滲透壓曲線，HS011的耐滲透壓曲線相對較穩(wěn)定，隨著NaCl的濃度增加，菌體濃度呈下降趨勢，從0%到14%下降了2.67%，該菌的耐滲透壓性較好；HS023和HS033的耐滲透壓曲線在NaCl含量為6.0%的時候菌體濃度最高，吸光度分別達到了1.563、1.581，其耐滲透壓性較好，隨著NaCl的含量增加，HS033的菌體濃度下降較為明顯，相比最高生物量時下降了7.53%，HS023的生物量則比較穩(wěn)定。

盡管微生物對外界環(huán)境有一定的耐滲透壓能力，但是鹽脅迫引起的滲透壓變化可導(dǎo)致細胞結(jié)構(gòu)受損，導(dǎo)致細胞生理和代謝紊亂甚至死亡[36]。趙山山等[37]從貴州不同家庭自制的泡菜中分離得到的11株乳酸菌，對含量8%以下的NaCl具有較好的耐受性。本試驗中嗜熱鏈球菌HS023有著顯著的滲透壓性，在8% NaCl含量以上時依然有著較好的生長活性。

2.2.4 三株乳酸菌的耐酸堿性測定

菌株HS011、HS023、HS033的耐酸堿曲線如圖5所示。

圖5 HS011、HS023、HS033的耐酸堿能力Fig.5 Acid and alkali resistance of HS011, HS023, HS033

乳酸菌在不同pH環(huán)境的生物量不同，如圖5所示，三株乳酸菌在5.0≤pH≤8.0時生長情況良好，其OD630nm值在1.422～1.611之間，在pH＜5.0和pH＞8.0時生長情況受到抑制，從牦牛酸奶中分離出的HS033比從泡椒水中分離的HS011能耐受更低的pH。Lee等[38]等發(fā)現(xiàn)從傳統(tǒng)發(fā)酵泡菜中篩選到的植物乳桿菌比其它來源分離得到的菌株對低pH具有更好的耐受性。Szutowska等[39]等從羽衣甘藍發(fā)酵汁中分離到的植物乳桿菌和短乳桿菌對低pH有著顯著的耐受性。本試驗中，從牦牛酸奶中分離得到的嗜熱鏈球菌HS033對低pH的耐受性最好，這與報道的結(jié)果一致。

2.3 三株乳酸菌的抑菌譜測定

通過牛津杯法抑菌試驗，探索篩選出的三株乳酸菌對其它4株致病菌以及霉菌和釀酒酵母的抑菌效果，結(jié)果如表3、圖6所示。

由表3可知，HS011對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、大腸桿菌O157:H7、蠟樣芽孢桿菌、單增李斯特菌的抑菌效果較好，對沙門氏菌、阪崎腸桿菌的抑菌效果相對弱一些，對大腸桿菌O157:H7的抑菌圈直徑達20.15 mm；HS023對阪崎腸桿菌、單增李斯特菌的抑菌效果不好，對其它有害菌均有較好的抑菌效果，對蠟樣芽孢桿菌的抑菌圈直徑達19.20 mm；HS033對大腸桿菌、大腸桿菌O157:H7、蠟樣芽孢桿菌的抑菌效果較好，對阪崎腸桿菌的抑菌效果相對最差，三株乳酸菌對真菌（霉菌和釀酒酵母）無抑制作用。

表3 三株乳酸菌發(fā)酵上清液對不同微生物的抑菌譜Table 3 Antibacterial spectrum of three lactic acid bacteriafermentation supernatants on different microorganisms

圖6 HS023對細菌的抑菌圈Fig.6 Inhibition zone of HS023 on different bacteria

不同的乳酸菌有不同的生物學特性，其產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)也不盡相同，對不同的有害菌抑菌效果也會不同[40]。王志新等[41]從傳統(tǒng)東北酸菜中篩選到的plantarum CNQ3菌株也具有廣譜抑菌活性；孫悅等[42]從腌制白菜中分離篩選出1株乳酸菌，對突變性大腸桿菌具有較強的拮抗活性；伍元值等[43]從斜帶石斑魚腸道中分離了乳酸乳球菌對大腸桿菌無抑制作用，但是對溶藻弧菌、副溶血弧菌、哈氏弧菌和嗜水氣單胞菌有較顯著的作用；楊吉霞等[44]從牦牛奶酪中分離的39株乳酸菌對9株致病菌（蠟樣芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌O157:H7、單增李斯特氏菌、費氏檸檬酸桿菌、鼠傷寒沙門氏菌、陰溝腸桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、宋內(nèi)志賀菌）均有著良好的抑菌作用。本試驗中，三株乳酸菌產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)具有廣譜抑菌活性，但抑菌譜有一定差異，對指示陽性菌的抑菌效果大于指示陰性菌，對霉菌和酵母無抑菌效果。

2.4 三株乳酸菌代謝產(chǎn)物穩(wěn)定性試驗

2.4.1 代謝產(chǎn)物對溫度的敏感性試驗

菌株HS011、HS023、HS033的發(fā)酵上清液經(jīng)過20 ℃、40 ℃、60 ℃、80 ℃、100 ℃、121 ℃不同溫度處理后金黃色葡萄球菌菌的抑菌效果如圖7所示。

圖7 溫度對菌株發(fā)酵液中抑菌物質(zhì)抑菌活性的影響Fig.7 The influence of temperature on the antibacterial activity of antibacterial substances in the fermentation broth

由圖7可知，在常溫20 ℃條件下三株菌的抑菌活性大小分別是HS023＞HS011＞HS033，經(jīng)過不同溫度處理后三株菌對指示菌的抑菌效果略有變化，HS011、HS023的代謝產(chǎn)物抑菌活性對溫度較為穩(wěn)定，HS033的代謝產(chǎn)物在40 ℃時具有最強抑菌活性，其它溫度梯度內(nèi)則較為穩(wěn)定。HS023的代謝產(chǎn)物抑菌活性高，并且熱穩(wěn)定性好，可用于高溫加熱處理的食品中。

乳酸菌產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)具有較好的熱穩(wěn)定性，郭穎等[45]從內(nèi)蒙古傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中分離篩選的1株具有抑菌活性的乳酸菌產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)經(jīng)過100 ℃處理后仍然有較好的抑菌活性，張君超等[46]從廣西巴馬村天然發(fā)酵米粉中分離的一株植物乳桿菌產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)經(jīng)過121 ℃處理15 min后仍具有抑菌活性。本研究中經(jīng)過各種溫度處理后，乳酸菌代謝產(chǎn)物依然有較好的熱穩(wěn)定性，這與以上報道結(jié)果一致。

2.4.2 代謝產(chǎn)物對pH的敏感性試驗

菌株HS011、HS023、HS033的發(fā)酵上清液的初始pH為3.6左右（對照組），具有較好的抑菌活性。通過對發(fā)酵上清液進行不同pH處理后，對金黃色葡萄球菌的抑菌效果如圖8所示。

圖8 pH對菌株發(fā)酵液中抑菌物質(zhì)抑菌活性的影響Fig.8 The effect of pH on the antibacterial activity of antibacterial substances in the fermentation broth

表4 不同pH處理下發(fā)酵上清液抑菌活性的變化Table 4 Changes of antibacterial activity of fermentation supernatant under different pH treatments

由圖8可知，未經(jīng)pH處理的發(fā)酵上清液，HS023對金黃色葡萄球菌的抑菌效果最好，其抑菌圈直徑達16.50 mm，經(jīng)過不同pH處理后抑菌活性均有變化，如表4所示，HS023的發(fā)酵上清液對pH最敏感，經(jīng)過pH處理過后抑菌活性變化較大，在pH 3.0的時候變化最小，說明HS023代謝產(chǎn)物中的抑菌物質(zhì)可能是有機酸類，在pH 3.0的時候具有最大抑菌活性；HS011的發(fā)酵上清液在pH 5.0的時候抑菌活性變化最小，HS033分別在pH 3.0的時候抑菌活性變化最小，且比對照組的抑菌活性高。HS033的代謝產(chǎn)物對pH的耐受性最好，可能是抑菌類有機酸在抑菌物質(zhì)中含量較少。

據(jù)報道，乳酸菌產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)有蛋白質(zhì)多肽類物質(zhì)、有機酸類、雙乙酰、過氧化氫等[47]。路春波等[48]通過GC-MS代謝組學方法分析乳酸菌發(fā)酵上清液代謝物，發(fā)現(xiàn)對指示菌有抑菌作用主要成分是有機酸，其代謝產(chǎn)物在pH＞5.0時無抑菌效果，李衛(wèi)娜等[49]利用高效液相色譜分析乳酸菌發(fā)酵液中的主要有機酸成分是乙酸，對大腸桿菌O157:H7，金黃色葡萄球菌和單核細胞增生李斯特菌三種食源性致病菌均表現(xiàn)出很好的抑菌效果。本文研究了三株菌產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)對不同條件的敏感性，發(fā)現(xiàn)三株菌的抑菌物質(zhì)在酸性條件下的抑菌活性較好。

2.4.3 代謝產(chǎn)物對酶的敏感性試驗

菌株HS011、HS023、HS033的發(fā)酵上清液經(jīng)過各種蛋白酶處理后，對金黃色葡萄球菌的抑菌效果如圖9所示。

圖9 酶處理對菌株發(fā)酵液中抑菌物質(zhì)抑菌活性的影響Fig.9 The effect of enzyme treatment on the antibacterial activity of antibacterial substances in the fermentation broth

為了驗證三株菌中的蛋白多肽類物質(zhì)是否有抑菌活性，對三株菌的代謝產(chǎn)物進行酶處理試驗。由圖9可知，經(jīng)過蛋白酶K、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶處理過的發(fā)酵上清液，其抑菌活性變化較小，但是沒有明顯降低，在蛋白酶K的作用下，HS023的代謝產(chǎn)物抑菌活性降低最多，為29.06%，說明三株菌代謝產(chǎn)物的抑菌活性的主要來源并不是蛋白多肽類物質(zhì)，同時，也說明三株菌代謝產(chǎn)物的抑菌活性對酶類比較穩(wěn)定，不易受酶的影響而改變抑菌活性。三株菌的代謝產(chǎn)物經(jīng)過過氧化氫酶的處理，其抑菌活性均有降低，HS023降低的最多（為28.40%），這表明三株菌都有抑菌活性成分過氧化氫的產(chǎn)生。MAO等[17]通過對植物乳桿菌的無細胞上清液用胰蛋白酶、胃蛋白酶和蛋白酶K處理后，抑菌活性對酶的敏感性小，穩(wěn)定性好，這與本實驗的研究結(jié)果一致。

3 結(jié)論

3.1 隨著食品行業(yè)的不斷發(fā)展，人們越來越注重食品的安全問題，傳統(tǒng)抑菌方法添加化學食品添加劑有潛在殘留的危害，所以開發(fā)新型食品抑菌劑來代替?zhèn)鹘y(tǒng)食品抑菌劑對保證食品安全尤其重要。

3.2 本研究篩選出三株具有良好抑菌特性的菌株，分別為植物乳桿菌HS011、德氏乳桿菌HS023、嗜熱鏈球菌HS023。三株菌經(jīng)培養(yǎng)20 h后，發(fā)酵液pH分別由5.44、5.44、5.42下降到3.55、3.54、3.57；三株乳酸菌能耐受0.1%以下的膽鹽和14%的NaCl溶液；在5.0≤pH≤8.0時生長情況良好；且具有較為廣泛的抑菌譜，對大腸桿菌O157:H7、蠟樣芽孢桿菌、單增李斯特氏菌、阪崎腸桿菌等均有較好抑制作用，但對霉菌和酵母無作用；代謝產(chǎn)物經(jīng)溫度（20～121 ℃）、pH（2.0～8.0）處理后仍有較好抑菌活性；經(jīng)木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K、過氧化氫酶處理后菌株代謝產(chǎn)物抑菌活性未有明顯變化；通過pH敏感性實驗和蛋白酶敏感性實驗可以推測，三株乳酸菌的抑菌活性成分主要是有機酸和過氧化氫，HS023產(chǎn)生的抑菌性有機酸最多，其中三株菌產(chǎn)生的蛋白多肽類物質(zhì)具有一定的抑菌活性，但不是主要抑菌成分。

3.3 本研究從傳統(tǒng)發(fā)酵食品中篩選到的三株具有優(yōu)良抑菌活性的乳酸菌將來可用于食品發(fā)酵行業(yè)或者天然防腐劑領(lǐng)域，在食品保鮮方面將具有運用潛力。后續(xù)我們會對三株乳酸菌的發(fā)酵上清液進行深入研究，進一步分析其具體抑菌成分，并對其抑菌機理進行研究，為乳酸菌資源的開發(fā)應(yīng)用提供科學依據(jù)。