串聯(lián)雙柱固相萃取-原子吸收光譜法 檢測葡萄酒中Fe、Cu和Mn的形態(tài)

李金梁，彭晶晶，楊潔，蘭惠晶，張夢瑤，郭安鵲,2*

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué)葡萄酒學(xué)院，陜西楊凌 712100）（2.陜西省葡萄與葡萄酒工程技術(shù)研究中心，陜西楊凌 712100）

葡萄酒的適量氧化有利于其成熟（如利用橡木桶陳釀），但是過度氧化通常會導(dǎo)致褐變，嚴(yán)重影響葡萄酒的感官品質(zhì)和營養(yǎng)價值[1]。葡萄酒的氧化主要表現(xiàn)為酚類物質(zhì)（特別是鄰羥基酚）的氧化，鐵（Fe）離子在引發(fā)和延伸葡萄酒氧化反應(yīng)中起著關(guān)鍵催化作用[1-3]，共存的銅（Cu）、錳（Mn）離子具有氧化增效作用[4,5]。隨著現(xiàn)代釀酒技術(shù)和設(shè)備的不斷改進(jìn)，葡萄酒中Fe、Cu、Mn等的含量已經(jīng)大幅度降低[4,6]。然而，氧化褐變現(xiàn)象依然普遍存在[7,8]，這與葡萄酒中上述金屬的化學(xué)形態(tài)及其分布密切相關(guān)[9]。

元素形態(tài)是指某種元素在原子和分子結(jié)構(gòu)水平上存在顯著差異的各種存在形式，包括元素的價態(tài)、化合態(tài)和絡(luò)合態(tài)等[10]。較之總濃度，葡萄酒中金屬的形態(tài)不僅決定了金屬的生物可利用性和毒性，也會對葡萄酒的氧化產(chǎn)生實(shí)質(zhì)性影響[11-13]。在葡萄酒中，具有鄰羥基結(jié)構(gòu)的酚類物質(zhì)（氧化底物）能夠?qū)e3+還原為Fe2+，促進(jìn)氧化反應(yīng)[14]；酒石酸和蘋果酸能夠與Fe3+形成穩(wěn)定絡(luò)合物，一定程度上抑制酚類物質(zhì)的氧化[15]；pH變化會影響絡(luò)合物的溶解性及其穩(wěn)定性[16]；氨基酸、多肽[17]、蛋白[12]、多糖[18]等也會影響金屬的存在形態(tài)。因此，葡萄酒的氧化除了與金屬的總量有關(guān)，更多地取決于其形態(tài)分布。然而，目前有關(guān)金屬形態(tài)分析技術(shù)的報道很少，且多局限于價態(tài)的檢測[19]。

葡萄酒成分復(fù)雜，金屬元素形態(tài)分析面臨基質(zhì)干擾、形態(tài)轉(zhuǎn)化等諸多挑戰(zhàn)，利用高靈敏檢測技術(shù)進(jìn)行元素形態(tài)分析之前，從樣品中分離出目標(biāo)元素的各個形態(tài)已成為形態(tài)分析技術(shù)的關(guān)鍵[20]。當(dāng)前常用的形態(tài)分離與富集方法主要包括液液萃取、固相萃?。⊿PE）、膜分離和共沉淀法等[21]。其中，SPE法由于選擇性強(qiáng)、回收率高、有機(jī)溶劑使用少等諸多優(yōu)勢[22]，已經(jīng)成為一種現(xiàn)代高效的通用型樣品前處理技術(shù)[20,22]。近年來，串聯(lián)使用雙柱SPE技術(shù)對樣品進(jìn)行預(yù)處理，結(jié)合火焰原子吸收法（FAAS）或電感耦合等離子體發(fā)射光譜法（ICP-OES）被成功用于葡萄酒中Fe、Cu等金屬形態(tài)的測定[9,12]。然而，對于含有豐富多酚類物質(zhì)的葡萄酒或其他飲料，傳統(tǒng)的C18固相萃取柱主要萃取非極性的酚類物質(zhì)，對強(qiáng)極性酚類物質(zhì)（羥基苯甲酸、羥基肉桂酸及其衍生物）的吸附能力差、回收率低[21,23]，而具有兒茶酚或沒食子酰基結(jié)構(gòu)的原兒茶酸、咖啡酸、沒食子酸等能與金屬離子（尤其是Fe3+）形成穩(wěn)定絡(luò)合物[25,26]，C18柱并不適用于萃取葡萄酒中多種不同性質(zhì)的酚類物質(zhì)。與C18柱相比，以高聚物二乙烯基苯-乙烯吡咯烷酮為吸附劑的HLB固相萃取柱優(yōu)勢明顯，更加適合保留樣品中低含量的酚類物質(zhì)[22,24]。

本實(shí)驗(yàn)通過利用HLB柱代替C18柱、優(yōu)化雙柱固相萃取條件，以及在模擬葡萄酒中考察pH值、有機(jī)酸對測定結(jié)果的影響，結(jié)合方法可靠性評價，構(gòu)建一種快速準(zhǔn)確、適用于葡萄酒中Fe、Cu、Mn形態(tài)分析的新技術(shù)，這對于明晰葡萄酒中Fe、Cu、Mn形態(tài)分布特征，深入研究葡萄酒氧化機(jī)制具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 供試酒樣

酒精水溶液（12%，V/V）、模擬酒；國產(chǎn)瓶裝紅葡萄酒（2017年赤霞珠干紅，共5款）和白葡萄酒（4款霞多麗干白：2017年3款，2019年1款；2015年雷司令干白1款），來自甘肅紫軒酒業(yè)、寧夏御馬酒莊、云南香格里拉酒業(yè)、新疆芳香莊園和絲路酒莊等企業(yè)，均為當(dāng)?shù)仄咸言纤勆唐菲咸丫啤?/p>

酒精水溶液（12%，V/V）：室溫下制備，每100 mL溶液中含有12 mL無水乙醇。以此為溶劑，通過添加金屬離子、單寧酸或有機(jī)酸，分別獲得含金屬離子、（單寧酸+金屬離子）和有機(jī)酸的酒精水溶液，均現(xiàn)配現(xiàn)用。除非特別說明，上述溶液中的金屬濃度為2000 μg/L Fe3+、500 μg/L Cu2+和2000 μg/L Mn2+，單寧酸濃度為500 mg/L。

模擬酒：參照郭安鵲等[27]的方法，配制含18 mmol/L (+)-酒石酸的酒精水溶液（12%，V/V），利用1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)溶液的pH值為3.20。充氮?dú)夂笥谑覝叵卤芄夥胖谩?/p>

1.2 儀器與試劑

Agilent AA 240Z石墨爐原子吸收光譜儀（GFAAS），美國Agilent公司；Milli-Q超純水系統(tǒng)，美國Millipore公司；BT100FJ六通道數(shù)字分配型蠕動泵，保定創(chuàng)銳泵業(yè)有限公司；FHO-7023 12位固相萃取裝置，廣州菲羅門科學(xué)儀器有限公司。Polyclean X-HLB（反相固相萃取柱，500 mg/6 mL）和Superclean SCX（陽離子交換固相萃取柱，500 mg/6 mL），廣州菲羅門科學(xué)儀器有限公司。標(biāo)準(zhǔn)品：1000 mg/L Fe3+、Cu2+（AAS級），1000 mg/L Mn2+、Zn2+、Al3+（ICP級），美國Sigma-Aldrich公司。L-酒石酸（99.5%）、L-酒石酸氫鉀（99%）、L-蘋果酸（99%）、檸檬酸（≥99.5%）、乳酸（≥85%）、琥珀酸（≥99.0%），分析純，Sigma-Aldrich公司。乙酸，≥99.5%，分析純，廣東光華科技股份有限公司。濃硝酸，65%～68%（V/V），優(yōu)級純，洛陽昊華化學(xué)試劑有限公司；濃鹽酸，36%～38%，優(yōu)級純，四川西隴科學(xué)有限公司；NaOH，≥98%，優(yōu)級純，天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司；無水乙醇，分析純，四川西隴科學(xué)有限公司。實(shí)驗(yàn)用水均為超純水（電阻率18.2 MΩ·cm）。

實(shí)驗(yàn)中所使用玻璃和塑料器材等均用10% HNO3（體積分?jǐn)?shù)）浸泡過夜，再用超純水沖洗干凈，晾干后使用。

1.3 固相萃取柱活化

參照Polyclean X-HLB柱活化方法和Kontoudakis等[9]的研究報道，設(shè)置4種活化平衡方式：20 mL甲醇→30 mL水（方式1，“→”代表沿箭頭方向順序通過）；20 mL甲醇→30 mL水→20 mL模擬酒（方式2）；20 mL甲醇→30 mL水→10 mL 1 mol/L的鹽酸→20 mL模擬酒（方式3）；20 mL甲醇→30 mL水→10 mL1 mol/L的鹽酸→30 mL水→20 mL模擬酒（方式4）。目前，SCX柱活化方法較為成熟、一致[9,28]。Superclean SCX柱的活化方式為：40 mL水→10 mL1 mol/L的鹽酸→20 mL水→10 mL1 mol/L的NaOH→40 mL水。

借助固相萃取裝置和真空泵，使各試劑以1～2 mL/min的流速依次通過小柱。過完試劑后，持續(xù)抽真空10 min左右去除SPE柱中殘留的水分。

1.4 酒樣中各金屬形態(tài)的提取方法

抽取15 mL酒樣，通過蠕動泵控制樣品以1 mL/min流速首先通過Polyclean X-HLB柱：取5 mL流出液（餾分1）測定目標(biāo)金屬含量，疏水態(tài)含量就等于樣品中金屬總量減去餾分1中的金屬含量[9]；剩余的10 mL流出液隨后以2 mL/min的流速通過Superclean SCX柱，獲得殘留態(tài)溶液（餾分2，用于測定酒樣中目標(biāo)金屬的殘留態(tài)含量）。最后，利用2 mol/L HNO3洗脫SCX柱，收集洗脫液（洗脫液1，用于測定金屬的陽離子含量），也可通過餾分1和餾分2的差值進(jìn)行比較驗(yàn)證。由上可知，金屬總量=疏水態(tài)+陽離子+殘留態(tài)。

1.5 原子吸收光譜測定條件

空白溶液：1% HNO3溶液。標(biāo)準(zhǔn)溶液：使用1% HNO3溶液將Fe3+、Cu2+、Mn2+標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋，配制成200 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)儲備液。

標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：以1% HNO3溶液為參比，利用石墨爐原子吸收光譜儀（GFAAS）分別測定5個質(zhì)量濃度梯度的Fe3+（0、20、40、100、160 μg/L）、Cu2+（0、20、40、60、100 μg/L）和Mn2+（0、20、40、100、140 μg/L）標(biāo)準(zhǔn)溶液。Fe的測定波長是372.0 nm，狹縫寬度0.2 nm，燈電流5.0 mA；Cu的分析波長是327.4 nm，狹縫寬度0.5 nm，燈電流4.0 mA；Mn的分析波長是403.1 nm，狹縫寬度0.2 nm，燈電流5.0 mA。以高純氬氣為保護(hù)氣體，以峰高定量，進(jìn)樣體積為10 μL。儀器通過設(shè)定程序自動采集空白溶液和標(biāo)準(zhǔn)溶液系列，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。GFAAS溫度程序和氣體流量如表1所示。

根據(jù)酒樣中金屬實(shí)際含量使用1% HNO3進(jìn)行適當(dāng)稀釋后，直接進(jìn)樣測定，結(jié)果由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算獲得。

1.6 方法的靈敏度

通過檢測限LOD（產(chǎn)生高于系統(tǒng)噪聲水平可檢測到響應(yīng)的最低分析物濃度）和定量限LOQ（可準(zhǔn)確和精確測量分析物的最低水平）評估方法的靈敏度[29]。

式中：

σ——空白樣品多次測量值的標(biāo)準(zhǔn)差（n=9）；

S——分析曲線斜率[30]。

表1 測定Fe、Cu、Mn的石墨爐溫度程序Table 1 Graphite furnace temperature program for determination of Fe, Cu and Mn

表2 活化方式對Polyclean X-HLB柱流出液中金屬離子通過率的影響Table 2 Effects of activation methods on the throughput rates of metal ions in liquid effluents from the polyclean X-HLB column

1.7 方法的準(zhǔn)確度和精密度

為了評價串聯(lián)雙柱固相萃取-原子吸收光譜法的準(zhǔn)確性，對紅葡萄酒、白葡萄酒及其餾分進(jìn)行加標(biāo)實(shí)驗(yàn)計(jì)算回收率。

回收率/%=100×(C1-C0)/C’

式中：

C1——加標(biāo)后樣品中金屬的濃度，μg/L；

C0——加標(biāo)之前樣品中金屬的濃度，μg/L；

C’——加到酒中的分析物的標(biāo)準(zhǔn)濃度[29]，μg/L。

每種金屬的加標(biāo)濃度各設(shè)兩個水平：低濃度Fe3+或Mn2+為500 μg/L，高濃度為2500 μg/L；低濃度Cu2+為20 μg/L，高濃度為500 μg/L。

選擇白、紅葡萄酒各一款，利用新建方法對原始酒樣及其餾分中金屬含量重復(fù)測定6次，計(jì)算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（% RSD），評估方法的精密度。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

借助數(shù)據(jù)處理軟件DPS V6.50獲得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的ANOVA（Duncan新復(fù)極差法），每個處理重復(fù)3次，其結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。利用Microsoft excel 2010和Origin 2018進(jìn)行圖表繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 Polyclean X-HLB柱的活化

結(jié)果如表2所示，在僅含金屬離子的酒精水溶液中，4種活化方式對HLB柱吸附Cu2+、Mn2+的影響很少，但是對Fe3+具有顯著影響；活化方式4表現(xiàn)最佳，3種金屬離子通過率（流出液中金屬含量占金屬總量的百分比）最高（均不低于93.71%）。由于單寧酸的鄰酚結(jié)構(gòu)可以與金屬離子配合形成穩(wěn)定的絡(luò)合物[31]，其加入后，3種金屬的存在形態(tài)發(fā)生改變（Fe3+幾乎全部被單寧酸絡(luò)合），流出液中金屬濃度均下降，但是不同活化方式之間的差異不顯著。因此，選擇方式4進(jìn)行HLB柱的活化和平衡。

Pohl等[11-13]發(fā)現(xiàn)，在含單寧酸的酒精水溶液（pH 3.00～5.00）中：20%～85% Fe3+被Amberlite XAD-7HP柱保留，10%～35% Cu2+和9%～13% Mn2+被Amberlite XAD-16柱保留。相比Amberlite XAD系列固相萃取柱，在本實(shí)驗(yàn)條件下（pH=2.88），Polyclean X-HLB柱對上述金屬離子的單寧酸絡(luò)合物均具有更高的保留率，有效保證了葡萄酒中金屬疏水態(tài)含量檢測的準(zhǔn)確性。

2.2 SPE柱流速對金屬離子通過率的影響

樣品分別以1、2、3 mL/min流速通過Polyclean X-HLB柱或Superclean SCX柱，結(jié)果如表3所示。含有金屬離子的樣品流經(jīng)HLB柱后，流速僅對Fe3+產(chǎn)生了顯著影響（隨流速增加，流出液中Fe3+百分比濃度從93.71%降至79.43%）；1 mL/min和2 mL/min處理之間的差異不顯著，這與文獻(xiàn)報道的結(jié)果一致[11-13]；單寧酸加入后，流出液中Fe3+的濃度下降最大，且同一金屬離子不同流速之間的差異并不顯著（表3）。與酒精水溶液相比，葡萄酒成分更為復(fù)雜，所以選擇1 mL/min作為HLB柱的最佳流速。

同樣，由表3可知，僅含金屬離子的樣品流經(jīng)SCX柱后，3種金屬陽離子幾乎全部被吸附，流速為2 mL/min的效果最好；加入的單寧酸由于與Fe3+形成穩(wěn)定絡(luò)合物，不能被SCX柱保留，所以通過率很高（≥75.77%）。考慮到萃取時間過長可能會造成金屬形態(tài)轉(zhuǎn)化問題，選擇2 mL/min作為SCX柱的最佳流速，這與已有文獻(xiàn)報道的1 mL/min略有不同[9,11-13,28]。

表3 流速對SPE柱流出液中金屬離子通過率（%）的影響Table 3 Effects of different speeds on the throughput rates of metal ions in liquid effluents from SPE columns

表4 洗脫劑對SPE柱流出液中金屬離子回收率（%）的影響Table 4 Effects of eluting agents on the recoveryof metal ions in liquid effluents from SPE columns

表5 共存Zn2+和Al3+對SPE柱流出液中金屬離子通過率的影響Table 5 Effects of Zn2+ and Al3+on the throughput rates of metal ions in liquid effluents from SPE columns

2.3 SPE柱洗脫劑對金屬離子回收率的影響

以1、2、3 mol/L鹽酸或硝酸溶液為洗脫劑，分別對樣品經(jīng)過的Polyclean X-HLB柱和Superclean SCX柱進(jìn)行洗脫，洗脫效果以回收率（洗脫液中金屬離子含量與洗脫前SPE柱上吸附金屬離子含量的比值）表示。結(jié)果顯示（表4），對于Polyclean X-HLB柱，除了鹽酸對Fe3+的洗脫結(jié)果（回收率≥98.27%）令人滿意外，其他處理的洗脫效果均不理想。Pohl及其合作者也在相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)了同樣的問題，所以建議采用差減法計(jì)算疏水態(tài)含量[11-13]，即利用樣品中的金屬總量減去流出液中的含量就等于疏水態(tài)含量。

對于Superclean SCX柱，不同濃度的鹽酸或硝酸洗脫后3種金屬離子的回收率均令人滿意，其中2 mol/L硝酸表現(xiàn)出最好的洗脫能力和穩(wěn)定性，回收率為98.34%～99.29%（表4）。

2.4 共存Zn2+和Al3+對金屬離子通過率的影響

有研究表明，K+、Na+、Ca2+、Mg2+和Fe3+、Cu2+、Mn2+同時通過固相萃取柱時不會對分離結(jié)果產(chǎn)生影響[12,13]。向只含金屬離子的酒精水溶液中添加1 mg/L Zn2+和0.5 mg/L Al3+，在上述優(yōu)化萃取條件下，依次通過Polyclean X-HLB和SupercleanSCX柱。測定結(jié)果表明（表5），共存Zn2+和Al3+沒有對過柱后3種金屬離子的分離結(jié)果產(chǎn)生顯著影響。

2.5 葡萄酒中Fe、Cu、Mn含量檢測方法的評價

2.5.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性

以Fe、Cu、Mn各自的質(zhì)量濃度（μg/L）為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)，得到鐵標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.0031x+0.0014，決定系數(shù)R2為0.9997；銅標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.0056x+0.0391，R2為0.9919；錳標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.0047x+0.0154，R2為0.9992。說明Fe、Cu和Mn在所設(shè)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5.2 靈敏度

通過計(jì)算3倍多次空白的標(biāo)準(zhǔn)差σ除以分析曲線的斜率S可知，F(xiàn)e、Cu、Mn的LOD值分別為1.56 μg/L、0.55 μg/L和0.39 μg/L，LOQ值分別為5.21 μg/L、1.83 μg/L和1.30 μg/L。說明方法的靈敏度高。

2.5.3 準(zhǔn)確度和精密度

加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示（表6），白葡萄酒及其各餾分中Fe、Cu、Mn的加標(biāo)回收率分別是92.49%～106.37%、96.68%～112.18%、94.03%～ 107.67%；紅葡萄酒及其各餾分中Fe、Cu、Mn的加標(biāo)回收率分別是92.04%～110.39%、90.53%～109.65%、101.94%～110.16%。表明方法的準(zhǔn)確性良好。

對原始酒樣及其餾分中金屬含量重復(fù)測定6次的結(jié)果顯示，F(xiàn)e的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（%RSD）為1.59%～ 6.55%，Cu的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.55%～7.12%，Mn的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.89%～6.33%，說明方法的精密度良好。

表6 白葡萄酒和紅葡萄酒及其餾分、洗脫液在不同加標(biāo)濃度下的回收率（%）Table 6 The recoveries (%) of white, red wine, their effluents and eluates in samples with two spiked levels

表7 pH對SPE柱流出液中金屬離子回收率的影響Table 7 Effects of pH on the throughput rates of metal ions in liquid effluents from SPE columns

2.6 pH和有機(jī)酸對模擬葡萄酒中Fe、Cu、Mn形態(tài)測定的影響

2.6.1 pH的影響

為了解pH對Fe3+、Cu2+、Mn2+形態(tài)的影響，采用0.05 mol/L鹽酸和0.05 mol/L NaOH調(diào)節(jié)12%（V/V）酒精水溶溶液的pH值為3.00、3.50和4.00（葡萄酒pH值范圍）；靜置2 h后，各樣品分別通過Polyclean X-HLB和Superclean SCX柱。

結(jié)果表明（表7），F(xiàn)e3+對pH變化非常敏感，在實(shí)驗(yàn)pH條件下，93%以上被HLB柱吸附，僅有50%左右通過SCX柱；隨著pH值增加，Cu2+通過HLB柱的百分比下降，約有20%左右通過SCX柱；Mn2+對pH變化不敏感，90%以上通過HLB柱，約有95%被SCX柱保留。pH變化對Fe、Cu形態(tài)的影響，很可能與Fe(OH)3等膠體的形成及后續(xù)沉淀有關(guān)[32,33]。水中的研究顯示，當(dāng)Fe3+濃度為5mg/L時，F(xiàn)e3+在pH為3.36時就開始產(chǎn)生Fe(OH)3，pH為4.01時完全沉淀[34]。

2.6.2 有機(jī)酸的影響

葡萄酒中常見的有機(jī)酸（酒石酸、蘋果酸、檸檬酸、琥珀酸、乳酸等），由于含有羥基官能團(tuán)，能夠和鐵離子形成可溶性絡(luò)合物[35,36]，通過改變鐵的形態(tài)分布而影響葡萄酒的氧化過程[37]。利用建立的串聯(lián)雙柱固相萃取-原子吸收光譜法，在酒精水溶液12%（V/V）中研究了不同pH條件下有機(jī)酸及其組合對酒樣中Fe3+、Cu2+、Mn2+形態(tài)分布的影響。各有機(jī)酸濃度接近其在葡萄酒中的實(shí)際含量[15]。

結(jié)果表明（圖1），有機(jī)酸種類、pH對Fe3+、Cu2+的存在形態(tài)具有顯著影響，而對Mn2+的形態(tài)分布（以陽離子為主，平均占Mn總量的91.44%）影響很小。如圖1所示，在模擬葡萄酒環(huán)境條件下，F(xiàn)e3+因與酒石酸、蘋果酸、檸檬酸絡(luò)合主要以殘留態(tài)存在（在pH 3.50～4.00時表現(xiàn)尤為明顯），而由于與乳酸配合作用弱而以陽離子為主（雖然pH上升一定程度上提高了殘留態(tài)的百分比）；Cu2+形態(tài)對pH值變化非常敏感（酒石酸和檸檬酸表現(xiàn)最突出，其次是蘋果酸，乳酸最弱）：pH 3.00時主要是陽離子（≥86.48%），隨著pH值增加，其百分比顯著下降并伴隨著殘留態(tài)顯著上升，至pH 4.00時酒石酸和檸檬酸溶液中的Cu2+以殘留態(tài)為主，分別占到了60.44%和83.13%；與單一有機(jī)酸（主要是酒石酸、蘋果酸和檸檬酸）相比，混合有機(jī)酸之間表現(xiàn)出對絡(luò)合金屬離子的競爭關(guān)系，很大程度上降低了陽離子的百分比而增加了疏水態(tài)的百分比（可能與其他酸加入后引起pH值下降有關(guān)）。

圖1 不同pH條件下有機(jī)酸對酒精水溶液中Fe3+、Cu2+、Mn2+形態(tài)分布的影響Fig.1 Effects of organic acids on fraction distribution of ferric, cupric and Mn (II) ions in alcoholic solutions with different pH values

不同有機(jī)酸、pH對金屬形態(tài)影響的差異，主要與它們在模擬葡萄酒中的離解程度、酸根離子與金屬離子之間的相互作用強(qiáng)弱有關(guān)：相比于弱配體乳酸、琥珀酸和乙酸，酒石酸、蘋果酸和檸檬酸與Fe3+絡(luò)合作用更強(qiáng)，且混合有機(jī)酸之間存在相互競爭關(guān)系[15]；通常情況下，有機(jī)酸絡(luò)合作用依賴于pH值（金屬離子和H+都要爭奪配體），在葡萄酒pH條件下，蘋果酸和酒石酸與Fe3+具有相似的絡(luò)合能力[37]，這與本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果（pH 3.50～4.00）一致。另外，與上文“2.6.1 pH的影響”結(jié)果相比，由于有機(jī)酸與金屬離子（如Fe3+和Cu2+）形成了穩(wěn)定的可溶性絡(luò)合物，改變了金屬的形態(tài)分布（疏水態(tài)濃度降低），它們的加入提高了金屬離子的溶解性[38]。

2.7 葡萄酒中Fe、Cu、Mn形態(tài)的測定

選擇瓶裝白、紅葡萄酒各5款，利用串聯(lián)雙柱固相萃取-原子吸收光譜法，分析酒樣中Fe、Cu、Mn的形態(tài)及其分布特征，結(jié)果如圖2所示。就金屬總量而言，不同酒樣之間的差異比較大：紅葡萄酒中Fe、Cu的平均含量（分別為2.23、0.15 mg/L）均比白葡萄酒中的（分別為0.88、0.09 mg/L）高，兩種類型酒中Mn的含量非常接近（平均值分別為1.98、2.27 mg/L）。金屬形態(tài)分析的結(jié)果表明（圖2），酒樣中同一金屬的3種形態(tài)之間差異顯著；相同類型葡萄酒中Fe或Mn的形態(tài)分布比較穩(wěn)定（樣品間差異小），而Cu的形態(tài)分布變化很大（樣品間變化較大）；酒樣中Fe、Mn均主要以殘留態(tài)存在（平均分別占金屬總量的69.79%和58.05%），而Cu在白葡萄酒（以殘留態(tài)為主，平均占45.62%）和紅葡萄酒（以疏水態(tài)為主，平均占65.60%）中表現(xiàn)不同；Fe陽離子、Mn陽離子、Cu疏水態(tài)在白葡萄酒中排名其次，F(xiàn)e疏水態(tài)、Cu殘留態(tài)和Mn陽離子則在紅葡萄酒中排名第二。

如前所述，酚類物質(zhì)很容易與鐵離子形成穩(wěn)定絡(luò)合物，所以與白葡萄酒相比，F(xiàn)e在富含酚類物質(zhì)的紅葡萄酒中具有更多的疏水態(tài)；Cu在葡萄酒中具有較多的疏水態(tài)，這與Kontoudakis等[9]的研究結(jié)果相同。研究顯示，葡萄酒中的鐵離子主要以絡(luò)合態(tài)存在[1]，總體上白、紅葡萄酒中的Fe應(yīng)以殘留態(tài)為主，這與本研究的結(jié)果一致。然而，Kontoudakis等[9]卻發(fā)現(xiàn)白葡萄酒中鐵的主要形態(tài)是陽離子。這可能與葡萄酒本身的化學(xué)成分和氧化還原狀態(tài)有關(guān)：一方面，鐵形態(tài)與有機(jī)酸種類、pH有關(guān)，如在低pH值蘋果酸酒精水溶液中以陽離子為主；另一方面，葡萄酒的氧化還原狀態(tài)決定了Fe2+/Fe3+比率[19]，如酒石酸、蘋果酸能夠與Fe3+形成穩(wěn)定絡(luò)合物，但是與Fe2+的絡(luò)合作用卻很弱[37]，最終影響了酒樣中各種鐵形態(tài)的分布。該團(tuán)隊(duì)也認(rèn)為這可能與鐵-有機(jī)酸絡(luò)合物的解離和低pH條件有關(guān)[9]。目前，有關(guān)葡萄酒中Mn形態(tài)的研究還很少。然而，基于白、紅葡萄酒中較高的Mn總量和陽離子比例，以及其在葡萄酒氧化反應(yīng)中的重要作用，應(yīng)當(dāng)在今后研究中對Mn元素引起足夠的重視。

圖2 商品葡萄酒中Fe、Cu、Mn的形態(tài)分布Fig.2 Fraction distribution of Fe, Cu and Mn in commercial white (W) and red (R) wines

3 結(jié)論

3.1 構(gòu)建出一種適用于葡萄酒中Fe、Cu、Mn形態(tài)檢測的串聯(lián)雙柱固相萃取-原子吸收光譜技術(shù)，可有效測定金屬的疏水態(tài)、陽離子和殘留態(tài)。確定了Polyclean X-HLB最佳活化條件和最佳流速（1 mL/min），明晰了Superclean SCX的最佳流速（2 mL/min）和洗脫劑（2 mol/L硝酸）；該法快速高效、準(zhǔn)確可靠，也可用于其他酒精飲料中金屬形態(tài)的檢測。

3.2 在葡萄酒環(huán)境條件下，pH對Fe3+和Cu2+的形態(tài)具有顯著影響，但是對Mn2+的形態(tài)影響很??；與單一有機(jī)酸相比，混合有機(jī)酸之間存在對金屬離子的競爭絡(luò)合關(guān)系，很大程度上提高了金屬離子的溶解性。 3.3 白、紅葡萄酒中Fe、Cu、Mn的形態(tài)分布特征不同，這與葡萄酒的成分和氧化還原狀態(tài)密切相關(guān)。