基于SPME-GC-MS的青海亞麻籽油揮發(fā)性組分 指紋圖譜構(gòu)建及摻偽識(shí)別

韓玉澤，王興瑞，李應(yīng)霞，王淑珍，陳昀昀，王進(jìn)英,2*

（1.青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院，青海西寧 810016）

（2.青海大學(xué)三江源生態(tài)與高原農(nóng)牧業(yè)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海西寧 810016）

亞麻又稱胡麻，是世界十大油料作物之一，居世界油料總產(chǎn)量第七位。亞麻籽油中不飽和脂肪酸總含量高達(dá)90%以上，同時(shí)含有蛋白質(zhì)、膳食纖維、酚類物質(zhì)等多種功能成分，對(duì)疾病預(yù)防有積極作用[1]。據(jù)報(bào)道，亞麻籽具有多種保健功能，如抗炎作用、預(yù)防心血管疾病和癌癥、降低骨吸收率、抗抑郁等[2-4]。近幾十年來(lái)，亞麻籽油在全球市場(chǎng)上越來(lái)越受歡迎。相比市場(chǎng)上常見(jiàn)食用植物油如大豆油、花生油、玉米油等，亞麻籽油價(jià)格普遍偏高，因此，與西方國(guó)家的橄欖油一樣，亞麻籽油的摻假也是一個(gè)嚴(yán)重的問(wèn)題[5]。

亞麻籽油的香味是影響其感官特性、品質(zhì)的重要因素之一，由于具有獨(dú)特的香氣成分，因此研究亞麻籽油揮發(fā)性組分可以鑒別其真?zhèn)巍９滔辔⑤腿。╯olid-phase microextraction，SPME）是在固相萃取的基礎(chǔ)上發(fā)展而來(lái)的一種新型樣品前處理技術(shù)[6]，該技術(shù)自1990年代初發(fā)展以來(lái)，特別是在揮發(fā)性化合物的分析方面得到了廣泛的應(yīng)用。它將被分析物從樣品基質(zhì)中吸附到纖維上，然后被解吸到分析儀器中。與常規(guī)的提取方法相比，固相微萃取法能較好地進(jìn)行揮發(fā)性成分的提取和精煉[7]，分析亞麻籽油中的揮發(fā)性成分，可為亞麻籽油的品質(zhì)研究、摻偽鑒別和進(jìn)一步優(yōu)化加工貯藏條件提供理論依據(jù)[8,9]。

近年來(lái)，指紋圖譜技術(shù)在食用油的種類鑒別和摻假鑒定中得到了廣泛應(yīng)用。氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對(duì)分析揮發(fā)性成分具有獨(dú)特的作用[10]，不同品種食用油所含揮發(fā)性成分種類及含量存在一定差異，因此利用氣相色譜質(zhì)譜法構(gòu)建揮發(fā)性組分指紋圖譜具有重要意義。王李平[11]等采用頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)花生油中風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行分析鑒定，比較了30批不同花生油樣品的GC-MS色譜圖并生成標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜，可同時(shí)檢測(cè)花生油中56種揮發(fā)性成分。孫亞娟等[12]以17種不同的杏仁油為原料，采用頂空固相微萃取和氣相色譜儀測(cè)定了其揮發(fā)性成分，建立了杏仁油揮發(fā)性成分指紋圖譜，結(jié)果表明，杏仁油揮發(fā)性成分指紋圖譜由12個(gè)共有色譜峰構(gòu)成，適用于摻偽量15%以上杏仁油的鑒別。胡婉君等[13]通過(guò)對(duì)10種秈稻揮發(fā)性成分的GC-MS圖譜分析，共確定了12個(gè)色譜峰為特征指紋峰，建立了指紋圖譜，結(jié)果顯示10個(gè)品種相似度很高。已有學(xué)者將指紋圖譜應(yīng)用于油脂的摻偽鑒別中，但是基于揮發(fā)性組分對(duì)亞麻籽油進(jìn)行摻偽鑒定的研究仍不足。

本研究利用SPME-GC-MS對(duì)青海40種亞麻籽油中揮發(fā)性成分進(jìn)行測(cè)定，以此來(lái)構(gòu)建亞麻籽油揮發(fā)性成分的指紋圖譜，通過(guò)計(jì)算摻偽亞麻籽油與純亞麻籽油相似度建立摻偽模型，以期為亞麻籽油質(zhì)量控制及摻假提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 原料

青海亞麻籽40種，由實(shí)驗(yàn)室索氏抽提（料液比0.06 g/mL、抽提溫度70 ℃，抽提時(shí)間8 h）制得亞麻籽油，分別編號(hào)為S1～S40。

表1 亞麻籽油信息表Table 1 Information of flaxseed oil

1.2 儀器與設(shè)備

QP2020 NX GC-MS聯(lián)用儀：日本島津公司；50/30 μm二乙烯基苯/碳分子篩/聚二甲基硅氧烷（DVB/CAR/PDMS）萃取纖維頭、固相微萃取手柄、SPME專用磁力加熱攪拌裝置、15 mL采樣瓶：美國(guó)Supelco；JA1003電子天平：上海良平儀器儀表有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 青海亞麻籽油揮發(fā)性成分的萃取

將萃取頭置于260 ℃進(jìn)樣口老化60 min，直至無(wú)干擾峰出現(xiàn)。取6.0 g青海亞麻籽油樣品加入到15 mL采樣瓶中，放入磁力攪拌子后立即用帶有聚四氟乙烯硅膠隔墊的蓋子將其密封壓緊，將樣品瓶置于80 ℃磁力加熱攪拌器上，以400 r/min的速率攪拌加熱20 min，使亞麻籽油揮發(fā)性組分充分平衡，之后將活化好的萃取頭穿過(guò)硅膠隔墊，推出纖維頭，頂空萃取40 min。迅速將萃取頭插入氣相色譜進(jìn)樣口，在250 ℃條件下解吸5 min。每?jī)纱芜M(jìn)樣分析間需將萃取頭置于250 ℃進(jìn)樣口洗脫10 min，以保證纖維頭的高效性。

1.3.2 GC-MS分析條件

色譜條件：InertCap pure-wax色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；升溫程序：初始溫度40 ℃，保留2 min，以5 /min℃ 升至220 ℃，保留10 min。載氣為高純氦氣（99.999%），色譜柱流速1.0 mL/min，分流比50.0，進(jìn)樣口溫度250 ℃；

質(zhì)譜條件：電子電離源；離子源溫度150 ℃；燈絲發(fā)射電流200 μA；電子能量70 eV；傳輸線溫度為260 ℃；掃描質(zhì)量范圍m/z35～350 u。

定性與定量：樣品經(jīng)GC-MS分析，由NIST 14標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)檢索各化合物，與標(biāo)準(zhǔn)譜圖進(jìn)行對(duì)照，得到定性結(jié)果，采用峰面積歸一化法對(duì)其定量。

1.3.3 指紋圖譜構(gòu)建

將40批次亞麻籽油樣品按1.3.1方法萃取樣品中揮發(fā)性成分，結(jié)合GC-MS分析得到40種樣品油揮發(fā)性成分的氣質(zhì)色譜圖，將色譜信號(hào)導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2004A）得到40種樣品油的原始圖譜，設(shè)立參照?qǐng)D譜，經(jīng)多點(diǎn)校正、自動(dòng)匹配即可得到對(duì)照指紋圖譜R。

1.3.4 摻偽模型建立

設(shè)計(jì)亞麻籽油中分別摻入質(zhì)量濃度梯度為10%、20%、30%、40%、50%的菜籽油、大豆油、葵花籽油、花生油、玉米油、芝麻油等植物油的摻假模型。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

所有數(shù)據(jù)均平行測(cè)定三次，結(jié)果取其平均值，采用Microsoft Excel及SPSS 23.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，Origin 2018作圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 青海亞麻籽油揮發(fā)性組分分析

采用SPME萃取亞麻籽油中揮發(fā)性物質(zhì)，經(jīng)GC-MS檢測(cè)初步鑒別亞麻籽油中主要揮發(fā)性組分，其種類及相對(duì)含量結(jié)果見(jiàn)表2。40個(gè)亞麻籽油樣品共鑒別出58種揮發(fā)性組分，包括12種醛類、8種酸類、9種醇類、2種酮類、5種酯類、13種烷烯類、3種雜環(huán)類、6種其他類物質(zhì)。其中，醛類揮發(fā)性組分種類較多、相對(duì)百分含量高，同時(shí)由于其風(fēng)味閾值較低，因此醛類化合物對(duì)青海亞麻籽油風(fēng)味起主導(dǎo)作用。而醇類、酯類的相對(duì)百分含量較低且這兩類化合物閾值較高，對(duì)亞麻籽油風(fēng)味貢獻(xiàn)較低。

2.2 青海亞麻籽油揮發(fā)性組分指紋圖譜構(gòu)建

圖1 40種青海亞麻籽油揮發(fā)性成分疊加圖Fig.1 Overlay of volatile profiles of 40 kinds of Qinghai flaxseed oil

圖2 40種青海亞麻籽油標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜Fig.2 Standard fingerprint of 40 kinds of Qinghai flaxseed oil

利用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》對(duì)青海40種亞麻籽油揮發(fā)性成分的色譜圖進(jìn)行分析，得到S1～S40的指紋圖譜疊加圖（圖1）。從圖1可以看出，在前10 min，峰較少且相對(duì)含量較低；11～26.5 min區(qū)間內(nèi)，色譜峰出峰較其他時(shí)間密集，以醛類以及烴類物質(zhì)為主，其中包括含量最高的反，反-2,4-庚二烯醛，是青海亞麻籽油揮發(fā)性成分的主要指紋區(qū)；27～35 min峰區(qū)，峰較少，相對(duì)含量低，包括少量酸類化合物。通過(guò)分析比較40種青海亞麻籽油揮發(fā)性成分總離子流圖，發(fā)現(xiàn)S16號(hào)樣品的色譜峰分離情況好、峰面積大、峰數(shù)較多，因此將S16設(shè)為參照?qǐng)D譜以建立指紋圖譜，結(jié)合相似度軟件的色譜峰匹配結(jié)果，選擇保留時(shí)間在7～35 min以內(nèi)的1～18號(hào)峰為共有峰，除1、3、7、8、9、11、13、16、18號(hào)峰，其余峰雖然對(duì)該指紋圖譜的貢獻(xiàn)相對(duì)較小，但在不同樣品間均穩(wěn)定存在，構(gòu)成了指紋的次要特征[14]，由此建立了青海亞麻籽油揮發(fā)性成分指紋圖譜，即標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜（圖2）。

表2 亞麻籽油揮發(fā)性成分分類Table 2 Classification of volatile components of flaxseed oil

表3 40種亞麻籽油指紋圖譜相似度Table 3 Fingerprint similarity of 40 kinds of Qinghai flaxseed oil

相似度是國(guó)家藥典委員會(huì)確定的中藥指紋圖譜標(biāo)準(zhǔn)中的一項(xiàng)重要評(píng)價(jià)指標(biāo)[15]。將所測(cè)青海亞麻籽油樣品的指紋圖譜與標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜進(jìn)行對(duì)比，采用夾角余弦法計(jì)算相似度，結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知，雖然40批次亞麻籽油樣品的相似度存在一定差異，但70%樣品的相似度大于0.8，這說(shuō)明亞麻籽油雖然產(chǎn)地、品種、獲取途徑不同，但其揮發(fā)性成分依然具有一定的穩(wěn)定性，故所構(gòu)建的GC-MS標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜可以較全面地表述青海亞麻籽油揮發(fā)性成分的信息，有利于全面、準(zhǔn)確地用于亞麻籽油揮發(fā)性成分質(zhì)量評(píng)價(jià)研究。

2.3 揮發(fā)性組分指紋圖譜在亞麻籽油摻偽識(shí)別中的應(yīng)用

2.3.1 不同植物油揮發(fā)性成分分析

不同植物油的揮發(fā)性成分組成及含量存在一定差異，當(dāng)一種油中摻入其他植物油后，其揮發(fā)性成分組成及含量必定會(huì)發(fā)生變化，因此揮發(fā)性成分可作為鑒別油脂種類的依據(jù)[16]。將菜籽油、大豆油、花生油、葵花籽油、玉米油、芝麻油六種植物油按1.3.1中方法萃取揮發(fā)物，進(jìn)樣后GC-MS檢測(cè)分析各樣品中揮發(fā)性組分，各植物油主要揮發(fā)性組分及其相對(duì)百分含量見(jiàn)圖3。

圖3 不同植物油揮發(fā)性成分種類及其相對(duì)含量Fig.3 Types and relative contents of volatile profiles in different vegetable oils

由圖3可見(jiàn)，醛類、酸類、醇類、烴類及雜環(huán)類物質(zhì)是構(gòu)成植物油的主體風(fēng)味物質(zhì)。醛類、酸類物質(zhì)在六種植物油中均被檢測(cè)出，且醛類物質(zhì)在各樣品油中均具有較高的相對(duì)百分含量，豐富的醛類物質(zhì)主要是由亞油酸、亞麻酸等脂肪酸的氧化而生成，具有脂肪、水果味等香氣[17]，其中菜籽油、大豆油、葵花籽油中醛類物質(zhì)占總含量的48.38%～54.53%。醇、酮、酯、雜環(huán)類物質(zhì)并未在所有植物油中檢測(cè)到。大豆油中未檢測(cè)到醇類物質(zhì)，酮酯類物質(zhì)在葵花籽油、玉米油中未檢測(cè)到，在其他幾種植物油中含量也較低，相對(duì)百分含量為0.65%～4.34%。雜環(huán)類物質(zhì)以花生油、芝麻油含量最高，其含量是其他植物油的的2～4倍，與前人[18]的研究結(jié)果相符。雜環(huán)類物質(zhì)是制油過(guò)程中美拉德反應(yīng)的產(chǎn)物，主要包括吡嗪、吡咯、嘧啶、呋喃等，具有焙烤、堅(jiān)果香等香味，花生、芝麻是高蛋白油料，因此美拉德反應(yīng)程度更高，使其雜環(huán)類物質(zhì)高于其他植物油[19]。因此，當(dāng)亞麻籽油中摻入這些植物油后，隨著摻入量的變化，摻偽油中揮發(fā)性成分的種類及相對(duì)百分含量會(huì)發(fā)生有規(guī)律的增減。

2.3.2 基于指紋圖譜的青海亞麻籽油摻偽識(shí)別

將生成的亞麻籽油標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜與其他六種植物油圖譜進(jìn)行比較，見(jiàn)圖4。利用相似度評(píng)價(jià)軟件計(jì)算不同植物油與亞麻籽油之間的相似度，以檢驗(yàn)所構(gòu)建的青海亞麻籽油揮發(fā)性成分指紋圖譜對(duì)于區(qū)分亞麻籽油與其他植物油的效果，結(jié)果見(jiàn)表4。由表4可知六種不同植物油的指紋圖譜與亞麻籽油標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜相似度較小，菜籽油、葵花籽油與亞麻籽油相似度僅為0.036、0.077，其他植物油樣品與亞麻籽油標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜相似度均小于0.3，與亞麻籽油之間存在較為明顯的差異，此結(jié)果為亞麻籽油的摻假識(shí)別研究提供了可行性。

表4 不同植物油與亞麻籽油標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜相似度Table 4 Similarity of standard fingerprints of flaxseed oil and different vegetable oils

圖4 不同植物油揮性成分圖譜Fig.4 Chromatogram of volatile profiles in different vegetable oils

測(cè)定摻不同比例菜籽油、大豆油、花生油、葵花籽油、玉米油、芝麻油共30份樣品的揮發(fā)性成分種類及相對(duì)百分含量，利用相似度評(píng)價(jià)軟件計(jì)算摻入不同比例植物油的亞麻籽油相對(duì)于純亞麻籽油的相似度，建立摻假模型，結(jié)果如圖5所示，亞麻籽油中其他植物油摻入量越多，指紋圖譜相似度越小，二者呈線性遞減曲線，其線性方程見(jiàn)表5。通過(guò)摻假模型線性方程計(jì)算摻假量，與實(shí)際摻假量進(jìn)行比較，計(jì)算相對(duì)誤差，結(jié)果見(jiàn)表6。

圖5 指紋圖譜相似度與不同植物油摻偽量模型Fig.5 Model of fingerprint similarity and amount of adulteration of different vegetable oils

表5 指紋圖譜相似度與摻偽模型曲線方程Table 5 Fingerprint similarity and adulteration model curve equation

表6 摻偽亞麻籽油指紋圖譜相似度及相對(duì)誤差Table 6 Fingerprint similarity and relative error of adulterated flaxseed oil

由表6可見(jiàn)，菜籽油摻偽模型中摻假量相對(duì)誤差平均值為8.651%，當(dāng)摻假比例為20%時(shí)，相對(duì)誤差較大，為11.178%，檢測(cè)效果不佳，因此該模型適合摻偽量在30%以上的菜籽油的摻偽檢測(cè)；大豆油摻偽模型中摻假量的相對(duì)誤差平均值為12.987%，當(dāng)摻偽比例為10%、30%時(shí)相對(duì)誤差較大，不具有良好的檢測(cè)效果，摻假量在40%～50%的平均相對(duì)誤差為3.420%，因此該模型適合摻假比例40%以上的大豆油摻假鑒定；花生油、葵花籽油、芝麻油摻偽模型中摻假量平均相對(duì)誤差分別為2.061%、0.666%、0.453%，均可以達(dá)到極好地檢測(cè)效果，適合摻假比例10%以上的摻假檢測(cè)；玉米油摻假模型中摻假量平均相對(duì)誤差為4.750%，摻假比例為10%時(shí)，相對(duì)誤差為12.889%，檢測(cè)效果較差，該摻假模型對(duì)摻假比例20%以上玉米油具有較好地檢測(cè)效果，當(dāng)摻偽量達(dá)到30%時(shí)，檢測(cè)效果極好。

3 結(jié)論

本研究采用HS-SPME結(jié)合GC-MS對(duì)青海亞麻籽油揮發(fā)性成分進(jìn)行測(cè)定，共鑒定出58種揮發(fā)性組分，包括醛類、酸類、醇類、酮類、酯類、烷烯類、雜環(huán)類、其他類物質(zhì)，其中，醛類物質(zhì)是亞麻籽油的主要風(fēng)味物質(zhì)。構(gòu)建了亞麻籽油揮發(fā)性成分的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜并進(jìn)行相似度分析，該指紋圖譜可以較全面地表述青海亞麻籽油揮發(fā)性成分的信息。通過(guò)對(duì)6種植物油（菜籽油、大豆油、花生油、葵花籽油、玉米油、芝麻油）揮發(fā)性成分種類及含量進(jìn)行測(cè)定，其結(jié)果與亞麻籽油存在較大差異，故在此基礎(chǔ)上建立了6種植物油摻偽模型。結(jié)果表明，不同模型對(duì)于植物油摻假量的檢測(cè)存在一定差異，摻假模型對(duì)摻假比例10%以上的花生油、葵花籽油、芝麻油的檢測(cè)效果極好，對(duì)摻假比例20%以上的玉米油以及摻假比例30%以上的菜籽油具有較好地檢測(cè)效果，對(duì)大豆油的摻假檢測(cè)效果不佳，只適合摻假量40%以上大豆油的檢測(cè)。該結(jié)果為亞麻籽油摻偽鑒別及品質(zhì)控制提供了方法，具有較強(qiáng)的理論價(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義。