木霉菌對馬鈴薯黑痣病菌的拮抗作用及防效研究

王天君，陳志垚，楊霞，于廣宇，臺蓮梅,2

（1．黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)農(nóng)學(xué)院，大慶 163319；2．黑龍江省作物-有害生物互作生物學(xué)及生態(tài)防控重點(diǎn)研究室）

馬鈴薯黑痣病也被稱為莖基腐病[1]，是由立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）引起的可以導(dǎo)致馬鈴薯減產(chǎn)和降低品質(zhì)的土傳病害[2]。東三省作為我國馬鈴薯主產(chǎn)區(qū)對馬鈴薯黑痣病已有報(bào)道[3]。根據(jù)調(diào)查顯示，黑痣病發(fā)生嚴(yán)重地塊的植株死亡率可達(dá)70%以上，塊莖基本全部發(fā)病[4]。該病害發(fā)生嚴(yán)重時(shí),能夠造成馬鈴薯減產(chǎn)過半[5]。病原菌通過侵害幼芽、匍匐莖和根形成褐色壞死斑影響植株生長，菌絲聚集在塊莖表面形成的菌核即為“黑痣”[6]。黑痣病的防控已成為我國馬鈴薯生產(chǎn)中面臨的重要問題之一。一直以來，馬鈴薯黑痣病的防控主要采取化學(xué)防治、抗病育種和農(nóng)業(yè)防治等方法[7-9]?；瘜W(xué)防治造成農(nóng)藥殘留和環(huán)境污染且防治效果不理想。抗病品種的選育進(jìn)展緩慢，且在馬鈴薯種質(zhì)資源中未發(fā)現(xiàn)高抗品種。農(nóng)業(yè)防治可以輔助防病但不能從根本上控制該病害。生物防控可作為解決土傳病害的有效途徑，木霉菌（Trichoderma spp.）作為一種生物防治植物病害的有益真菌，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)實(shí)踐中起到了顯著的作用和效果，開始被人們廣泛討論[10-12]。目前利用木霉菌防治作物病害的報(bào)道中，對于防治馬鈴薯黑痣病菌的報(bào)道很少，同時(shí)木霉菌種類很多，不同種之間以及同種的不同菌株之間對病菌的抑制作用存在明顯差異[13-14]。篩選對馬鈴薯黑痣病菌有較強(qiáng)抑制作用的木霉菌株，將對馬鈴薯黑痣病的生物防控具有重要意義。研究旨在研究不同木霉菌對黑痣病菌的拮抗作用，篩選出對黑痣病菌抑制效果好的木霉菌，從而為馬鈴薯黑痣病的防治和木霉菌劑的研發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

病原菌菌株：馬鈴薯黑痣病菌-立枯絲核菌（Rhizoctonia solani），黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)植物病理研究室保存。

木霉菌株：木霉菌（Trichoderma spp.）由黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)植物病理研究室保存，供試菌株共17株，分別為棘孢木霉（Trichoderma asperellum）、黑綠木霉（T.atroviride）、交織木霉（T.intricatum）、鉤狀木霉（T.hamatum）、哈茨木霉（T.harzianum）1、哈茨木霉（T.harzianum）22、綠色木霉（T.viride）1、綠色木霉（T.viride）2、綠色木霉（T.viride）3、長枝木霉（T.longibrachiatum）1、長枝木霉（T.longibrachiatum）2、長枝木霉（T.longibrachiatum）38、長枝木霉（T.longibrachiatum）115、擬康寧木霉（T.pseudokoningii）1、擬康寧木霉（T.pseudokoningii）19、擬 康 寧 木 霉（T.pseudokoningii）20、擬康寧木霉（T.pseudokoningii）78。

1.2 試驗(yàn)儀器

主要儀器：MLS-3781L-PC立式壓力蒸汽滅菌器、SPX-400智能生化培養(yǎng)箱、Olympus BX60多功能顯微鏡、KXV-1210全溫水平搖床。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 不同木霉菌菌絲生長速度的測定

在90 mm的培養(yǎng)皿底部的背面畫上“十”字，將在PDA平板上活化培養(yǎng)3 d的17株木霉菌菌碟（φ6 mm）接種在PDA培養(yǎng)基上，每個(gè)處理4次重復(fù)，28℃恒溫培養(yǎng)48 h后用十字交叉法測量菌落的直徑[15]。

1.3.2 不同木霉菌產(chǎn)孢量的測定

將直徑為6 mm的木霉菌碟接種在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)5 d。5 d后向培養(yǎng)的木霉菌株中加入10 mL無菌水反復(fù)沖洗，將洗下的孢子懸浮液置于試管中依次稀釋，用血球計(jì)數(shù)板于顯微鏡下觀察進(jìn)行孢子計(jì)數(shù)，每個(gè)處理4次重復(fù)[16]。

1.3.3 不同木霉菌與立枯絲核菌空間競爭能力測定

采用對峙培養(yǎng)法[17]，在90 mm的PDA平板兩端，取直線距離為60 mm的上下兩點(diǎn)，分別接種培養(yǎng)3 d的立枯絲核菌和木霉菌菌碟，以只接立枯絲核菌放置于培養(yǎng)皿上點(diǎn)作對照，于28℃下恒溫對峙培養(yǎng)，每個(gè)處理4次重復(fù)，待木霉菌與立枯絲核菌接觸后計(jì)算木霉菌對立枯絲核菌菌絲生長抑制率（%）。對峙抑制率（%）=（對照菌落半徑－處理菌落半徑）/對照菌落半徑×100。

培養(yǎng)7 d后，采用拮抗指數(shù)評價(jià)競爭作用強(qiáng)弱。拮抗指數(shù)分級標(biāo)準(zhǔn)為：Ⅰ級，木霉菌絲占據(jù)平皿100%；Ⅱ級，木霉菌絲占據(jù)平皿＞2/3；Ⅲ級，木霉菌絲占據(jù)平皿＞1/3，＜2/3；Ⅳ級，木霉菌絲占據(jù)平皿＜1/3；Ⅴ級，病原菌占據(jù)平皿100%。

1.3.4 不同木霉菌對立枯絲核菌重寄生作用

在無菌載玻片上涂抹l mm厚的PDA培養(yǎng)基，再將4 mm×4 mm立枯絲核菌和木霉菌的菌塊接種在載玻片兩端，相距2 cm，每個(gè)處理4次重復(fù)，28℃恒溫培養(yǎng)24～36 h，待木霉菌與立枯絲核菌菌絲接觸后用光學(xué)顯微觀察并拍照記錄。

1.3.5 不同木霉菌固體培養(yǎng)揮發(fā)性代謝物對病菌抑制作用

（1）木霉菌易揮發(fā)代謝物對立枯絲核菌的拮抗作用

采用對扣培養(yǎng)法測定[18]。將木霉菌接種在PDA培養(yǎng)基上28℃恒溫培養(yǎng)2 d，并用無菌的雙層賽璐玢膜蓋在其上方，接著用剛接過立枯絲核菌的培養(yǎng)基倒扣在賽璐玢膜上，用封口膜進(jìn)行密封。把病原菌倒扣于未接種過木霉菌的PDA上作為對照，每個(gè)處理4次重復(fù)。28℃恒溫培養(yǎng)48 h，測量立枯絲核菌菌落直徑，并計(jì)算木霉菌揮發(fā)代謝物對立枯絲核菌的抑制效果。菌絲生長抑制率（%）=（對照菌落直徑－處理菌落直徑）/對照菌落直徑×100。

（2）木霉菌難揮發(fā)代謝物對立枯絲核菌的拮抗作用

采用圓盤濾膜法測定[19]。將賽璐玢膜平鋪在PDA平板上，其上接種木霉菌碟，28℃恒溫培養(yǎng)2 d后移去賽璐玢膜，其后接種活化3 d的病原菌菌碟，以只接種立枯絲核菌菌碟作對照。每個(gè)處理4次重復(fù)，28℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。48 h后測量菌落直徑，計(jì)算菌絲生長抑制率。計(jì)算方法同上。

1.3.6 不同木霉菌液體發(fā)酵濾液對立枯絲核菌的抑制作用

在100 mL PD培養(yǎng)液中接入10個(gè)直徑6 mm的木霉菌碟，28℃、150 r·min-1恒溫黑暗震蕩培養(yǎng)7 d后，用直徑0.22μm的無菌過濾器過濾除菌，獲得無菌發(fā)酵濾液[20]。分別將10 mL和30 mL的濾液與無菌PDA混合至100 mL，制成含有10%和30%發(fā)酵液PDA平板。將立枯絲核菌菌碟接種于發(fā)酵液PDA平板上，28℃恒溫培養(yǎng)，以分別混合等量無菌水的PDA平板上接病原菌作對照，每個(gè)處理4次重復(fù)。接菌后72 h測定菌落直徑并計(jì)算抑制率，計(jì)算方法同上。

1.3.7 木霉菌劑對馬鈴薯黑痣病的盆栽防治作用

木霉菌劑制備[21]：擬康寧木霉78的菌液與無菌發(fā)酵基質(zhì)（麥麩）以1∶4（V/W）的比例均勻混合在無菌磁盤上，于28℃恒溫培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)5~6 d，待木霉長滿磁盤后放置于室溫下晾曬2~3 d，曬干后于粉碎機(jī)中打碎制成木霉菌劑備用。盆栽試驗(yàn)共設(shè)置5個(gè)處理：（1）空白對照；（2）0.6%發(fā)酵基質(zhì)：0.6 kg發(fā)酵基質(zhì)與100.0 kg薯塊充分混拌；（3）0.6%木霉菌劑：0.6 kg木霉菌劑與100.0 kg薯塊充分混拌；（4）1.0%木霉菌劑：1.0 kg木霉菌劑與100.0 kg薯塊充分混拌；（5）1.0%復(fù)合菌劑：1.0 kg復(fù)合菌劑（木霉菌劑：腐殖酸=3∶2）與100.0 kg薯塊充分混拌。立枯絲核菌液以1.0%的施用量（V/W）均勻拌入盆栽土中，每盆種植4株馬鈴薯，每個(gè)處理15個(gè)重復(fù)。種植30 d后調(diào)查黑痣病發(fā)生情況。

馬鈴薯黑痣病的分級標(biāo)準(zhǔn)采用Weinhold[22]的方法，發(fā)病率、病情指數(shù)和防治效果按下式計(jì)算。發(fā)病率（%）=（發(fā)病株數(shù)/調(diào)查總株數(shù)）×100；病情指數(shù)=[∑（發(fā)病株數(shù)×發(fā)病級別）/（調(diào)查總株數(shù)×5）]×100；防治效果（%）=（空白對照病情指數(shù)-處理病情指數(shù)）/空白對照病情指數(shù)×100。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同木霉菌菌絲生長速度與產(chǎn)孢能力

17株供試木霉菌生長速率差異顯著，其中長枝木霉115的菌絲生長速率最快，菌落直徑為76 mm。不同木霉菌株產(chǎn)孢量差異非常明顯，其中棘孢木霉、綠色木霉3、擬康寧木霉78和哈茨木霉22的產(chǎn)孢量最大，分別為3.68×109、2.88×109、2.20×109·mL-1和1.58×109·mL-1。同種木霉菌的不同菌株菌絲生長速率相近，但產(chǎn)孢量差異較大。如擬康寧木霉19和擬康寧木霉20，培養(yǎng)2 d的菌落直徑分別為69、67 mm，產(chǎn)孢量分別為5.65×107、4.37×105·mL-1（表1）。

表1 不同木霉菌株生長速率和產(chǎn)孢能力Table 1 Effects of growth rate and sporulation quantity of different Trichoderma spp.

2.2 不同木霉菌與立枯絲核菌空間競爭能力

平板對峙試驗(yàn)顯示，17株木霉菌對立枯絲核菌均有明顯抑制作用（表2）。其中交織木霉、長枝木霉2和綠色木霉2對立枯絲核菌的抑制率最高，均達(dá)到74.0%以上。拮抗指數(shù)表明，擬康寧木霉78、哈茨木霉22、擬康寧木霉19、長枝木霉38、棘孢木霉的拮抗能力最強(qiáng)，拮抗指數(shù)均為Ⅰ。與對照的立枯絲核菌菌落相比，隨著木霉菌的生長，立枯絲核菌菌絲生長速度開始變慢，與木霉菌接觸后菌落顏色變淺，菌絲開始被消解變得稀疏，說明木霉通過空間和營養(yǎng)競爭可以抑制立枯絲核菌生長（圖1）。

表2 平板對峙木霉菌對立枯絲核菌的抑制作用Table 2 Inhibition effect of Trichoderma spp.on R.solani by Plate confrontation cultivate

圖1 不同木霉菌對立枯絲核菌的平板對峙Fig.1 Plate confrontation of different Trichoderma spp.on R.solani

2.3 不同木霉菌對立枯絲核菌的重寄生作用

對生長速率快、產(chǎn)孢量高及平板對峙抑制效果好的8株木霉菌進(jìn)行重寄生顯微觀察發(fā)現(xiàn)，8株木霉菌對立枯絲核菌均有重寄生現(xiàn)象（圖2b~2i）。木霉菌在接觸到病原菌的時(shí)候，其菌絲開始分化出更多的菌絲分支并纏繞在病菌的菌絲體上，隨著時(shí)間的觀察，立枯絲核菌被纏繞的部分菌絲收縮，變形和斷裂，供試的8株木霉菌株在與病原菌的對峙培養(yǎng)中均觀察到木霉菌絲盤旋環(huán)繞在絲核菌上。

圖2 不同木霉菌對立枯絲核菌的重寄生作用Fig.2 Parasitism action of different Trichoderma spp.on R.solani

2.4 固體培養(yǎng)不同木霉菌的代謝物對立枯絲核菌的抑制作用

同種木霉菌易揮發(fā)性代謝物對病原菌的抑制效果明顯不同（表3），其中長枝木霉115產(chǎn)生的揮發(fā)性代謝物質(zhì)對病原菌的抑制率最高為53.4%，與長枝木霉2（抑制率為37.5%）差異顯著，其他木霉菌株對病原菌的抑制率差異不明顯。8株木霉菌產(chǎn)生的難揮發(fā)性代謝物對病原菌的抑制作用較強(qiáng)，抑制率均高于80%。其中綠色木霉2與長枝木霉38菌株的抑菌率最高，達(dá)到100.0%，其次為擬康寧木霉78，抑制率為90.8%，與其他木霉菌株差異顯著。

表3 固體培養(yǎng)不同木霉菌揮發(fā)性代謝物對立枯絲核菌的抑制作用Table 3 Inhibition of different volatile metabolites of Trichoderma spp.in solid culture on R.solani

2.5 不同木霉菌液體發(fā)酵濾液對立枯絲核菌的抑制作用

由表4可知，不同木霉菌發(fā)酵濾液對立枯絲核菌均有抑制作用。PDA平板含木霉菌發(fā)酵濾液濃度為10%時(shí)，抑制率較低，其中對立枯絲核菌菌絲的抑制效果最好的是擬康寧木霉78的發(fā)酵濾液，抑制率高達(dá)65.9%。PDA平板含木霉菌發(fā)酵濾液濃度為30%時(shí)，其代謝物對病原菌的生長產(chǎn)生明顯的抑制作用，供試的8株木霉菌對病原菌的抑制率為64.3%～92.9%，其中，擬康寧木霉78對病原菌的抑制率高達(dá)92.9%，和其他7株木霉菌有顯著差異，其次，對病菌抑制效果較好的木霉菌株是長枝木霉38、長枝木霉115和擬康寧木霉19，抑制率為81.0%～88.1%。

表4 不同木霉菌發(fā)酵濾液對立枯絲核菌的抑制作用Table 4 Inhibition effect of different Trichoderma spp.fermentation filtrates on R.solani

2.6 木霉菌劑對馬鈴薯黑痣病的盆栽防治效果

木霉菌劑對馬鈴薯黑痣病的盆栽防治試驗(yàn)結(jié)果表明，施加木霉菌劑的不同處理能在一定程度上控制馬鈴薯黑痣病的發(fā)生（表5）。0.6%發(fā)酵基質(zhì)的發(fā)病情況較空白對照差異不明顯，說明施入的基質(zhì)量對病害發(fā)生的影響不大。隨著木霉菌劑劑量增加，對馬鈴薯黑痣病的防效逐漸增強(qiáng)，0.6%木霉菌劑和1.0%木霉菌劑的防效分別為59.07%和67.38%。1.0%復(fù)合菌劑防病效果最強(qiáng)，防效為70.11%，顯著高于單施木霉菌劑，說明木霉菌劑與腐殖酸混合更能降低黑痣病的發(fā)生程度。

表5 木霉菌對馬鈴薯黑痣病的盆栽防治效果Table 5 The pot control effects of Trichoderma on potato black scurf disease

3 討論

木霉菌對絲核菌的拮抗機(jī)制存在多種形式，不同木霉菌種之間對病菌的抑制作用存在明顯差異。在前期研究中發(fā)現(xiàn)，同種木霉菌菌絲生長速率相近，但不同菌株之間產(chǎn)孢量卻產(chǎn)生較大差異。同時(shí)也發(fā)現(xiàn)哈茨木霉22、擬康寧木霉78、長枝木霉38、棘孢木霉、擬康寧木霉19與立枯絲核菌的對峙試驗(yàn)中表現(xiàn)出較強(qiáng)的空間競爭能力與營養(yǎng)奪取力，既抑制立枯絲核菌在同一條件下的生長速率，又進(jìn)一步在立枯絲核菌菌落上增加了木霉菌菌落面積，導(dǎo)致病原菌菌落緩慢消失。木霉菌對立枯絲核菌重寄生下的顯微觀察，所有的木霉菌菌絲都能以盤旋環(huán)繞的方式在立枯絲核菌菌絲上，并在病原菌菌絲上產(chǎn)生小的分支菌絲再次進(jìn)行纏繞，推測這些細(xì)小分支可能侵入病原菌菌絲內(nèi)部，從而導(dǎo)致病原菌菌絲的變形，斷裂，至其最終解體死亡，與田連生等[23]研究認(rèn)為木霉菌對草莓灰霉菌的拮抗主要依靠競爭作用和重寄生作用的機(jī)理一致。通過固體平板培養(yǎng)，8株木霉菌產(chǎn)生的易揮發(fā)代謝物對病原菌的抑制率較低，而木霉菌產(chǎn)生的難揮發(fā)代謝物對病菌有較強(qiáng)抑制作用，說明木霉菌對病菌的抗生物質(zhì)主要是一些難揮發(fā)代謝物質(zhì)。用木霉菌液體發(fā)酵濾液進(jìn)行抗生拮抗作用試驗(yàn)，結(jié)果表明，8株木霉菌對立枯絲核菌均有較強(qiáng)的抑制作用，進(jìn)一步證明了抗生作用是木霉菌對病原

菌的重要抑制作用之一。盆栽試驗(yàn)結(jié)果證明，擬康寧木霉78能有效防治馬鈴薯黑痣病，其中，復(fù)合木霉菌劑較單施木霉菌劑防病效果好，可能腐殖酸能激發(fā)其生防潛能或提高植株的抗病性，其機(jī)理有待于進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

木霉菌可以通過競爭、重寄生和抗生作用抑制馬鈴薯黑痣病菌。不同木霉菌株在各種拮抗機(jī)制中對病菌表現(xiàn)拮抗作用強(qiáng)弱不完全一致，根據(jù)生長速度、產(chǎn)孢量及對病菌的拮抗作用綜合分析確定擬康寧木霉78對馬鈴薯黑痣病菌的拮抗作用最好。其菌劑盆栽防效為59.07%～70.11%。研究為開發(fā)木霉菌劑對馬鈴薯黑痣病的防治奠定了基礎(chǔ)。