宏基因二代測序在肺部感染中的應用及優(yōu)化

馮玲，熊佳麗，高燕，易榮，陳雀飛，劉毅

(中南大學湘雅醫(yī)學院附屬株洲醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學科，湖南 株洲 412007)

肺部感染是指由各類病原體引起的終末氣道、肺泡和肺間質(zhì)感染，常表現(xiàn)為咳嗽、咳痰、發(fā)熱、氣促等，是發(fā)病率及病死率均較高的一種感染性疾病[1-2]。隨著臨床癌癥治療、器官移植中免疫抑制劑的使用以及艾滋病等所致免疫受損患者的增多，肺部感染人群也有增高趨勢。早期精準的抗病原學治療，可幫助醫(yī)師及時優(yōu)化抗菌及抗病毒藥物的使用，提高用藥的有效性，改善患者的預后。而傳統(tǒng)微生物檢測方法(培養(yǎng)、涂片等)難以滿足目前的臨床需求，尤其在處理復雜病原體感染時，存在周期長、準確性有限等缺點，導致診斷延遲或疏漏等[3]。近年來，宏基因二代測序(metagenomic next-generation sequencing，mNGS)技術(shù)為肺部感染的病原學診治提供了新視角。mNGS可直接將提取標本中的全部核酸片段進行檢測，再經(jīng)生物信息學分析鑒定出標本中所含核酸的種類，獲得病原體的序列數(shù)、覆蓋度等定量分析數(shù)據(jù)。與傳統(tǒng)檢測方法相比，mNGS無需培養(yǎng)，病原覆蓋度廣、靈敏度高，且利于發(fā)現(xiàn)新的病原體[3-4]。mNGS快速識別病原體的能力，可幫助臨床醫(yī)師及時調(diào)整治療方案，提高疾病治愈率，降低病死率?，F(xiàn)就mNGS在肺部感染中的應用及優(yōu)化予以綜述。

1 mNGS在肺部感染中的應用

1.1細菌及真菌感染 細菌是常見的肺部感染病原體之一。研究表明，與培養(yǎng)法相比，利用mNGS檢測常見菌的敏感性無顯著優(yōu)勢，但檢測厭氧菌、真菌等的陽性率卻相對較高，且受前期使用抗生素的影響較小[4-5]。mNGS可用于罕見社區(qū)性獲得性肺炎病原體的早期鑒定，而鮑曼不動桿菌是醫(yī)院獲得性肺炎的常見菌，在社區(qū)獲得性肺炎中少見。Xu等[6]對收治的1例嚴重的社區(qū)獲得性肺炎患者的血及痰標本進行mNGS檢測，快速鑒定為鮑曼不動桿菌感染，這是第1例在mNGS的協(xié)助下及時診治的社區(qū)獲得性鮑曼不動桿菌肺炎。mNGS也可用于混合性肺部感染患者的病原學診斷。Wang等[7]對比了mNGS與常規(guī)檢測方法在混合性肺部感染中對病原體的診斷性能發(fā)現(xiàn)，mNGS檢測混合性肺部感染病原體的陽性率顯著高于常規(guī)檢測方法，尤其可提高對真菌的診斷水平，但其特異度相對較低。同時，mNGS還可以幫助醫(yī)師了解不同人群肺部微生物的分布，便于更精準地識別病菌。Zinter等[8]對41份來自免疫低下人群的下呼吸道樣本進行mNGS檢測，首次評估了該類人群肺部微生物群的分布，并對比同一樣本及不同樣本間微生物的差異，結(jié)果在45.8%的臨床檢測陰性標本中識別出了潛在的病原體。隨著抗生素使用的增加，病菌對抗生素耐藥也成為肺部感染治療中的難題。而mNGS可對病菌的基因組進行測序，評估耐藥基因的多樣性及抗性，進而發(fā)現(xiàn)新的耐藥靶點，且無需將單個菌群分離出來培養(yǎng)再檢測，對耐藥菌群后期新抗生素的研發(fā)具有重要的指導意義[9-10]。在臨床實踐中，細菌及真菌培養(yǎng)仍是公認的診斷金標準，但某些病菌培養(yǎng)的陽性率較低且容易遺漏。除了在識別常見菌方面無顯著優(yōu)勢外，mNGS在識別其他病菌(真菌、厭氧菌及一些潛在病原體等)、診斷混合性肺部感染以及尋找經(jīng)驗性抗菌治療欠敏感患者的致病病原體方面均有較好的應用價值。

1.2病毒感染 病毒性肺炎好發(fā)于冬、春季，可爆發(fā)或散發(fā)流行，除了常見癥狀外，嚴重者(傳染性非典型肺炎、中東呼吸綜合征以及新型冠狀病毒性肺炎等)還會累及全身多個系統(tǒng)，甚至危及生命。因此，對于病毒性肺炎患者，快速、準確地進行診斷、監(jiān)測是治療和疾病控制的關(guān)鍵。目前，臨床常用的識別病毒的檢測手段大多針對已知、常見病毒，難以有效、快速地識別變異和未知的病毒。而mNGS對呼吸道病毒具有較高的靈敏度[11]，可快速檢測出已知及未知病毒。Chen等[12]利用mNGS在2例新型冠狀病毒性肺炎患者的肺泡灌洗液標本中發(fā)現(xiàn)了同一種新的高豐度病原體(β-冠狀病毒屬)，為后期治療提供了有力的病原學依據(jù)。mNGS同樣有助于病毒共感染的鑒定，Li等[13]利用mNGS在1例患有急性呼吸窘迫綜合征的成年女性中發(fā)現(xiàn)了鼻病毒和博卡病毒共感染，這兩種病毒多見于兒童重癥肺炎，在成人中少見。mNGS也可用于尋找病毒的起源和自然宿主，從根源處深入了解病毒的特性，預測病毒在人體的潛在致病力[14-15]；還可通過檢測完整的病毒基因組實現(xiàn)毒株分型，同時監(jiān)測病毒基因進化[16-18]，為新治療方案的制訂及疫苗的研制提供參考。另外，mNGS還可為院內(nèi)感染的實時預防提供信息。Greninger等[19]利用mNGS在13例感染了人副流感病毒3型患者的樣本中得到了人副流感病毒3型的全基因組序列，并通過分析短期內(nèi)連續(xù)發(fā)生的3例醫(yī)院獲得性人副流感病毒3型感染患者的mNGS結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其中2例的序列是一致的，考慮為同一來源，提醒醫(yī)務人員潛在院內(nèi)病原的傳播，也為早期干預提供了理論依據(jù)。同時，mNGS識別病原體來源的能力也可被用于排除醫(yī)院獲得性感染傳播的可能[20]?？梢姡琺NGS不僅能識別新的病毒，還能進行致病力的評估，利于病毒性肺炎的實時監(jiān)測及預防，在未來新病原體的發(fā)現(xiàn)、診斷、分型等方面均具有巨大潛力。

1.3特殊病原體感染 肺結(jié)核是常見的傳染性疾病，嚴重危害人類健康。結(jié)核病的精準診斷是疾病控制的重要條件，但常規(guī)痰檢陽性率較低，往往無法明確診斷為肺結(jié)核。而mNGS的出現(xiàn)為結(jié)核分枝桿菌診斷提供了新途徑。Zhou等[21]對菌體培養(yǎng)、結(jié)核分枝桿菌/利福平耐藥試驗、mNGS以及mNGS聯(lián)合結(jié)核分枝桿菌/利福平耐藥試驗檢測結(jié)核分枝桿菌的靈敏度進行比較發(fā)現(xiàn)，mNGS與結(jié)核分枝桿菌/利福平耐藥試驗的檢測效果相當，均較菌體培養(yǎng)好，且mNGS聯(lián)合結(jié)核分枝桿菌/利福平耐藥試驗檢測的靈敏感度更高，但由于結(jié)核分枝桿菌與其他分枝桿菌屬基因組具有一定相似性，mNGS難以完全鑒別，且檢測效率受前期抗結(jié)核治療的影響，陽性率僅為44%。肺孢子蟲肺炎通常發(fā)生于免疫缺陷患者，是一種嚴重的機會性感染，由于肺孢子菌負荷量低，使用普通方法檢測容易漏診。Zhang等[22]研究發(fā)現(xiàn)，與傳統(tǒng)檢測方法相比，mNGS具有更高的肺孢子蟲肺炎檢出率。另外，周燕琳和陳亞娟[23]在多種檢測手段均未明確病原體的情況下，使用mNGS對1例腎移植術(shù)后的重癥肺炎患者進行檢測，快速診斷出卡氏肺孢子菌肺炎，為后續(xù)調(diào)整治療方案提供了依據(jù)?？梢?，mNGS作為一種有效的診斷方法，可用于免疫缺陷患者。

2 mNGS的局限性

雖然mNGS在肺部感染中應用廣泛，但實際應用中仍存在許多局限性。①mNGS易受外源污染干擾，加之呼吸道定植菌的影響，最終影響結(jié)果的精準判讀[24]。②mNGS具有較高的靈敏度，但特異度相對較低[25]。③高豐度的宿主背景核酸限制了mNGS病原體檢測的總體靈敏度[26]，尤其當患者病程中產(chǎn)生強大的免疫反應時，樣本中高濃度的炎癥細胞會進一步使病原體序列數(shù)相對減少[3,27]，影響檢測效果。④mNGS對RNA病毒的檢測效果較DNA病毒差，一方面由于RNA易降解，另一方面由于DNA病毒可以直接檢測，而RNA病毒需逆轉(zhuǎn)錄成互補DNA才能進行測序[3，28]。⑤mNGS對于有細胞壁保護的病原體(厚壁真菌、結(jié)核菌等)檢測效率總體不高，需要加用破壞細胞壁的試劑才能使該類病原體的核酸完全釋放出來[29]。⑥目前對mNGS結(jié)果的判讀尚缺乏公認的標準，數(shù)據(jù)庫也還需進一步完善(尤其針對未知病原體及新型耐藥基因)。⑦mNGS的價格較傳統(tǒng)檢測方法高，對于病情反復的患者，難以實現(xiàn)多次檢測。雖然mNGS檢測病原體的靈敏度較高，但目前還不能完全取代傳統(tǒng)檢測方法，其臨床應用也還需進一步優(yōu)化。

3 mNGS的優(yōu)化應用

3.1患病人群的選擇 對于常見病原體感染、臨床及影像學表現(xiàn)典型、有特定懷疑病原體的肺部感染患者，傳統(tǒng)的微生物檢測技術(shù)(培養(yǎng)、涂片等)相對更經(jīng)濟、實用，且能實現(xiàn)多次復檢的需求；而對于臨床病癥及影像學表現(xiàn)復雜、現(xiàn)有技術(shù)無法明確、罕見或不典型病原體感染、混合性感染可能性大、對標準化抗菌治療無效且原因未明或危重癥患者需盡早明確病原體的患病人群，mNGS的優(yōu)勢更顯著[30-32]，針對這部分人群可以優(yōu)先考慮使用mNGS。

3.2標本的選擇 與傳統(tǒng)檢測方法相比，mNGS價格較高，難以實現(xiàn)多次、多處標本的送檢，因此有必要針對性送檢。臨床常用的呼吸道樣本包括痰液、肺泡灌洗液、血液、胸腔積液等，其各有優(yōu)缺點，應根據(jù)實際情況取材。痰液標本取材簡單，但存在口咽菌群污染的可能，對深部肺部感染的代表性差，容易出現(xiàn)假陽性，特異性不及肺泡灌洗液。肺泡灌洗液多用于診斷深部肺部感染，靈敏度和特異度均較高，且與痰液標本相比，肺泡灌洗液受定植菌的影響較小，但其為侵入性檢測手段。血液標本采集方便，臨床上常用于膿毒血癥、菌血癥患者，但當局部感染發(fā)生在富含血液的組織(如肺)或為侵襲性感染(如侵襲性真菌病)時，病原體或其分解片段很有可能進入循環(huán)系統(tǒng)。血液標本避免了呼吸道定植菌的干擾，且較支氣管鏡的侵入性小，對于無法配合支氣管鏡檢查的患者，也可以考慮血液標本檢測[33]。另外，血漿游離DNA在感染性疾病的診斷以及療效評估等方面也具有潛在價值[34]。Langelier等[35]指出，雖然血漿標本代表性不及呼吸道標本，但在無法獲得呼吸道樣本的情況下，血漿mNGS也可能對肺部感染患者的病原體有診斷價值。胸腔積液適用于肺部感染合并胸腔積液形成的患者，標本污染概率相對較小，但其適用范圍小。因此，對于臨床需要mNGS幫助明確病原體以及對支氣管鏡檢查無明顯禁忌的患者，可選擇肺泡灌洗液-mNGS檢測，對于無法配合支氣管鏡檢查的患者，也可選血液標本或痰液標本，但這兩種標本mNGS結(jié)果的解釋，應綜合多重因素慎重考慮。

3.3標本的處理 在標本的采集及處理過程中，首先要嚴格控制污染，其次是標本的預處理。預處理能有效去除宿主核酸或富集病原體核酸，提高檢測陽性率。臨床采集的標本經(jīng)濾過及離心后，病原體的陽性率有所提高，但大分子病原體的陽性率可能會降低；用核酸酶降低人類背景核酸量，也能使病原體序列數(shù)相對增加[36]。同時，Hasan等[26]研究指出，與單用核酸酶相比，使用核酸酶前用皂苷進行預處理可使更多的人類DNA被降解，且對病原體核酸的影響較小，能有效提高檢測的靈敏度和結(jié)果判讀的精準性。除使用核酸酶外，也可基于成簇的規(guī)律間隔的短回文重復序列去除不需要的高豐度宿主序列[37]。對于低滴度病毒(尤其RNA病毒)感染，還可通過病毒純化、病毒基因組擴增或捕獲探針富集等方法增加病原體核酸量，但其價格昂貴且過程復雜，不適用于所有樣本的處理。Deng等[38]開發(fā)了一種相對簡單、成本低且快速的檢測方法，即宏基因組加標引物擴增技術(shù)，該技術(shù)靶向富集RNA病毒序列，同時保留了其他病原檢測的敏感性，且較聚合酶鏈反應及捕獲探針富集技術(shù)的偏向性及交叉污染的發(fā)生率低，但宏基因加標引物擴增技術(shù)在DNA病毒及其他病原體中的應用仍待進一步研究。在mNGS處理過程中需進行系統(tǒng)工作流程評估及質(zhì)量控制，Bal等[39]在mNGS中引入了3個質(zhì)量控制流程，即無模板對照、內(nèi)部質(zhì)量控制和外部質(zhì)量控制，其中無模板對照用于評估過程中存在的污染問題，內(nèi)部質(zhì)量控制及外部質(zhì)量控制用來檢測試劑、設(shè)備的完整性以及抑制劑的存在，這種優(yōu)化的流程可增加結(jié)果的可信度和代表性。

3.4數(shù)據(jù)分析 精準區(qū)分病原體、定植菌和污染是目前mNGS數(shù)據(jù)分析較為棘手的問題。即便是目前最優(yōu)化的mNGS操作流程，也難以實現(xiàn)理想的無污染。Davis等[40]提出了一種直接判斷mNGS中污染的方法，即當微生物測序數(shù)量與樣品總輸入量成反比時，提示可能存在污染；Zinter等[41]在此基礎(chǔ)上進行了優(yōu)化，通過評估每個樣本的學生化殘差，對樣本中存在污染物的程度進行一個量化的概率評估，幫助將污染與真實樣本成分區(qū)分開。Langelier等[25,42]研究表明，在免疫抑制患者中，宿主的免疫反應指標被視為活動性感染的標志物，肺部微生物群改變也能在一定程度上反映肺部感染，結(jié)合病原體、呼吸道微生物組和宿主免疫基因表達指標綜合分析，使臨床確診感染但傳統(tǒng)檢測為陰性的患者獲得更準確的病原學診斷；同時他們還開發(fā)了一種互補算法，能夠幫助區(qū)分致病病原體及背景微生物群。臨床實踐中，需要將mNGS結(jié)果與臨床表現(xiàn)、其他實驗室檢查結(jié)果以及醫(yī)師的經(jīng)驗結(jié)合起來共同判斷，才能更有針對性地找出真正的病原體。

4 小 結(jié)

mNGS具有快速鑒定、無偏倚、靈敏度高的特點，在不同類型肺部感染的病原學診斷、指導治療、疾病的預防控制、耐藥基因的發(fā)現(xiàn)等方面均具有重要作用，是臨床病原學檢查的優(yōu)選方法之一。雖然mNGS前景可觀，但在臨床實際應用中仍存在一些問題。如何進一步提高mNGS的特異性、優(yōu)化標本的處理流程，以保證各種病原體的檢測質(zhì)量以及制訂統(tǒng)一的結(jié)果判讀標準等仍有待更深入的研究。因此，未來應開展相關(guān)實踐研究，充分發(fā)揮mNGS的優(yōu)勢，同時改善其不足，使mNGS在肺部感染中的臨床應用價值最大化。