口岸動(dòng)物疫病ELISA 檢測(cè)的影響因素分析及優(yōu)化方法探析

林萍萍 黃驊港海關(guān) 河北渤海新區(qū)黃驊港（河北，黃驊，061600）

近年來(lái)，隨著我國(guó)畜牧業(yè)的快速發(fā)展，改良品種、優(yōu)化牛類(lèi)種群遺傳性能的需求日益增加，境外引種就成了重要途徑，其促進(jìn)我國(guó)養(yǎng)殖業(yè)和經(jīng)濟(jì)貿(mào)易發(fā)展的同時(shí)，也增加了疫病傳入的風(fēng)險(xiǎn)［1-2］。 加強(qiáng)進(jìn)境種牛檢驗(yàn)檢疫和監(jiān)管已成口岸動(dòng)物檢疫面臨的重要課題， 實(shí)驗(yàn)室疫病檢疫發(fā)揮著重要的作用。酶聯(lián)免疫 （Enzyme-linked immunosorbnet assay，ELISA） 是把抗原抗體免疫反應(yīng)的特異性和酶的高效催化作用有機(jī)結(jié)合起來(lái)的一種檢測(cè)技術(shù)，原理是抗原或抗體吸附于固相載體進(jìn)行免疫酶反應(yīng)，經(jīng)底物顯色后用酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測(cè)，由于待測(cè)譜物的含量與呈色物質(zhì)的顏色具有相關(guān)性，因此可以通過(guò)顏色的不同來(lái)達(dá)到定性定量分析待測(cè)樣品的目的。 由于ELISA 方法具有操作簡(jiǎn)單、 靈敏度高和特異性高等特點(diǎn)，并且適合批量樣品檢測(cè)，因此廣泛應(yīng)用于口岸進(jìn)境種牛疫病檢測(cè)［3-6］。但實(shí)驗(yàn)室在實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程中因諸多因素影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，即會(huì)出現(xiàn)一些假陽(yáng)性或假陰性，因此，有必要深入分析其影響因素，并優(yōu)化方法、規(guī)范實(shí)驗(yàn)操作，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確有效，把好國(guó)門(mén)生物安全，也為動(dòng)物疫病檢測(cè)工作的開(kāi)展提供依據(jù)。 本文就種牛疫病ELISA 檢測(cè)的影響因素從“人、機(jī)、料、法、環(huán)”等多個(gè)方面進(jìn)行分析。

1 人的因素

實(shí)驗(yàn)室專(zhuān)業(yè)技術(shù)人員是開(kāi)展動(dòng)物疫病檢測(cè)的中心人員， 是影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性的重要因素，因此要求從事相關(guān)工作的實(shí)驗(yàn)室人員要求必須具備較強(qiáng)的專(zhuān)業(yè)知識(shí)和熟練的操作技能。 在種牛疫病ELISA 檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中， 血清樣品處理、 移液器使用不當(dāng)、酶標(biāo)洗板的徹底程度等都會(huì)對(duì)結(jié)果造成直接的影響。 為此，應(yīng)對(duì)實(shí)驗(yàn)人員定期組織開(kāi)展業(yè)務(wù)培訓(xùn)考核、能力驗(yàn)證和人員比對(duì)等，持續(xù)保證實(shí)驗(yàn)人員熟悉實(shí)驗(yàn)操作流程和儀器設(shè)備的操作能力，以便保質(zhì)保量地完成動(dòng)物疫病檢測(cè)工作。

2 機(jī)的因素

儀器設(shè)備的準(zhǔn)確度是進(jìn)行實(shí)驗(yàn)檢測(cè)最基本的要求，是影響檢測(cè)結(jié)果的直接因素之一。 不同廠(chǎng)家儀器設(shè)備存在檢測(cè)性能的差異，如洗板機(jī)，進(jìn)口的性能要高于國(guó)產(chǎn)，在洗板時(shí)洗出的徹底。 為了確保檢測(cè)結(jié)果真實(shí)有效，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)定期對(duì)檢測(cè)儀器進(jìn)行計(jì)量檢定、維護(hù)，使用前進(jìn)行校準(zhǔn)，確保儀器可以正常運(yùn)行。

3 料的因素

3.1 樣品因素

待檢樣品的質(zhì)量是確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性的重要因素，因此樣品要求新鮮和純凈。種牛疫病ELISA實(shí)驗(yàn)一般采用種牛血清進(jìn)行檢測(cè)。

3.1.1 樣品采集及送檢

在采集樣品時(shí)，應(yīng)使用無(wú)菌采集針管，盡量避免反復(fù)顛倒，嚴(yán)防樣品溶血的產(chǎn)生，因樣品的溶血血紅蛋白中含有類(lèi)過(guò)氧化物酶活性的亞鐵血紅素，在以辣根過(guò)氧化物酶（HRP）為標(biāo)記的ELISA 實(shí)驗(yàn)中，會(huì)增加非特異性顯色造成假陽(yáng)性結(jié)果的產(chǎn)生［7］，因此，應(yīng)盡量避免溶血，對(duì)于嚴(yán)重溶血樣品需重新采樣。 工作人員需要對(duì)采集的樣本進(jìn)行檢查，包括樣品質(zhì)量、數(shù)量、標(biāo)識(shí)、記錄等，避免出現(xiàn)樣品采集錯(cuò)誤。及時(shí)將樣品送往實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，血清樣品放置時(shí)間過(guò)長(zhǎng)， 易受細(xì)菌污染， 而細(xì)菌體內(nèi)可能有內(nèi)源性HRP，出現(xiàn)非特異性顯色，造成假陽(yáng)性結(jié)果的出現(xiàn)。

3.1.2 樣品處理

分離血清需要注意幾點(diǎn)問(wèn)題：分離血清時(shí)核對(duì)好樣品編號(hào)，樣品一式兩份，一份待檢樣品，一份留樣保存，血清可冷藏自然析出，也可離心析出，但需控制離心的速度和時(shí)間，過(guò)度離心會(huì)造成紅細(xì)胞破裂，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

3.1.3 樣品保存

如不能及時(shí)檢測(cè)， 應(yīng)將樣品冷藏或冷凍保存，盡量避免反復(fù)凍融，反復(fù)凍融會(huì)破壞樣品中的蛋白分子如抗體，造成假陰性結(jié)果的出現(xiàn)。 一般來(lái)說(shuō)，一周之內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)，將樣品存放在2-8 ℃即可，如因特殊原因需延時(shí)檢測(cè)， 可將樣品及時(shí)分裝后放置于-20 ℃或-80 ℃冷凍保存。

3.2 試劑因素

3.2.1 試劑盒的選擇

選擇合適的試劑盒是保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的關(guān)鍵因素。 目前口岸種牛疫病檢測(cè)常用進(jìn)口試劑盒如IDVET、BIOVET、kernel 等，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明不同廠(chǎng)家的試劑盒由于采用的方法（競(jìng)爭(zhēng)ELISA、阻斷ELISA、夾心ELISA 等）不同，檢測(cè)結(jié)果存在差異性。 因此選購(gòu)試劑盒時(shí)，需全面了解其技術(shù)參數(shù)、性能指標(biāo)，使用時(shí)注意試劑盒的有效期及保存溫度，如果保存不當(dāng)或使用過(guò)期試劑盒均會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。另外，同一廠(chǎng)家試劑盒不同批次之間不能混用， 因其制作過(guò)程很難保證質(zhì)量完全一致，容易造成結(jié)果差異現(xiàn)象。

3.2.2 試劑盒的回溫

在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)試劑的準(zhǔn)備考慮不周，經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)試劑盒從冰箱剛拿出來(lái)就開(kāi)始實(shí)驗(yàn)，會(huì)出現(xiàn)陽(yáng)性對(duì)照、洗滌液等試劑沒(méi)有化開(kāi)的現(xiàn)象，從而影響實(shí)驗(yàn)反應(yīng)時(shí)間，其直接后果會(huì)導(dǎo)致對(duì)一些弱陽(yáng)性樣品的檢測(cè)出現(xiàn)假陰性。 因此在ELISA 實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，最為關(guān)鍵的是將試劑盒提前從冰箱里拿出來(lái)，按說(shuō)明書(shū)要求在室溫放置30 min 至與室溫平衡，并避免陽(yáng)光直射，其目的是使微孔內(nèi)的溫度能較快地達(dá)到后面測(cè)定的需求溫度。

4 法的因素

檢測(cè)方法、標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范和質(zhì)量控制程序及其相關(guān)計(jì)劃是也是影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的直接因素之一。 檢測(cè)方法嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)和相關(guān)技術(shù)規(guī)范進(jìn)行選擇，種牛疫病ELISA 檢測(cè)時(shí)應(yīng)遵循標(biāo)準(zhǔn)選擇相適宜的試劑盒，并定期對(duì)檢測(cè)流程和標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行修訂，避免在檢測(cè)過(guò)程中使用已作廢的方法，從而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。 實(shí)驗(yàn)室的質(zhì)量控制及其相關(guān)計(jì)劃是監(jiān)控檢測(cè)過(guò)程最有效的手段，按計(jì)劃進(jìn)行實(shí)驗(yàn)人員比對(duì)、留樣再測(cè)、測(cè)量審核等質(zhì)量控制，確保檢測(cè)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，在此過(guò)程中如出現(xiàn)異常，及時(shí)找出原因，并提出改進(jìn)的相關(guān)措施。 適宜的檢測(cè)方法和標(biāo)準(zhǔn)能夠?yàn)閷?shí)驗(yàn)人員提供較好的理論基礎(chǔ)和技術(shù)指導(dǎo)。

5 環(huán)的因素

實(shí)驗(yàn)室的環(huán)境是影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的先決條件，即檢測(cè)過(guò)程所在的環(huán)境溫度、濕度及純潔度等，必須滿(mǎn)足國(guó)家相關(guān)的法律法規(guī)、技術(shù)規(guī)范或標(biāo)準(zhǔn)的要求［8］。室溫對(duì)ELISA 實(shí)驗(yàn)結(jié)果有影響，室溫偏低會(huì)對(duì)樣品和試劑產(chǎn)生影響，導(dǎo)致反應(yīng)速度慢，進(jìn)而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中所用的物品及周邊環(huán)境受到污染，也會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響。 對(duì)此，應(yīng)每周對(duì)實(shí)驗(yàn)室的溫濕度等相關(guān)記錄進(jìn)行查巡并實(shí)時(shí)記錄，定期對(duì)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行清潔消毒，保證實(shí)驗(yàn)室環(huán)境滿(mǎn)足實(shí)驗(yàn)要求，消除其對(duì)實(shí)驗(yàn)室結(jié)果帶來(lái)的影響。

6 實(shí)驗(yàn)關(guān)鍵環(huán)節(jié)的因素

6.1 加樣

加樣是影響ELISA 結(jié)果的最常見(jiàn)的因素，樣品稀釋?zhuān)瑖?yán)格按照不同試劑盒對(duì)樣品稀釋倍數(shù)的規(guī)定進(jìn)行操作，其目的是減少非特異性反應(yīng)，所以在檢測(cè)過(guò)程中一定是先加稀釋液再加樣品。 需要引起注意的是加樣后要在微量振蕩器上震蕩混勻30 s，防止溢出。

在種牛疫病ELISA 初篩實(shí)驗(yàn)中，由于檢測(cè)量比較大，一般采用多通道微量移液器，使用多通道微量移液器需要注意幾點(diǎn)：正確使用，使用前調(diào)整移液器的加樣量；加樣速度不可過(guò)快，否則無(wú)法保證微量加樣的準(zhǔn)確度和均一性；避免將樣品加到反應(yīng)孔壁上，因?yàn)榭妆谏喜渴欠前粎^(qū)，易導(dǎo)致非特異性吸附，造成假陽(yáng)性結(jié)果的出現(xiàn)；避免產(chǎn)生氣泡和濺出，氣泡會(huì)引起反應(yīng)界面差異，濺出會(huì)造成相鄰孔污染；避免槍頭碰觸到孔底部，并保持孔外底部潔凈，有利于酶標(biāo)儀檢測(cè)。 移液器長(zhǎng)時(shí)間使用會(huì)出現(xiàn)磨損， 或內(nèi)部附著血痂等原因造成加樣不準(zhǔn)確，因此有必要定期對(duì)移液器進(jìn)行維護(hù)和計(jì)量校準(zhǔn)。 此外，樣品較多時(shí)應(yīng)分批檢測(cè)，避免加樣后溫育前等待時(shí)間超時(shí)。

6.2 溫育

溫育是ELISA 檢測(cè)中最關(guān)鍵、也是最容易出現(xiàn)問(wèn)題的環(huán)節(jié)。 ELISA 實(shí)驗(yàn)中抗原抗體反應(yīng)必須保證一定時(shí)間的溫育，且溫育所需要的時(shí)間一般與溫度成反比。 種牛疫病檢測(cè)中最常用的溫度是37℃和室溫，溫度過(guò)高或溫育時(shí)間不夠，易造成弱陽(yáng)性樣品漏檢情況。 因此，在日常檢測(cè)過(guò)程中，要嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書(shū)控制溫育的時(shí)間和溫度，不能人為延長(zhǎng)或縮短溫育時(shí)間，應(yīng)根據(jù)不同的室溫條件及時(shí)調(diào)整溫箱的溫度， 在溫箱放置溫濕度計(jì)來(lái)測(cè)量觀(guān)察即可。溫育時(shí)，需在酶標(biāo)板表面貼粘膜，防止孔內(nèi)液體蒸發(fā)或水珠等異物掉入孔內(nèi)引起污染。 切記封板膜不能重復(fù)使用，以免引起交叉污染。

6.3 洗板

洗板是ELISA 實(shí)驗(yàn)中操作次數(shù)最多的重要環(huán)節(jié)，應(yīng)引起實(shí)驗(yàn)人員的重視。 洗板次數(shù)減少、洗板不徹底造成殘留，可能引起假陽(yáng)性結(jié)果的產(chǎn)生；洗板次數(shù)過(guò)多，可能會(huì)洗脫掉抗原抗體結(jié)合物，引起假陰性結(jié)果。 無(wú)論是手工洗板還是洗板機(jī)洗板，要嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)規(guī)定的洗滌次數(shù)、 洗滌體積、洗滌時(shí)間進(jìn)行操作，不能人為改變洗板要求。 在洗板的過(guò)程中，盡量保證操作標(biāo)準(zhǔn)，如避免洗板液過(guò)多溢出孔外，甩板要快速干凈，使用干凈的濾紙不在同一地方重復(fù)拍板等，操作的準(zhǔn)確與否直接影響檢測(cè)結(jié)果的重復(fù)性和準(zhǔn)確性。

7 結(jié)語(yǔ)

口岸進(jìn)境動(dòng)物檢驗(yàn)檢疫的核心任務(wù)就是防止危險(xiǎn)性疫病疫情傳入國(guó)內(nèi)，控制動(dòng)物疫病跨境傳播和擴(kuò)散［9］，保障我國(guó)養(yǎng)殖業(yè)生產(chǎn)安全、動(dòng)物生命和人民的身體健康，因此做好口岸動(dòng)物疫病檢驗(yàn)檢疫工作尤為重要。ELISA 自建立以來(lái)，由于其自身的優(yōu)勢(shì)被廣泛應(yīng)用于海關(guān)、獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室、科研單位等，但實(shí)驗(yàn)過(guò)程中有諸多因素影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，應(yīng)對(duì)其原因進(jìn)行深入分析，并及時(shí)進(jìn)行整改。 首先要保證實(shí)驗(yàn)室環(huán)境設(shè)施和儀器設(shè)備處于良好狀態(tài)；其次，實(shí)驗(yàn)涉及的試劑及檢測(cè)方法必須標(biāo)準(zhǔn)化，及時(shí)更新檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)和技術(shù)規(guī)范； 另外實(shí)驗(yàn)技術(shù)人員需定期培訓(xùn)，加強(qiáng)業(yè)務(wù)學(xué)習(xí)，提高專(zhuān)業(yè)技能，嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)室規(guī)章要求進(jìn)行樣品的檢測(cè)，在一次又一次的實(shí)踐中對(duì)這些關(guān)鍵環(huán)節(jié)進(jìn)行探索和優(yōu)化，認(rèn)真避免或減少影響因素， 盡量避免假陽(yáng)性和假陰性結(jié)果的出現(xiàn)，提升口岸動(dòng)物疫病的檢驗(yàn)檢疫技術(shù)水平，確保數(shù)據(jù)準(zhǔn)確可靠，從而保障國(guó)內(nèi)養(yǎng)殖業(yè)健康和可持續(xù)發(fā)展。